Rac1基因在胰腺癌組織中表達及其臨床意義

李軍輝， 于　碩， 曹　罡， 張　焱， 楊文彬

(西安交通大學第二附屬醫院普通外科，西安　710004；*通訊作者，E-mail:wenbinsurgery@126.com)

Rac1基因在胰腺癌組織中表達及其臨床意義

李軍輝， 于碩， 曹罡， 張焱， 楊文彬*

(西安交通大學第二附屬醫院普通外科，西安710004；*通訊作者，E-mail:wenbinsurgery@126.com)

摘要：目的觀察Rac1在胰腺癌組織及不同來源胰腺癌細胞中的表達情況，并檢測其對癌細胞增殖和侵襲能力的影響。 方法應用免疫組化法檢測Rac1在胰腺癌組織中表達，并將癌組織按T分期進行分組，觀察Rac1表達與病理分期之間的關系。通過RT-PCR、Western blot檢測胰腺癌細胞株Rac1表達情況。用Rac1中和抗體對培養癌細胞進行干預，未干預組作為對照，通過MTT、Transwell方法檢測Rac1對細胞增殖及侵襲能力的影響。 結果與正常胰腺組織(0.07±0.17)相比，隨著腫瘤分期的增加，Rac1在T1(0.37±0.08)，T2(0.47±0.07)，T3期(0.53±0.09)胰腺癌組織標本中表達呈上升趨勢(P<0.01)。Rac1在5株細胞中均呈陽性表達，應用Rac1中和抗體對培養癌細胞干預24 h,48 h及72 h，癌細胞的增殖能力均出現明顯下降，其累計光密度值分別為1.49±0.07，1.53±0.03，1.55±0.04，與未加抗體組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。而培養20 h細胞的侵襲能力也明顯降低，穿膜細胞數明顯減少，與未加抗體組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。 結論Rac1在胰腺癌組織中高表達，并與腫瘤的分期明顯相關。Rac1在胰腺癌細胞株中呈現普遍表達，可增強癌細胞的增殖及侵襲能力。

關鍵詞：胰腺癌；Rac1；細胞增殖；細胞侵襲

胰腺癌惡性程度高，被稱為“癌中之王”，是一種嚴重影響健康和生活質量的消化系統惡性腫瘤。在過去20余年中，胰腺癌發病率并沒有減少趨勢，在美國，2015年新發病例為48 960例，預期死亡人數為40 560例，死亡率居全部腫瘤死亡率的第4位，其中只有約8%的患者有切除的可能性，5年生存率<6%[1,2]。目前對于胰腺癌轉移的具體機制研究很多，但仍不明了。Rac1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)，中文名也叫Ras相關的C3肉毒素底物1。當Rac1激活后，可參與肌動蛋白應力纖維和黏附斑形成，促進細胞骨架結構重組，調節片狀偽足與絲狀偽足延伸，影響細胞的形體極化，增加細胞的運動遷徙。Rac1在胃癌組織標本中高表達，與胃癌的分化程度、預后明顯相關，可增加癌細胞的增殖及侵襲能力，在頭頸部腫瘤、卵巢腫瘤中亦出現高表達[3]。本研究擬檢測Rac1在胰腺癌中的表達情況并觀察其與胰腺癌轉移的臨床相關性。

1材料與方法

1.1臨床資料

收集西安交通大學第二附屬醫院2001-01～2014-12的602例胰腺癌患者病例資料，其中男性377例，女性225例，年齡(61±12)歲。選擇根治性手術并能找到病理標本的患者72例進行研究，正常胰腺組織標本6例作為對照組。

1.2主要試劑

DMEM培養基和胎牛血清購自GIBCO公司；Rac1抗體購自Sigma Chemical公司；MTT試劑購自Sigma Chemical公司；反轉錄試劑盒購自Fermentas Life Science公司；Transwell小室購自Millipore公司。

