CDKN3基因在肝癌中的表達及其對肝癌細胞生長、細胞周期的影響

李苗苗， 王海嘯， 陶國全

(1南京醫科大學附屬淮安第一醫院消化內科，淮安　223300； 2南京醫科大學附屬淮安第一醫院普通外科； *通訊作者，E-mail:13770875120@163.com)

CDKN3基因在肝癌中的表達及其對肝癌細胞生長、細胞周期的影響

李苗苗1*， 王海嘯2， 陶國全2

(1南京醫科大學附屬淮安第一醫院消化內科，淮安223300；2南京醫科大學附屬淮安第一醫院普通外科；*通訊作者，E-mail:13770875120@163.com)

摘要：目的研究細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(cyclin dependent kinase inhibitor 3，CDKN3)基因在肝癌組織中的表達，以及被沉默后對肝癌細胞生長和細胞周期的影響。方法采用普通及定量RT-PCR、蛋白免疫印跡法檢測36例手術切除的肝癌組織和匹配的癌旁組織以及人肝癌細胞株中CDKN3的表達；觀察沉默CDKN3表達后肝癌細胞生長曲線、克隆形成能力和細胞周期的變化。結果與癌旁樣本相比，CDKN3基因在63.9%(23/36)肝癌組織中的mRNA表達顯著上調，差異具有統計學意義(P<0.000 1)；RNA干擾技術沉默CDKN3表達后，MHCC-LM3和Huh-7細胞生長和克隆形成能力被明顯抑制(P<0.05)；應用流式細胞術發現沉默CDKN3的表達能夠誘導肝癌細胞發生G0/G1期阻滯(P<0.05)。結論CDKN3基因在肝癌中表達上調，其通過影響細胞周期分布從而促進肝癌細胞的增殖，在肝癌發生、發展過程中可能發揮重要作用。

關鍵詞：原發性肝癌；細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3；RNA干擾；基因沉默；細胞周期

原發性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的惡性腫瘤之一。2008年全球新發肝癌748 300例，死亡695 900例，其中約50%病例發生在中國[1]。近年來，我國肝癌發病率有上升趨勢，居我國惡性腫瘤死亡率第二位，是全球肝癌發病率、死亡率最高的國家[2]。

肝癌的發生發展是一個多基因多通路變異累積逐漸演變的復雜過程，其中癌基因的激活或抑癌基因的失活在肝癌的發生及發展過程中扮演著重要的作用[3,4]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制基因3(CDKN3)屬于激酶抑制蛋白CIP/KIP基因家族，其位于人類染色體14q22，所編碼的蛋白含212個氨基酸，CDKN3被認為在細胞周期調控中發揮重要作用[5]。研究發現，CDKN3的過表達與卵巢癌、腎癌等多種實體瘤的增殖密切相關[6,7]，目前國內外有關CDKN3在肝癌發生發展中功能的研究鮮見報道。本研究通過DNA聚合酶鏈反應、蛋白免疫檢測了CDKN3在肝癌組織及細胞中的表達規律；應用細胞生長曲線、克隆形成及流式細胞術等方法檢測了CDKN3對肝癌細胞的增殖、細胞周期的影響。本研究結果為進一步深入探討肝癌發病機制及肝癌的診斷、治療提供了可靠的實驗證據。

1材料與方法

1.1主要試劑

DMEM培養基(美國HyClone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；Trizol、Lipofectamine 2000轉染試劑和引物(美國Invitrogen公司)；Taq DNA聚合酶、dNTP和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa公司)；siRNAs(中國上海吉瑪制藥有限公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(日本同仁化學研究所)；PI/RNase staining buffer試劑盒(美國BD公司)；β-actin抗體和CDKN3(C-18)抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.2樣本來源

36例肝癌標本均取自南京醫科大學附屬淮安市第一人民醫院2008-03～2010-10期間接受肝膽外科手術治療的肝癌患者，包括癌組織和癌旁組織，所有標本都經過臨床及病理確診是肝細胞性肝癌。將患者標本用于科學研究取得了淮安市第一醫院倫理委員會的同意。手術樣本的留取均獲得患者知情同意，并簽署知情同意書。肝癌細胞株培養于DMEM培養基中(含10%小牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)。培養條件為37 ℃、5%CO2，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3RNA抽提及逆轉錄

