液相色譜串聯質譜法測定卷煙主流煙氣中的苯并[a]芘

張小濤，侯宏衛，陳 歡，劉 勇，王 安，胡清源

（1.國家煙草質量監督檢驗中心，鄭州 450001；2.中國科學院合肥物質科學研究院應用技術研究所，合肥 230088）

液相色譜串聯質譜法測定卷煙主流煙氣中的苯并[a]芘

張小濤1,2，侯宏衛1*，陳 歡1，劉 勇2，王 安2，胡清源1,2

（1.國家煙草質量監督檢驗中心，鄭州 450001；2.中國科學院合肥物質科學研究院應用技術研究所，合肥 230088）

為準確、快速地測定卷煙主流煙氣中苯并[a]芘的含量，建立了液相色譜-大氣壓光電離-串聯質譜測定卷煙主流煙氣中苯并[a]芘的方法。方法對助劑流速、萃取溶劑、煙支數和色譜質譜測定的條件進行了優化，結果表明，當甲苯流速為80 μL/min，環己烷作為萃取溶劑，Agilent PAH（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）作為色譜柱，95%的乙腈和5%的水為流動相，色譜柱溫度為40 ℃，方法檢出限為0.15 ng/mL，苯并[a]芘回收率100%～107%，相對標準偏差小于10%，分析時間為6 min，與現行的GC-MS測定卷煙主流煙氣中苯并[a]芘的國家標準方法相比大大縮短了分析時間。該方法具有靈敏度高、分析時間短等優點，可以顯著地提高分析的通量。

主流煙氣；苯并[a]芘；大氣壓光電離；液相色譜串聯質譜

苯并[a]芘{B[a]P}在環境中占所有多環芳烴1%～20%，可通過皮膚、呼吸道、消化道等被人體吸收，在體內的代謝活化產物能引起肝、皮膚、肺等部位的腫瘤，對生殖系統、免疫系統都具有一定毒性[1]。卷煙主流煙氣中B[a]P的含量為5～40 ng/支煙[2-3]，霍夫曼名單也將其列入其中[4]，準確檢測其含量對于吸煙危害性評價具有較為重要的意義。目前，卷煙主流煙氣中B[a]P的測定方法主要有：液相色譜法（HPLC）[5-6]和氣相色譜質譜聯用方法（GC-MS或者GC-MS/MS）[7-12]。其中高效液相色譜-熒光檢測法最為常見（HPLC-FL），熒光檢測器具有較高的靈敏度，其檢出限可以達到ng級別，但是HPLC-FL檢測方法的運行時間較長，且較多的方法未應用內標，結果受前處理過程的影響比較大。GC/MS由于分離效果及色譜重現性好被廣范應用于卷煙主流煙氣中B[a]P分析，GB/T21130—2007[13]就是采用GC/MS測定卷煙主流煙氣中的B[a]P；但是，GB/T 21130—2007方法的前處理比較復雜，且分析時間比較長（約1 h）。最近，液相色譜-大氣壓光電離離子源-串聯質譜（LC-APPI-MS/MS）被用于復雜體系中多環芳烴的分析[14-17]。APPI使用紫外線對樣品進行電離，適合于低極性化合物的電離，尤其是在引入摻雜劑后可以大幅度提高B[a]P的電離效率，進而提高靈敏度。如Ding等[14]建立了LCAPPI-MS/MS測定卷煙主流煙氣中的10種致癌性的多環芳烴的方法，方法靈敏度高、專一性強，這說明LC-APPI-MS/MS適用于卷煙主流煙氣中B[a]P的分離和分析，但是其需要采用兩根色譜柱才能實現對10種多環芳烴的分離，Hypersil多環芳烴色譜柱（Thermo Fisher公司）分離其中的6個目標物；Xterra C18色譜柱（Waters公司）分離另外4個目標物。另外由于卷煙性質（煙絲質量、抽吸口數等）的差異，一支煙的結果不能很好的代表整個卷煙樣品。