1.3免疫組化檢測Rac1蛋白表達情況

標本經二甲苯脫蠟10 min，2次；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；加入30 ml/L H2O2甲醇，作用10 min，以去除內源性過氧化氫酶；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min后，移到濕盒；將綿羊血清滴加在蓋玻片上，每孔3-4滴，放入37 ℃烤箱孵育30 min；吸去封閉液，勿洗，分別加入1∶300兔抗鼠Rac1抗體，每片加60 μl，于4 ℃過夜；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；將1∶200生物素化的山羊抗兔IgG滴加在蓋玻片上，每片60 μl，37 ℃孵育30-40 min；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；將即用型ABC液滴加在蓋玻片上，37 ℃孵育30 min；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；加入DAB顯色液作用3-10 min，0.01 mol/L PBS 清洗3次，每次5 min；梯度酒精中脫水、二甲苯透明、樹膠封片。應用Pro-Plus software(IPP)6.0圖片分析軟件，對每一個樣本切片進行測量分析。Rac1免疫組化陽性反應為細胞漿、細胞膜或細胞核中有黃色顆粒。

1.4細胞培養檢測Rac表達情況及其對癌細胞生物學行為影響

選擇不同來源的胰腺癌細胞株BxPC-3(人胰腺癌上皮細胞)、Panc-1(人胰腺癌上皮細胞)、AsPc-1(胰腺癌腹水轉移)、CFPAC-1(人胰腺癌肝轉移)、SW1990(人胰腺癌脾臟轉移)，使用DMEM高糖培養基和10%(體積分數)胎牛血清的全培養基培養細胞，將細胞于37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養，用于檢測Rac1表達情況及下一步細胞功能學實驗。

1.5實時定量PCR鑒定Rac1 mRNA的表達

用Trizol法提取5株細胞的總RNA。Rac1引物設計 5′-CCC AAG CTT ATG CAG GCC ATC AAG TGT GTG-3′(forward)，5′-CGC GGA TCC CAA CAG CAG GCA TTT TCT CTT CC-3′(reverse)，逆轉錄后。PCR反應條件：94 ℃變性2 min，64 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，循環30次，最后72 ℃ 7 min延伸，通過Ct值和標準曲線的關系對模板進行定量分析。

1.6Western blot檢測Rac1蛋白的表達

RIPA法裂解并提取蛋白，并用BCA分析法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳約2 h，半干轉1.5 h，然后使用含一抗的封閉液4 ℃孵育過夜。次日二抗封閉液室溫孵育2 h，洗膜，DAB顯色，照相并分析結果。

1.7MTT法檢測Rac1對癌細胞增殖能力影響

利用MTT法檢測細胞增殖。于96孔培養板內接種1×104個對數生長期的細胞，細胞生長于全培養基中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。細胞貼壁后加入Rac1中和抗體，培養24，48，72 h，每孔加入MTT試劑20 μl，4 h棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO，10 min利用酶標儀進行檢測。

1.8Transwell細胞侵襲實驗檢測Rac1對癌細胞侵襲能力影響

取對數生長期Panc-1細胞，以105個/ml的密度接種于24孔板中，次日給予含100 nmol/L胰蛋白酶培養液，48 h制備細胞懸液。將含50 μl Matrigel膠包被Transwell小室置于24孔板中，在小室膜上加入Panc-1細胞懸液100 μl，細胞數約為1×105個，小室膜下加入600 μl完全培養液。實驗組加入Rac1中和抗體，37 ℃、5%CO2條件下孵育20 h，用棉簽輕輕擦去膜上細胞，膜下細胞用結晶紫染色，倒置顯微鏡下分別計數每孔5個視野(×200)中的細胞，取其均值。

1.9統計學分析

2結果

2.1Rac1在胰腺組織標本中的表達情況

通過免疫組化發現，68例患者出現Rac1陽性染色，Rac1主要表達于細胞漿中，而正常胰腺組染色陰性。隨著腫瘤分期的增加，細胞胞質中Rac1染色逐漸加深，在T3期中為片狀深染區(見圖1)。經累計光密度分析(IOD)，正常組(0.07±0.17)，T1(0.37±0.08)，T2(0.47±0.07)，T3(0.53±0.09)，隨著腫瘤分期的增加，Rac1表達呈上升趨勢，各癌組織Rac1表達與正常胰腺組相比，差異有統計學差異(P<0.01)。