癌組織、癌旁組織和細胞株均采用Trizol試劑，并按照其操作說明提取標本總RNA。RNA的逆轉錄采用M-MLV Reverse Transcriptase(美國Promega公司)逆轉錄成cDNA，操作步驟按照其說明書嚴格操作。

1.4普通及實時熒光定量PCR

選擇管家基因β-actin作為內參基因，以肝癌及其對應的癌旁組織的cDNA為模板。普通及定量PCR均采用相同的引物，CDKN3基因引物序列如下：CDKN3F：5′-CCAGAGGGGAACTGTCAAAA-3′；R：5′GCAGCTAATTTGTCCCGAAA-3′，擴增片段長度為355 bp。β-actinF：5′-AGAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′；R：5′-CTGGGCCTCGTCGCCCACATA-3′，擴增片段長度為230 bp。普通反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33循環(β-actin為29循環)；72 ℃延伸7 min。PCR產物于2%瓊脂凝膠中電泳，紫外分析儀中觀察并照相。實時熒光定量PCR反應條件：94 ℃預變性30 s，之后94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環后進行溶解曲線的檢測。每次實驗組設3個復孔，數據分析方法：ΔCtCDKN3=CtCDKN3平均值-對應模板Ctβ-actin平均值；ΔΔCtCDKN3=ΔCtCDKN3癌-ΔCtCDKN3癌旁。肝癌組織和癌旁組織的CDKN3基因表達差異的倍數關系用2-ΔΔCtCDKN3表示。

1.5RNA干擾

根據Invitrogen公司網站上的設計siRNA的原則和操作步驟，針對CDKN3基因的開放讀碼框序列設計了兩條相應的雙鏈siRNAs:siRNA-1和siRNA-2,選擇與人類基因序列無同源性的不作用于人類任何基因的siRNA-NC作為陰性對照。序列分別為siRNA-1F：5′-CAGACUCCAAUUCAUAUAUdTdT-3′；R：5′-AUAUAUGAAU UGGAGUCUGdTdT-3′，siRNA-2F：5′-CCAUCAAGCAAUACAAUUAdTdT-3′；R：5′-UAAUUGUAUUGCUUGAUGGdTdT-3′；siRNA-NCF：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′；R：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′。1.6siRNA轉染肝癌細胞siRNA的轉染均采用Lipofectamine 2000轉染試劑，轉染過程嚴格按照其說明書操作。

1.7細胞生長曲線的測定

采用CCK-8法檢測細胞的增殖能力。取對數生長期的肝癌細胞，接種于96孔板中(每孔3×103個細胞)。細胞培養24 h至細胞貼壁，應用Lipofectamine 2000轉染試劑轉染相應siRNAs，轉染6 h時更換成100 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基。繼續培育24 h，每孔加入10 μl CCK-8，37 ℃、5%CO2培養箱孵育1 h，酶標儀測定450 nm處吸光度值。每隔24 h測1次，收集、處理數據。

1.8細胞軟瓊脂克隆形成實驗

轉染siRNAs至MHCC-LM3和Huh-7細胞中，觀察CDKN3基因表達被沉默后的軟瓊脂克隆形成能力。將siRNAs轉染至肝癌細胞后37 ℃、5%CO2培養箱孵育24 h，然后消化全部細胞，計數并取適量細胞用液態軟瓊脂懸浮、種植至已預先鋪好軟瓊脂的6孔板培養皿中繼續培養，直至生長出在顯微鏡下可觀察到較大克隆(一般培養4周)，考馬斯亮藍染色過夜，拍照。

1.9流式細胞術檢測細胞周期

取對數生長期的細胞，均勻接種適量細胞于6孔板，37 ℃、5%CO2培養過夜；第2天分別轉染siRNA-NC、siRNA-1和siRNA-2，孵育6 h更換完全培養液終止轉染，37 ℃、5%CO2培養72 h；收集細胞，用PBS洗細胞2次，離心收集細胞1×105-5×105個；然后用0.5 ml PBS重懸細胞，加入PI/RNase staining buffer 0.5 ml，混勻，置暗處、室溫、反應10 min，然后于流式細胞儀(FACSCalibur,美國Becton Dickinson公司)分析細胞周期，計數20 000個細胞，應用Modfit分析軟件計算細胞周期分布。