本試驗針對卷煙主流煙氣中的B[a]P，利用LCAPPI-MS/MS，以d12-B[a]P作為內標，建立高靈敏度、高通量的LC-APPI-MS/MS分析卷煙主流煙氣中B[a]P的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

B[a]P標準品（純度≥98%）、氘代B[a]P（d12-BaP，純度≥98%），購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；硅膠柱（500 mg，3 mL），購自Agilent公司；乙腈和環己烷（色譜純）購自美國TEDIA有限公司，試驗中所用的水為去離子水。

安捷倫1200快速液相色譜儀（美國Agilent公司），配備有自動進樣器 G1367D，二元溶劑泵G1312B，柱溫箱 G1316B。API 5500三重四級桿串聯質譜儀（美國AB Sciex公司），配有光電離離子源（APPI），數據采集與處理在Analyst 1.5.1軟件上實現。L-2130泵（日本日立高新技術公司）和SM450直線式吸煙機（英國Cerulean公司）。

1.2 樣品處理

樣品平衡：樣品卷煙在溫度為（22±1）℃和相對濕度為（60±2）%條件下平衡48 h；卷煙樣品抽吸按GB/T 19609[18]的規定收集2支卷煙的總粒相物。

將劍橋濾片放入25 mL三角瓶中，加入20 μL的1 μg/mL的苯并[a]芘氘代內標，再加入10 mL環己烷，振蕩萃取60 min。萃取液經硅膠柱固相萃取，然后用6 mL環己烷洗脫，收集濾液和洗脫液，旋轉蒸發儀蒸干后，復溶于1 mL的乙腈，待測。

1.3 標準工作溶液的配制

分別準確稱取10 mg的B[a]P和d12-B[a]P固體于兩個10 mL的容量瓶中，用乙腈定容到刻度，分別得到1 mg/mL的B[a]P和d12-B[a]P儲備液。然后用儲備液稀釋配制不同濃度的B[a]P標準溶液和工作溶液。

1.4 色譜質譜條件

色譜條件：Agilent PAH色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相：水，乙腈；色譜柱溫度為40 ℃；進樣量2 μL。摻雜劑：甲苯，流速為80 μL/min；洗脫條件：乙腈：水，95：5（V/V），流速為300 μL/min，分析時間為6 min。

質譜條件：光電離離子源，多反應監測正離子掃描方式；電噴霧電壓：700 V；霧化氣：75 psi；氣簾氣：15 psi；輔助加熱氣：50 psi；溫度：600 ℃；射入電壓：10 V；碰撞能：9 eV；去簇電壓：110 V；駐留時間：50 ms。內標離子對，265.2～263.1，B[a]P定性離子對，253.2～251.1，定量離子對：253.2～252.1。整個分析過程由Applied Biosystems Analyst 1.5.1 軟件來控制。

1.5 統計分析方法

配對樣品t檢驗采用IBM SPSS Statistic 20.0軟件進行。

2 結 果

2.1 助劑流速的優化

在APPI源使用過程中，往往需要使用助劑來提高離子化效率，助劑作為光電離的媒介，主要通過交換電荷或質子轉移幫助待測物形成離子[19-20]。先前研究表明助劑的流速對分析靈敏度有很大的影響[21]，因此考察了甲苯的流速（40，60，80和100 μL/min）對B[a]P測定結果的影響，結果如圖1所示。從圖1可以看出，甲苯的流速對B[a]P測定結果有顯著影響，當甲苯流速為80 μL/min時，B[a]P的響應最高，因此最終選擇了80 μL/min作為甲苯的流速。

圖1 甲苯流速對離子化效率的影響Fig. 1 The influence of flow rate of toluene on ionization efficiency

