三七黑斑病病原菌的復核鑒定

黃宏強，范小燕，陶亞群，魯紅學，鄧建新

(長江大學農學院，湖北，荊州 434025)

三七黑斑病病原菌的復核鑒定

黃宏強，范小燕，陶亞群，魯紅學，鄧建新

(長江大學農學院，湖北，荊州 434025)

[摘要]利用單孢分離法，從云南文山三七(Panax notoginseng)葉片上分離獲得黑斑病病原鏈格孢菌。對所獲得的供試菌株進行形態學鑒定，同時利用ITS、Alt a1、gpd、BT2和RPB2等5個基因的序列進行系統發育分析研究。結果表明，三七黑斑病病原菌為Alternaria panacis Whetzel。

[關鍵詞]三七(Panax notoginseng)；鏈格孢菌；形態鑒定；系統發育分析

三七(Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen)又稱田七，是一種五加科(Araliaceae)名貴藥用植物，主產于我國云南。黑斑病是中國三七主產區的主要病害之一，危害植株的各個部分，受害葉片常形成圓形或不規則水浸狀褐色病斑，受害葉柄、莖稈產生黑褐色病斑，常造成落葉、干花、不能結實、植株折垂而枯死，一般發病率為25%～35%，嚴重時可達90%以上，導致減產[1～3]。基于形態學研究發現，所有已報道的五加科植物(包括三七、人參、西洋參、鵝掌柴、八角金盤、刺五加、黃漆木、遼東楤木等)黑斑病病原菌均為鏈格孢菌大孢子種人參鏈格孢(AltemariapanaxWhetzel)[4～6]。

人參鏈格孢的分生孢子形態容易受到培養基質、培養條件(溫度、濕度和光照等)及孢子成熟度影響而發生改變[7，8]，該菌分類鑒定僅依據孢子形態不是很可信的，必須綜合形態學、分子系統學、生物化學及生理學等相關信息來進行分析[9]。Deng等[10]對多種五加科植物的鏈格孢菌進行形態學及分子系統學比較研究后，發現五加科植物黑斑病病原鏈格孢菌存在3個種類：Alternariaaraliae、A.dendropanacis和A.panacis。但這些研究中并未包含分離自三七黑斑病的菌株。為此，本研究從形態學和分子系統學2個方面對三七黑斑病病原鏈格孢菌進行復核鑒定，旨在進一步明確其分類地位。

1材料與方法

1.1試驗材料1.1.1菌種來源

將2015年4月采自云南文山的新鮮三七黑斑病病葉保濕培養后，通過無菌玻璃針進行單孢分離，將分離獲得的菌種保存于長江大學植物病理實驗室，菌株編號為YZU 151074。

1.2.1培養基

馬鈴薯葡萄糖培養基(potato dextrose agar,PDA)：馬鈴薯葡萄糖湯粉(potato dextrose broth，Difco，美國)24g，瓊脂20g，水1000mL。

馬鈴薯胡蘿卜培養基(potato carrot agar,PCA)：馬鈴薯20g，胡蘿卜20g，瓊脂20g，水1000mL。

1.2試驗方法1.2.1形態觀察

菌落形態：從PDA培養基上培養3～5d的菌落邊緣取菌齡一致的菌餅(直徑6mm)，接種于含PDA培養基的90mm培養皿上，在無光照的條件下，置于25℃培養。培養7d后，觀察菌落形態、有無色素分泌，并測量菌落大小(直徑)。

孢子形態：將病原菌菌絲接種于PCA培養基中，在光照為8h/d、溫度為22℃的條件下培養[5]。培養7d后，觀察產孢方式、分生孢子形態，隨機測量50個分生孢子的大小。

1.2.2分子系統發育分析

從PDA培養基上培養5～7d的菌落上刮取菌絲團塊，冷凍干燥后，低溫保存備用。DNA的提取主要參考Park等[11]的方法。PCR擴增和測序所用引物為：ITS5和ITS4[12]、Bt2a和Bt2b[13]、gpd1和gpd2[14]、Alt a1-for和Alt a1-rev[15]、RPB2-6F和RPB2-7cR[16]，均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。利用體積為20μL的2×Taq預混PCR反應體系(Genstar，北京康潤誠業生物科技有限公司)，反應條件參考文獻[8]。擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠、0.5倍TBE的緩沖液進行電泳，利用新型核酸染料(GoldenView，北京博邁德基因技術有限公司)進行結果檢測，并對已擴增好的產物利用Cyle-Pure Kit(200)純化試劑盒(E.Z.N.A.，Omega Bio-tek，美國)進行純化。純化產物直接送到南京金斯瑞生物技術有限公司，用正反2個引物在ABI3730測序儀上進行測序。

利用正反兩向序列互補連接后的完整序列，在GenBank中進行同源序列查找，盡可能選擇模式菌株或權威菌株，確保所構建系統發育樹的可靠性。對所要分析的核苷酸序列輸入到Mega V5.03軟件后，應用ClustalW程序對單個基因序列進行校排(alignment)，隨后將構建系統發育樹的多個基因序列逐個進行連接合并，使每個菌株的多個基因序列形成一條核苷酸鏈。用Mega V5.03軟件中的ML(Maximum Likelihood)方法生成系統發育樹，對所構建的系統發育樹進行重復1000次的自舉分析(bootstrap)來估算分支的支持率，并將Stemphyliumlycopersici設為組外對照。