1.10蛋白免疫印跡法測定肝癌組織及肝癌細胞中CDKN3的表達

肝癌組織、細胞株或經處理后的細胞按常規方法收集、裂解細胞，BCA試劑盒測定蛋白濃度，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電轉移至硝酸纖維素膜，膜用含5%脫脂奶的PBST緩沖液封閉30 min，加入1∶1 000稀釋的抗人CDKN3抗體或1∶4 000稀釋的抗人β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜，PBST漂洗3次，然后加入封閉液稀釋的二抗(1∶1 000)，室溫搖床上反應30 min，Odyssey Infared Imaging System紅外成像系統掃描膜，檢測目的蛋白表達。

1.11統計學分析

2結果

2.1CDKN3在肝癌組織、癌旁無瘤組織及人類肝癌細胞株中的表達

CDKN3在肝癌組織中的mRNA表達量明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.000 1，見圖1A)，其在63.9%(23/36)肝癌組織中的表達水平明顯上調。同時對36例肝癌標本中表達上調的23例標本進行了普通PCR的驗證，結果證實：與癌旁組織比較，CDKN3在對應的癌組織中表達都是升高的(見圖1B)。隨機選擇了4對標本，蛋白免疫印跡發現其中2對癌組織中CDKN3蛋白表達顯著增加，1對略上調，1對無明顯差異(見圖2A)，與以上的實驗結果是吻合的。

圖1　CDKN3基因在肝癌組織中的mRNA表達規律Figure 1　Expression pattern of CDKN3 mRNA in HCC specimens

圖2　CDKN3蛋白在肝癌標本和肝癌細胞株中的蛋白表達水平Figure 2　Expression level of CDKN3 protein in HCC specimens and cell lines

如圖2B顯示，CDKN3在肝癌細胞株中廣泛表達，在HepG2、MHCC-LM3、Huh7、Focus和MHCC-97H細胞株中表達相對較高，而在SK-hep-1、PLC/PRF/5、Hep3B細胞株中表達相對較低。

2.2基因沉默CDKN3基因對肝癌細胞生長、克隆形成的影響

本實驗選擇了CDKN3基因表達量相對較高的肝癌細胞MHCC-LM3和Huh7細胞株作為模型。首先利用實時熒光定量PCR評價了siRNA干擾的效果：與陰性對照相比，兩個siRNAs都能夠顯著下調目的基因mRNA的表達(P<0.01，見圖3A和圖4A)。同樣蛋白免疫印跡也證實兩個siRNAs成功沉默蛋白CDKN3的表達(見圖3B和圖4B)。干擾CDKN3基因表達后，隨著時間的增長，MHCC-LM3和Huh7細胞的增殖明顯被抑制(P<0.05，見圖5)。進一步的克隆形成實驗結果提示，與對照組比較，沉默CDKN3表達后，MHCC-LM3和Huh7細胞形成的克隆數目和大小都明顯減小(P<0.01，見圖6)。

圖3　MHCC-LM3細胞中siRNA沉默CDKN3的干擾效率評價Figure 3　Evaluation of CDKN3 knockdown efficiency by siRNA in MHCC-LM3 cells

圖4　Huh7細胞中siRNA沉默CDKN3的干擾效率評價Figure 4　Evaluation of CDKN3 knockdown efficiency by siRNA in Huh7 cells

圖5　CDKN3低表達對肝癌MHCC-LM3和Huh7細胞增殖的抑制作用 (n=3)Figure 5　CDKN3 knockdown suppressed the cell proliferation of MHCC-LM3 and Huh7 cells (n=3)

與對照組si-NC比較，*P<0.01圖6　敲降CDKN3表達抑制肝癌MHCC-LM3和Huh7細胞的克隆形成 (n=3)Figure 6　CDKN3 knockdown significantly inhibited the colony formation of MHCC-LM3 and Huh7 cells (n=3)