2.2 流動相的選擇

Syage等[22]研究結果表明，流動相對于B[a]P的離子化效率存在一定影響，因此本試驗對甲醇和水（V甲醇:V水=95:5）、乙腈和水（V乙腈:V水=95:5）作為流動相時B[a]P的色譜質譜條件進行了優化。正如文獻報道的，對于質譜而言，使用甲醇作為流動相可以增加B[a]P的離子化效率，但是當樣品中B[a]P的含量增高時，色譜峰形展寬，分析時間明顯延長（圖2a）。考慮到主流煙氣樣品比較復雜，為了改善峰形和縮短分析時間、減少有機溶劑消耗，本試驗最終選擇乙腈和水作為流動相，這與文獻報道是一致的[13]，典型的色譜圖如圖2b所示。

2.3 萃取溶劑的選擇

圖2 不同流動相B[a]P的提取離子圖（a，V甲醇:V水=95:5；b，V乙腈:V水=95:5）Fig. 2 The extract ion chromatogram of B[a]P （a Methanol and water were used as mobile phase. b Acetonitrile and water were used as mobile phase）

目前文獻報道的用于萃取卷煙主流煙氣中 B[a]P的溶劑有甲醇[5]、乙腈[14]、二氯甲烷[16]、環己烷[6]等。考慮到所使用的流動相為乙腈和水，因此本試驗對乙腈和環己烷兩種有機溶劑進行了比較。以3R4F卷煙作為試驗卷煙，按照GB/T 19609的方法捕集2支煙的總粒相物，分別用乙腈和環己烷萃取、凈化和檢測，其結果如圖3所示，可見環己烷的萃取效率明顯高于乙腈。此外，由于乙腈的極性比較強，在萃取出B[a]P的同時也會把一些極性物質萃取出來，因此會干擾后面的色譜分離；而環己烷提取B[a]P的效率比較高[2]，且干擾比較少。因此本試驗選擇了環己烷作為萃取溶劑。

圖3 不同萃取溶劑對B[a]P的萃取效率Fig. 3 The extraction effect of different solvents on B[a]P

2.4 煙支數的選擇

采用劍橋濾片分別收集了2支和5支參比卷煙（中國煙草總公司自制）的總粒相物，分別進行5次平行試驗，并對測試的結果進行了比較分析，其平均值分別為7.24和7.37 ng/支，相對標準偏差分別為9.39%和7.19%，這說明2支煙和5支煙粒相物分析的結果差異很小，為了減少樣品制備的時間和減少有機溶劑的消耗，最終選擇了2支煙。

2.5 線性方程和檢出限

吸取2，5，10，20，40和60 ng/mL的標準溶液和振蕩萃取液固相萃取后的樣品各2 μL，注入LC-APPI-MS/MS系統進行分離分析。B[a]P的線性回歸方程為y=0.187x+0.0105，線性良好，相關系數為0.9993。利用信噪比的方法計算方法的定量限和檢出限，目標峰十倍信噪比對應的濃度為定量限，三倍信噪比對應的濃度為檢出限。B[a]P的定量限和檢出限分別為0.50 ng/mL和0.15 ng/mL，B[a]P的保留時間為3.02 min。

2.6 方法的回收率和重復性

采取樣本加標的方法獲得方法的加標回收率，總共選取了3個添加水平，每個添加水平重復測定5次，得到的方法的回收率和重復性，結果見表1。B[a]P的回收率在100%～107%，RSD小于10%，證明方法的準確性和重復性結果較好。

表 1 B[a]P的回收率和重復性Table 1 The recovery and repeatability of B[a]P

2.7 方法應用

利用建立的LC-APPI-MS/MS方法測定了12個國產卷煙樣品主流煙氣中B[a]P的釋放量，結果見表2。另外，對本方法測試結果和國標測試方法的結果進行了配對樣品t檢驗，sig值大于0.05，說明兩種方法測定結果相差不大，符合定量分析要求。

表2 GB/T 21130—2007規定的GC/MS與本方法的比較Table 2 Method comparison with the GC-MS method of GB/T 21130-2007