2結果與分析

2.1形態學

菌落形態：在PDA培養基上，生長7d的病原菌菌落呈圓形，平鋪，白色至淺灰色，菌絲質地柔和似棉花狀，菌落背面由邊緣淺灰色漸變至中間深褐色，菌落大小為52～56mm(圖1A)。

圖1　三七黑斑病病原菌在PDA培養基上的菌落特征(A)和在PCA培養基上的產孢方式、分生孢子梗及分生孢子形態(B)

孢子形態：在PCA培養基上，培養7d后，分生孢子梗單生，直立或略彎曲，褐色，長度變化大，一般為15～50μm×5～7μm，有0～3個橫隔。分生孢子單生或串生(常見2～6個分生孢子)于分孢子梗上，呈倒棍棒狀，黃褐色至褐色，孢身25～70μm×10～25μm，有1～8個橫隔，橫隔間常見0～3個縱膈或斜隔，隔膜處常隘縮，表面光滑，成熟的分生孢子表面常有小的疣狀突起，孢身上部逐漸延伸成為長短不等的喙，呈柱狀或錐狀，長約15～40μm(圖1B)。

綜合菌落和分生孢子的形態，將供試菌株YZU 151074與已報道的五加科植物黑斑病病原鏈格孢菌比較，確定為三七黑斑病病原菌，種名應為Alternariapanacis(表1)。

表1　三七黑斑病病原菌與已報道的五加科植物鏈格孢菌的形態學比較

2.2分子系統學

供試菌株YZU 151074的ITS、BT2、gpd、Alt a1和RPB2基因序列分別約500、290、530、450bp和750bp。將測定的序列提交GenBank，其登陸號見表2。序列分析發現供試菌株的ITS基因序列(KU881907)與已報道的五加科植物鏈格孢菌的100%相同，因此選用4個基因序列(BT2、gpd、Alt a1和RPB2)組合起來，共1957bp，以7個相似種的12鏈格孢菌株為參照，構建系統發育樹(圖2)，系統發育分析表明，供試菌株三七黑斑病病原菌為Alternariapanacis。

表2　構建系統發育樹所有菌株的種類、寄主及GenBank登錄號

圖2　基于BT2、gpd、Alt a1和RPB2基因序列構建的ML(maximum likelihood)系統發育樹

3結論與討論

通過形態學檢測和分子系統發育分析，本研究結果表明三七黑斑病病原應為鏈格孢菌屬的Alternariapanacis，與人參、西洋參的黑斑病病原菌同屬于一個種。與Deng等[10]的結果相類似，并發現三七黑斑病的病原鏈格孢菌A.panacis與其他2個從五加科植物上分離的種類(A.araliae和A.dendropanacis)不同，在PDA培養基上不分泌有色色素，在PCA培養基上產生相對較小的分生孢子，串生的分生孢子鏈較長(2～6個)，并且可以通過基因序列分析進行分子鑒定，例如單個基因RPB2。

傳統鏈格孢菌的分類主要依據形態學的方法，Simmon等[5]對分離自五加科植物上的鏈格孢菌進行系統的形態學分類研究后，認為五加鏈格孢(A.araliaeGreene)和鵝掌藤鏈格孢(A.actinophyllaJ.W.Miller)與分離自人參和西洋參的人參鏈格孢(A.panax)形態學特征上相同，同屬人參鏈格孢。影響該觀點成立的主要原因是不同五加科植物鏈格孢菌的分生孢子在形態上存在交互重疊的現象，且其形態易受菌齡及培養條件影響。直至2007年，Simmon等[5]的鏈格孢菌專著里也持同樣的觀點。隨著分子生物學技術在鏈格孢菌分類研究上的廣泛應用，Deng等[8]利用分子學方法研究發現分離自10種五加科植物的58個鏈格孢菌菌株，被分成2個聚類組，且形態上存在明顯差異。隨后在2015年，Deng等[10]利用形態學和分子學方法，證明五加科(Araliaceae)植物鏈格孢菌共存在3個種類，而非僅一個種類。本研究用相似的分類學研究方法，對三七黑斑病病原鏈格孢菌進行復核鑒定，明確了其分類地位，這為該病害的防治研究提供一定的科學依據。

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[收稿日期]2016-03-08

[基金項目]國家自然科學基金項目(31400014)；長江大學青年人才基金項目(2015cqr17)。

[作者簡介]黃宏強(1993-)，男，現從事植物保護學研究。通信作者：鄧建新，djxin555@hotmail.com。

[中圖分類號]S432.4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-1409(2016)15-0006-04

[引著格式]黃宏強，范小燕，陶亞群，等.三七黑斑病病原菌的復核鑒定[J].長江大學學報(自科版) ，2016，13(15)：6～9.