2.3CDKN3表達沉默后對肝癌細胞周期的影響

如圖7所示，si-NC對照組G0/G1期肝癌細胞的比例為(64.17±2.24)%，si-1和si-2兩干擾組G0/G1期肝癌細胞的比例分別為(79.09±1.13)%、(79.13±1.26)%。結果說明，與陰性對照組相比，RNA干擾CDKN3基因表達后，si-1和si-2這兩干擾組的G0/G1期細胞比例均明顯增加(P<0.05)，相應的S期細胞明顯減少(P<0.01)。

與對照組si-NC比較，*P<0.05，**P<0.01圖7　CDKN3低表達對MHCC-LM3細胞周期的影響Figure 7　Effect of CDKN3 knockdown on cell cycle of MHCC-LM3 cells

3討論

細胞周期和癌癥發生的機制是近年來腫瘤學研究熱點。細胞周期的調控是一個復雜的生物學過程，很多癌基因和抑癌基因直接參與了細胞周期的調控，甚至本身就是細胞周期調控復合體的主要成分。這些基因變異導致了細胞周期的失控，失去控制的細胞無限制增殖，形成的克隆群就是腫瘤。參與細胞周期調控的因子主要包括：細胞周期蛋白(cyclins)，細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)和細胞周期蛋白激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitors,CKI/CDKN)等。

細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(CDKN3)編碼的蛋白質屬于雙特異性蛋白磷酸酶家族。作為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子家族成員之一，CDKN3可同時抑制及促進細胞周期進程[8,9]。首先，CDKN3可選擇性地與CDK2特異性結合并抑制其對Rb蛋白的磷酸化[9]，非磷酸化的Rb蛋白通過與轉錄因子E2F1結合而抑制G1/S期蛋白合成，從而導致G1/S期阻滯[10,11]。其次，CDKN3可與P53、Mdm2蛋白結合形成復合體，進而抑制P21蛋白的誘導和阻滯p53靶基因合成，最終易化細胞周期進程[12]。

越來越多的證據表明，CDKN3在很多腫瘤中表現為促進腫瘤發生發展，如CDKN3在乳腺癌、前列腺癌中高表達，可促進細胞的增殖和表型的轉化[13]；而在卵巢癌中高表達增強細胞的侵襲能力[14]。本研究闡述了CDKN3在肝細胞肝癌中的表達情況，并通過RNAi沉默其表達分析了CDKN3對肝癌細胞增殖的影響。實驗結果表明，CDKN3在肝癌中表達升高，沉默其表達，肝癌細胞增殖速率降低，細胞周期受到阻滯，提示與乳腺癌和前列腺癌類似，CDKN3在肝癌發生、發展過程中也起重要的促進作用。然而有意思的是，在其他腫瘤中，如腦膠質細胞瘤，CDKN3呈現低表達，并通過CDC2信號通路控制細胞有絲分裂而發揮抑癌作用[15]。據此可見，在不同的腫瘤組織CDKN3發揮的功能不同，甚至截然相反，進一步說明CDKN3在細胞生命活動中的重要性和復雜性。目前CDKN3在肝癌中發揮促進作用的分子機制尚不清楚。今后的研究應集中在CDKN3如何對下游信號調控及尋找其所發揮功能的下游效應因子，闡明其在肝癌中的作用機制。

參考文獻：

[1]Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,etal.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[3]Chua HH,Tsuei DJ,Lee PH,etal.RBMY,a novel inhibitor of glycogen synthase kinase 3β,increases tumor stemness and predicts poor prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2015,62(5):1480-1496.

[4]Meng X,Franklin DA,Dong J,etal.MDM2-p53 pathway in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Res,2014,74(24):7161-7167.

[5]Wang L,Sun L,Huang J,etal.Cyclin-dependent kinase inhibitor 3(CDKN3) novel cell cycle computational network between human non-malignancy associated hepatitis/cirrhosis and hepatocellular carcinoma(HCC) transformation[J].Cell proliferation,2011,44(3):291-299.