A.正常胰腺組織；B.T1期癌組織；C.T2期癌組織；D.T3期癌組織　　　　　與正常組相比,*P<0.05圖1　不同分期及正常胰腺組織中Rac1表達情況 (×200)Figure 1　The expression of Rac1 in different stages of pancreatic cancer and normal pancreas tissues (×200)

2.2Rac1在胰腺癌細胞中的表達情況

應用RT-PCR檢測胰腺癌細胞株中Rac1在轉錄水平的表達情況。培養48 h時，可見5株癌細胞中均有Rac1表達(見圖2)。為了進一步分析表達量的具體變化，對5株細胞的累計光密度(IOD)值與β-actin的IOD相比，得出每株癌細胞Rac1的相對表達量，結果顯示，Panc-1細胞中Rac1表達量最高。

圖2　不同分化程度胰腺癌細胞中Rac1 mRNA表達情況Figure 2　The expression of Rac1mRNA in different pancreatic cancer cell

為了進一步分析5株癌細胞Rac1蛋白表達量的變化，應用Western blot進行檢測發現5株癌細胞中均有Rac1蛋白表達，提示Rac1在癌細胞中普遍表達，對5株細胞的累計光密度(IOD)值與β-actin的IOD相比，Panc-1細胞中Rac1表達量最高(見圖3)。

圖3　不同分化程度胰腺癌細胞中Rac1蛋白表達情況Figure 3　The expression of Rac1 protein in pancreatic cancer cell lines

2.3Rac1對癌細胞增殖能力影響

應用MTT法對Rac1中和抗體的作用濃度進行篩選，其最佳作用濃度為1.0 μg/ml，應用于以下實驗。應用Rac1表達最強的Panc-1細胞進行細胞功能學實驗，MTT結果顯示，隨著培養時間的延長，細胞的增殖能力也逐漸增加，在培養24,48,72 h其累計光密度值分別為1.63±0.03,1.77±0.14和1.87±0.12，呈現明顯的時間依賴性，而加入Rac1中和抗體后，24,48,72 h其累計光密度值分別為1.49±0.07,1.53±0.03和1.55±0.04，細胞的增值能力無明顯增加，與未加Rac1抗體組相比有明顯統計學差異(P<0.01，圖4)，提示Rac1參與了胰腺癌細胞的增殖。

與Rac1組相比，*P<0.01 圖4　Rac1對癌細胞增殖能力影響Figure 4　The effect of Rac1 on proliferation of pancreatic cancer cells

2.4Rac1對癌細胞侵襲能力影響

Transwell細胞侵襲實驗用來檢測不同濃度葡萄糖對胰腺癌細胞株侵襲能力的影響，結果顯示，在上室中加入Rac1中和抗體并培養20 h后，細胞的侵襲能力明顯減弱(見圖5)。對穿膜細胞數計數后進行統計學分析，發現未加抗體組穿膜細胞數為32.33±1.53，加入Rac1中和抗體的后，穿膜細胞數明顯減少，平均為21.67±2.52，兩組比較有統計學差異(P<0.05)。提示Rac1可促進胰腺癌細胞的侵襲能力的變化。

A. Rac1組　　　　　　B.Rac1+中和抗體圖5　Rac1對癌細胞侵襲能力影響Figure 5　The effect of Rac1 on invasion of pancreatic cancer cells

3討論

Rac1可通過多種方式促進腫瘤細胞侵襲、轉移，Rac1活化后可促進整合素(integrin)類蛋白在細胞表面募集，并傳遞調節信號至肌動蛋白細胞骨架，進而誘導激動蛋白微絲聚集于細胞膜，影響細胞運動；可通過激活Ⅳ型膠原酶MMP4、MMP2，促進細胞外基質降解，增強腫瘤細胞侵襲穿透能力[3]。Rac1也參與了胰腺癌的發生發展，在胰腺癌中，活化的和總Rac1水平明顯升高，而p110alpha(p110α)的缺失可降低Rac1的活性和表達水平。與正常胰腺組織相比，胰腺上皮內瘤樣變組織內Rac1的表達亦明顯升高[4]，提示Rac1參與了胰腺癌的早期發展，但是否與胰腺癌的分期相關，目前尚不清楚。miR-124是一種腫瘤抑制基因，Rac1則是癌基因，miR-124可直接滅活Rac1，導致MKK4-JNK-c-Jun信號通路的失活。在胰腺癌組織中，miR-124已被沉默掉[5]。在Kras突變小鼠中，特異性敲除Pik3ca和Rac1，可預防胰腺腫瘤的形成。與正常胰腺組織相比，胰腺上皮內瘤樣變組織中Rac1表達明顯升高[4]。本研究通過免疫組化檢測，大多數胰腺癌患者出現Rac1陽性染色，隨著腫瘤分期的增加，隨著腫瘤分期的增加，Rac1表達呈上升趨勢，提示Rac1表達與腫瘤分期明顯相關。不同分化程度的胰腺癌細胞中均有Rac1蛋白及mRNA表達，提示mRac1在癌細胞中普遍表達。

