斑馬魚在毒理學中的研究進展

金夢凡　王晨陽　呂美君　雷小玲　尹爭志

【摘 要】斑馬魚作為一類脊椎模式動物，具備體型小、傳代周期短、繁殖率高、體外受精發育、胚胎透明、飼養管理方便等優勢，在毒理學研究領域發揮著越來越重要的作用。目前，斑馬魚已被廣泛用于環境毒理學、病理毒理學、胚胎發育毒理學等方面的研究，初步展現出其獨特的優勢，本文綜述了斑馬魚在毒理學研究中的進展。

【關鍵詞】斑馬魚；毒理學；進展

【Abstract】Zebrafish belongs to a kind of model vertebrate animals， and zebrafish plays more and more important role in the field of toxicology research due to the advantages including small size， short period of subculture， high reproduction， in vitro fertilization and development， transparent embryos， convenient feeding and management， etc. Zebrafish has been widely used in the field of environmental toxicology， pathology toxicology， embryonic development toxicology and other fields， and shows its unique advantages. In this paper， the development of zebrafish in toxicology is reviewed.

【Key words】Zebrafish； Toxicity assessment； Progress

0 引言

斑馬魚屬熱帶淡水魚，全身布滿多條深藍色縱紋似斑馬，成群游動時猶如奔馳的斑馬群，故稱作斑馬魚。斑馬魚常年產卵，成熟雌魚兩周可產卵幾百枚，卵在體外受精、發育，胚胎發育同步、速度快，3到4個月即可達到性成熟，成魚體長3至4厘米、體型纖細。斑馬魚對生存水質要求不高，適宜水溫為25～31℃。目前，斑馬魚遺傳圖譜已經建立，分析了有價值的突變體，發展了轉基因斑馬魚技術，其中透明斑馬魚得到了大力推廣，這些都提供了良好的毒理學研究平臺。斑馬魚己被廣泛應用于遺傳和發育、環境、病理等毒理學研究領域，展現出其獨特的優勢。

1 斑馬魚評價生殖和發育毒理效應

1.1 斑馬魚評價胚胎發育毒性

斑馬魚胚胎透明和體外發育，便于在正常生長發育及外源物質的處理下，觀察發育進程變化。在胚胎發育的致畸或致死原因中，血管、心臟和神經發育是最主要的三個方面，一直處于研究熱點，然而斑馬魚胚胎在這三個方面的研究應用尚屬起步階段。同時，斑馬魚具有學習、記憶、群聚、晝夜節律等復雜行為，國內外學者已用該模型進行神經發育毒理學研究，以探討神經系統疾病的發病機制與治療方法[1]。

1.2 斑馬魚在神經毒性方面的應用

斑馬魚具有敏感的腦神經系統，生命早期即可呈現典型的運動模式，如自主性收縮、碰觸反應、泳動等。自發性運動可以作為多巴胺神經元潛在毒性的指標，用于檢測腦神經系統和評價腦的早期發育。在神經毒性研究領域，斑馬魚與哺乳動物模型一樣，可以借助生化指標、形態學、行為學來評價藥物的神經毒性，檢測斑馬魚腦部神經元的壞死和凋亡情況；未來，斑馬魚在神經學方面，將具有更加重要的研究價值[2-4]（圖1）。

1.3 心臟發育及心血管方面的應用

斑馬魚的胎心類似于人類胚胎的心臟，分為心房和心室，房室之間有瓣膜，因而為研究人類心血管系統提供了一類較好的模型。而且，斑馬魚的卵體透明、胚胎發育快、心臟體節清晰，早期發育存活不依賴于血液循環，可用肉眼直接觀察活魚卵心臟的明顯形態和功能缺陷，或通過分子標記物來識別細微差別。受精48 小時后，發育正常的的斑馬魚胚胎，即可用于心臟毒性研究。斑馬魚在心血管藥物氯氮平、紅霉素、奎尼丁、阿司咪唑等評價方面都有所研究。Zhang等對斑馬魚心臟復蘇進行了研究報道[5]。一些藥物可導致斑馬魚心包水腫、心臟畸形、心率減低，體長縮短、體節發育異常、脊柱彎曲、卵黃囊水腫、出血、心臟縮小等多種表型改變。