[6]Li T,Xue H,Guo Y,etal.CDKN3 is an independent prognostic factor and promotes ovarian carcinoma cell proliferation in ovarian cancer[J].Oncol Rep,2014,31(4):1825-1831.

[7]Lai MW,Chen TC,Pang ST,etal.Overexpression of cyclin-dependent kinase-associated protein phosphatase enhances cell proliferation in renal cancer cells[J].Urol Oncol,2012,30(6):871-878.

[8]Patterson KI,Brummer T,O’Brien PM,etal.Dual-specificity phosphatases:critical regulators with diverse cellular targets[J].Biochem J,2009,418(3):475-489.

[9]Niculescu MD,Yamamuro Y,Zeisel SH.Choline availability modulates human neuroblastoma cell proliferation and alters the methylation of the promoter region of the cyclin-dependent kinase inhibitor 3 gene[J].J Neurochem,2004,89(5):1252-1259.

[10]Morris EJ,Ji JY,Yang F,etal.E2F1 represses beta-catenin transcription and is antagonized by both pRB and CDK8[J].Nature,2008,455(7212):552-556.

[11]Cecchini MJ,Dick FA.The biochemical basis of CDK phosphorylation-independent regulation of E2F1 by the retinoblastoma protein[J].The Biochemical journal, 2011,434(2):297-308.

[12]Okamoto K,Kitabayashi I,Taya Y.KAPl dictates p53 response induced by chemotherapeutic agents via Mdm2 interaction[J].Biochemical and biophysical research communications,2006,351(1):216-222.

[13]Lee SW,Reimer CL,Fang L,etal.Overexpression of kinase-associated phosphatase (KAP) in breast and prostate cancer and inhibition of the transformed phenotype by antisense KAP expression[J].Mol Cell Biol,2000,20(5):1723-1732.

[14]Zhang LP,Li WJ,Zhu YF,etal.CDKN3 knockdown reduces cell proliferation,invasion and promotes apoptosis in human ovarian cancer[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(5):4535-4544.

[15]Nalepa G,Barnholtz-Sloan J,Enzor R,etal.The tumor suppressor CDKN3 controls mitosis[J].J Cell Biol,2013,201(7):997-1012.

Expression of CDKN3 in hepatocellular carcinoma and its effects on cell proliferation and cell cycle of hepatocellular carcinoma cells

LI Miaomiao1*, WANG Haixiao2, TAO Guoquan2

(1DepartmentofGastroenterology,Huai’anFirstPeople’sHospital,NanjingMedicalUniversity,Huai’an223300,China;2DepartmentofGeneralSurgery,Huai’anFirstPeople’sHospital,NanjingMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:13770875120@163.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of CDKN3 gene in hepatocellular carcinoma tissues and explore the effects of CDKN3 silencing on cellular proliferation and cell cycle of hepatocellular carcinoma cells.MethodsThe expression levels of CDKN3 were detected in 36 pairs of HCC samples and corresponding adjacent non-cancerous tissues from surgical resection and human HCC cell lines by semiquantitative RT-PCR, quantitative real-time PCR and Western blot. And the cell proliferation, colony formation and cell cycle were investigated after CDKN3 knockdown by siRNAs.ResultsCompared with adjacent non-cancerous tissues, CDKN3 was significantly upregulated in 63.9%(23/36) HCC tissues at the mRNA level(P<0.000 1). Silencing of CDKN3 by siRNAs significantly inhibited the cell growth and colony formation of MHCC-LM3 and Huh-7 cells(P<0.05). CDKN3 knockdown induced HCC cell arrest at G0/G1 phase using flow cytometry(P<0.05).ConclusionCDKN3 gene is frequently upregulated in HCC and may promote cell growth of HCC by regulating cell cycle. CDKN3 may play an important role in the initiation and development of HCC.

Key words:hepatocellular carcinoma;CDKN3;RNA interference;gene silencing;cell cycle

作者簡介：李苗苗，女，1988-06生，碩士，住院醫師，E-mail：13770875120@163.com

收稿日期：2016-03-03

中圖分類號：R735.7

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)06-0496-06

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.003