在胰腺癌小鼠模型中，K-Ras基因活化導致腺泡-導管化生，并形成胰腺上皮內瘤樣變前提損傷，而特異性敲除Rac1基因，可逆轉這一過程。抑制Rac1可阻斷G2/M細胞周期的活化[4]。在胃癌組織中Rac1表達明顯升高，并且與腫瘤分化、局部浸潤、淋巴結轉移、腫瘤分期以及惡性預后明顯相關[6]。胃癌細胞株中Rac1表達亦明顯升高，增加了腫瘤的生長以及侵襲轉移[6]。Rac1在卵巢癌組織中高表達，并且與腫瘤的分期、復發和預后相關，下調Rac1可通過p38MAPK信號通路減少細胞EMT轉化及增殖能力[7]。

通過Rac1中和抗體拮抗Rac1作用后，本研究通過MTT及Transwell細胞侵襲實驗觀察Rac1對癌細胞生物學行為的影響，發現拮抗Rac1作用后，癌細胞的增殖和侵襲能力均明顯下降，提示Rac1可促進胰腺癌細胞的增殖和侵襲能力，但其具體機制尚待進一步研究。綜上所述，Rac1在胰腺癌組織及細胞株中均高表達，與腫瘤分期明顯相關，并增強了癌細胞增殖和侵襲能力。

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The expression of Rac1 in pancreatic cancer and its clinical significance

LI Junhui, YU Shuo, CAO Gang, ZHANG Yan, YANG Wenbin*

(DepartmentofGeneralSurgery,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;*Correspondingauthor,E-mail:wenbinsurgery@126.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the expression of Rac1 in pancreatic tissue and cancer cell line, and its effects on the biological behavior of cancer cells. MethodsThe clinical and pathological features of formalin-ixed pancreatic cancer specimens and normal pancreases were analyzed. The expression of Rac1 was examined by immunohistochemistry. The relationship between the expression of Rac1 and tumor stage was analyzed. The expression of Rac1 in pancreatic cancer cells was examined by RT-PCR and Western blot. MTT and Transwell assays were used to observe the effect of high Rac1 expression on cell proliferation and invasion ability of pancreatic cancer cells.ResultsRac1 was expressed in pancreatic cancer tissues，and the integral optical density(IOD) was 0.07±0.17，0.37±0.08，0.47±0.07，0.53±0.09 in normal tissues，tissues at stages T1，T2，T3,respectively. Rac1 expression was positively correlated with tumor stage(P<0.01).Rac1 was also expressed in pancreatic cancer cell lines and overexpressed in Panc1. When the effect of Rac1 was neutralized by neutralizing antibody of Rac1 for 24, 48, 72 h, the proliferation was gradually inhibited with IOD of 1.49±0.07，1.53±0.03，1.55±0.04, respectively(P<0.01). The migration/invasion ability was also inhibited by neutralizing antibody(P<0.05).ConclusionRac1 is highly expressed in pancreatic cancer tissues and correlated with tumor stage. The Rac1 is expressed in cancer cell lines, and may increase the proliferation and migration/invasion of cancer cells.

Key words:pancreatic cancer;Rac1;proliferation;invasion

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81472246)；陜西省自然科學基礎研究計劃資助項目(2013JQ4011)

作者簡介：李軍輝，男，1980-02生，博士，副研究員，E-mail:ljh991049@126.com

收稿日期：2016-03-22

中圖分類號：R735.9

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)06-0522-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.008