1.4 斑馬魚評價骨骼發育毒性效應

硬骨魚發育中的基因、信號通路和人類骨骼發育具有高度同源性，相對于其他模型動物，斑馬魚具備個體小、繁殖快、適合高通量篩選、身體透明、易于觀察骨骼發育等優勢。近年來，以斑馬魚為模型的骨骼研究逐漸成為熱點，其中，中藥治療骨質疏松的功效正日益受到重視，但壯骨中藥及其成分，特別是量微成分的活性評價卻難以有效開展。新模型、新方法的建立有益于豐富中藥壯骨效應評價的思路與方法。模式生物斑馬魚既是一類較好的、熱門的藥學研究工具，根據其骨骼發育的生理、遺傳學特點和優勢，將斑馬魚用于中藥復雜體系及成分的壯骨效應評價，具有合理性和可行性。

2 病理毒理學中的應用

2.1 斑馬魚評價感官毒理學效應

斑馬魚的卵受精 72 小時后，視網膜已與成魚相似，而且幼魚眼睛占身體的很大部分，操作極其方便，斑馬魚特別適用于眼部疾病的研究。一旦其視力受損，斑馬魚會經常生活在暗處，皮膚的色素沉積黑素體隨之增加，通過眼睛大小或皮膚上的色素沉積可以方便快速地篩選出有視覺缺陷的斑馬魚。目前，發現的斑馬魚眼部特異性細胞或層損傷突變體已超過 50 種，視功能和眼球運動的有關試驗還在進行中[6]。

在斑馬魚模型中，耳的生長發育和功能、味蕾的細胞分子機制研究相對較少，但也都在展開進一步的研究。斑馬魚的聽覺器官由耳囊及附屬結構（如毛細胞和半規管）組成。斑馬魚神經丘毛細胞損傷可作為檢測耳毒性的一個重要指標，輔以斑馬魚幼體的游泳姿態和體位指標，可以對藥物的耳毒性進行快速、簡便的毒性篩選。

2.2 免疫系統方面研究

斑馬魚的免疫系統與高等脊椎動物相比，既有共性又有特殊性，近年來，斑馬魚在免疫學領域的應用研究逐漸被人們所重視[7-8]。哺乳動物中，骨髓和胸腺屬于中樞免疫器官，外周免疫器官有脾和淋巴結；而斑馬魚的腎是生成免疫細胞的主要器官，類似于人類的骨髓，在其中發現有T細胞、B細胞及樹突狀細胞。采用基因芯片技術篩選與魚類皮膚免疫相關的功能基因，將有助于魚類皮膚局部免疫應答的分子機制研究（圖2）。

2.3 內分泌系統研究

內分泌干擾物廣泛存在于水環境中，能夠使脊椎動物的發育、生理自身調節和健康狀況發生改變，引起了環境科學領域的廣泛關注。目前常采用VTG誘導這一內分泌干擾研究方式，廣泛篩選潛在影響內分泌通路的污染物，則需要轉錄組方法、組織病理學方法。性激素、生長激素、損傷修復酶系等在斑馬魚生長發育過程中起重要調控作用；內分泌擾亂物質對其生長發育影響的研究，主要集中于其對性激素的影響。目前，在激素水平研究內分泌生理和毒理存在一定難度，主要因為難以采集足量的測定血液，整體的激素檢測技術還不成熟。

3 斑馬魚的生態毒理學研究

3.1 在常規毒性試驗中的應用

我國制定了關于水質的毒性實驗方法，用于衡量水中單一化學物質或工業廢水的毒性。采用半靜態法測定了 360 種常用農藥制劑對斑馬魚的毒性效應，結果表明：近一半的制劑對斑馬魚表現高毒或劇毒效應，涉及 25 種農藥的有效成分，主要為殺蟲劑，毒性相遠高于殺菌劑和除草劑，微生物農藥對斑馬魚的毒效應較低，而部分植物源農藥表現的毒性較高；相同有效成分的不同制劑之間由于有效成分含量、劑型及加工工藝的不同，會表現不同的毒效應。