3 討 論

B[a]P是存在于卷煙主流煙氣中的對人體具有致癌或致畸作用的污染物質，因此快速測定煙氣中的B[a]P對卷煙質量監控和健康風險評估具有十分重要的意義。本研究針對卷煙主流煙氣粒相物中B[a]P，優化了甲苯流速、煙支使用數目，建立了LCAPPI-MS/MS測定主流煙氣中B[a]P的高靈敏和高選擇性的方法。

卷煙煙氣總粒相物中B[a]P的測定方法[13]采用的是轉盤吸煙機，共捕集20支煙的總粒相物，Ding等[14]報道的方法中采用一支煙的粒相物來測定10種多環芳烴，但由于卷煙自身性質的差異，1支煙的結果不能很好的代表卷煙樣品。本研究采用2支煙可以減少有機溶劑的使用量和提高分析通量。標準GB/T 21130—2007規定的GC/MS測定卷煙主流煙氣中B[a]P的方法分析一個樣本需要大概50 min，而本研究建立的LC-APPI-MS/MS方法分析1個樣本只需要6 min，大大提高了分析的通量。

本方法具有高的檢測靈敏度，方法檢測限為0.15 ng/mL，GB/T 21130—2007規定的GC/MS方法的檢測限為1.44 ng/mL[13]，與GC-MS方法相比其檢測靈敏度提高了約10倍。此外利用建立的LCAPPI-MS/MS方法和GB/T 21130—2007規定的GC/MS法分別測定了12個國產卷煙樣品主流煙氣B[a]P并進行了配對樣品t檢驗，sig值大于0.05，說明兩種方法的測定結果相差不大，LC-APPIMS/MS方法可以滿足煙氣中B[a]P的檢測要求。

建立的LC-APPI-MS/MS測定卷煙主流煙氣中B[a]P的方法具有較好的選擇性與較高的準確性，大氣壓光電離離子源的應用提高了B[a]P的離子化效率，從而提高方法的靈敏度，可用于卷煙主流煙氣中B[a]P的快速測定。

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Determination of Benzo[a]pyrene in Mainstream Cigarette Smoke by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Xiaotao1,2, HOU Hongwei1*, CHEN Huan1, LIU Yong2, WANG An2, HU Qingyuan1,2

(1. China National Tobacco Quality Supervision & Test Centre, Zhengzhou 450001, China; 2. Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, CAS, Hefei 230088, China)

In order to accurately and rapidly determine B[a]P content in mainstream cigarette smoke, a liquid chromatographyatmospheric pressure photoionization-tandem mass spectrometry (LC-APPI-MS/MS) for determination B[a]P in mainstream cigarette smoke was developed and validated. The flow rate of toluene, extraction solvent, number of cigarette and the conditions of liquid chromatography and mass spectrometry were optimized. The results indicated that when the flow rate of toluene was 80 μL/min, cyclohexane was used as extraction solvent, chromatographic separation was achieved by using an Agilent PAH column (100 mm×2.1 mm, 3.5 μm) at 40 ℃, and 95% acetonitrile and 5% water was selected as the mobile phase, the detection limit of the method was 0.15 ng/mL, the recovery of B[a]P was 100%-107%, the relative standard deviation was less than 10%, and the analysis time was 6 min. Compared with the existing GC-MS method for the determination of B[a]P in mainstream cigarette smoke, this method shortened the analysis time. The proposed method has the advantages of high sensitivity and short analysis time etc., which can significantly improve the throughput.

mainstream cigarette smoke; benzo[a]pyrene; APPI; LC-MS/MS

TS41+1

1007-5119（2016）06-0077-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.06.014

國家自然科學基金項目“基于代謝組學的頭頸癌生物標志物的發現及其與煙氣苯并芘的關系研究”（21277174）

張小濤（1988-），男，博士研究生，主要從事吸煙與健康、生物標志物研究工作。E-mail：zhangxiaotao9209@163.com *通信作者，E-mail：qsfctc@163.com

2016-04-11

2016-07-31