3.2 在生物誘導效應評價中的應用

斑馬魚胚胎常被用于生物誘導方面的研究。誘導產生的效應有脊椎形態異常、體節減少、心臟血液系統異常、鰓弓及腭發育異常、 腦和神經系統退化、魚鰭發育不全和魚鰾缺失等現象，其中以脊柱和體節異常為主。也可以利用斑馬魚對生物誘導劑的敏感作用，檢測水環境中的生物誘導劑。用腺苷二磷酸誘導斑馬魚血小板，發現腺苷二磷酸能使斑馬仔魚血小板在其眼睛、背部等處聚集，一定條件時可導致其死亡（圖3）。

3.3 斑馬魚評價納米粒子毒性

納米科技是 21 世紀的重點發展領域之一，目前，納米粒子的生物安全性體外實驗已取得了一些研究成果，但其體內安全性評價，由于各種限制而進展緩慢。斑馬魚是納米粒子活體生物安全性評價的最佳模式動物。Patrick Lie Johansen等借助光學系統和透明斑馬魚/胚胎研究了活體中納米粒子/細菌和細胞間的相互作用，構建了新型的研究平臺和手段，為未來腫瘤診療、腫瘤組織損壞和生物感染研究，奠定了堅實的基礎[10]。

4 結論與展望

斑馬魚作為脊椎動物，與人類基因的相似度高達87%，具有哺乳動物相似的心血管、造血、神經、代謝等系統，在遺傳、生理和藥理反應方面也與人類存在高度的相似性，基因和化學篩選證明，斑馬魚可以高度模擬人類和其他生物體。

斑馬魚在活體研究領域將起到越來越重要的作用，包括藥物篩選和藥效評價、水環境毒理學、食品科學、疾病甄治、腦神經科學、器官再生、細胞遷移、免疫學、細胞生物學、遺傳學、發育學、分子生物學、社會學、行為學等方面。我們相信，我國斑馬魚領域將得到快速發展，應用領域將更加廣泛，重大成果將更多涌現，為世界生命科學發展做出重要貢獻。

【參考文獻】

[1]Yuma O.； Thomas N.S. Whole-mount single molecule FISH method for zebrafish embryo[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 8571|DOI： 10.1038/srep08571.

[2]Chen S.J.； Chiu C.N.； McArthur K.L.； et al. TRP channel mediated neuronal activation and ablation in freely behaving zebrafish[J]. Nature Methods， 2016， 13（2）： 147-152.

[3]Randlett O.； Wee C.L.； Naumann E.A.； et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas[J]. Nature Methods， 2015， 12（11）： 1039-1050.

[4]Andersson M.A.； Fredrik E.； Roger O. Using visual lateralization to model learning and memory in zebrafish larvae[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 8667|DOI： 10.1038/srep08667.

[5]Zhang R.l.； Han P.D.； Yang H.B.； et al. In vivo cardiac reprogramming contributes to zebrafish heart regeneration[J]. Nature Letter， 2013， 498： 497-502.

[6]Affaticati P.； Yamamoto K.； Rizzi B.； et al. Identification of the optic recess region as a morphogenetic entity in the zebrafish forebrain[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 8738|DOI： 10.1038 /srep08738.

[7]Tang Q.； Moore J.C.； Ignatiu M.S.； et al. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immunedeficient zebrafish[J]. Nature Communications， 2016， 7：10358|DOI： 10.1038/ncomms10358.

[8]Kaufman C.K.； Mosimann C.； Fan Z.P.； et al. A zebrafish melanoma model reveals emergence of neural crest identity during melanoma initiation[J]. Science， 2016， 351（6272）， （aad2197） 1-10.

[9]Jank T.； Eckerle S.； Steinemann M.； et al. Tyrosine glycosylation of Rho by Yersinia toxin impairs blastomere cell behaviour in zebrafish embryos[J]. Nature Communications， 2015， 6：7807|DOI： 10.1038/ncomms8807.

[10]Patrick L.J.； Federico F.； Lasse E.； et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish[J]. Nature Communications， 2016， 7：10974|DOI： 10.1038/ncomms10974.

[責任編輯：楊玉潔]