高滲培養基對椎間盤內髓核細胞活力及代謝的影響

白亦光, 陳巧玲, 劉　康, 楊澤龍, 羅栩偉, 馮　剛

(1川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院骨科，南充　637000； 2川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院腫瘤科； 3川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院組織工程與干細胞研究所； *通訊作者，E-mail:cql166@163.com)

高滲培養基對椎間盤內髓核細胞活力及代謝的影響

白亦光1, 陳巧玲2*, 劉康3, 楊澤龍1, 羅栩偉1, 馮剛3

(1川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院骨科，南充637000；2川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院腫瘤科；3川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院組織工程與干細胞研究所；*通訊作者，E-mail:cql166@163.com)

摘要：目的探討高滲培養基對椎間盤內髓核組織及髓核細胞活力的影響。方法6-7周齡SD大鼠10只，無菌取每只大鼠胸腰段椎間盤9個，置于高滲(410 mOsm/kg)培養基中整體培養，培養前及培養第7，14，21，28天，利用Mitotracker Green熒光探針、免疫組織化學和生物化學方法檢測細胞的活力、椎間盤結構的變化以及髓核組織細胞外基質成分的變化。結果椎間盤組織形態、細胞存活率及髓核細胞外基質成分與新鮮離體椎間盤無統計學差異。髓核細胞存活率熒光強度檢測提示培養后第21天與培養前比較熒光強度明顯降低(7 782±367 vs 10 435±376，P<0.05)。髓核組織內蛋白多糖含量(mg/100 mg)檢測提示培養第21天與培養前相比明顯降低(3.72±0.45 vs 6.35±0.76，P<0.05)。結論在高滲培養基中(410 mOsm/kg)，髓核細胞可以良好存活至少14 d，大鼠髓核組織內蛋白多糖可以有效保持14 d。

關鍵詞：高滲培養基；椎間盤；髓核組織；髓核細胞

椎間盤退行性變(intervertebral disc degeneration，IDD)是目前人類下腰痛的主要病因，如腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥和退變性腰椎側凸等一系列疾病均與其有關[1]。關于IDD的病因和病理生理機制尚未完全明確，一般認為主要是椎間盤細胞和細胞外基質(蛋白聚糖、膠原等)的丟失以及終板的鈣化，改變了椎間盤生物力學機制[2]。目前主要臨床治療方法是外科手術治療，在解除病變節段的同時，又使鄰近節段發生退變，還降低了關聯運動階段的靈活性，增加了鄰近節段的負擔。目前對于椎間盤生物治療的研究主要體現在利用基因工程、細胞工程及組織工程手段來恢復退變椎間盤細胞的數量及生物活性，如使用骨髓間充質干細胞，脂肪干細胞，GDF-5基因干預，體外完整組織工程椎間盤的構建等[3]。但尚沒有一種完整椎間盤培養模型可供觀察。

本實驗擬在體外建立一種椎間盤器官整體培養系統并觀察在此系統中髓核細胞的活力，為今后研究IDD此類疾病探索一種有效的離體器官模型。

1材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑、儀器

6-7周齡SD大鼠10只，近交系，清潔動物，體重約(300±25)g，雌雄不限，由川北醫學院實驗動物中心提供。CO2培養箱箱(美國Thermo公司)，超凈工作臺(美國Airtech公司)，倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)。Ⅱ型膠原免疫細胞化學試劑盒(美國Chondrex公司)，DAB顯色試劑盒(碧云天生物技術公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，DMEM高糖培養基(美國Hyclone公司)。Mitotracker Green分子探針(美國Hyclone公司)。Mitotracker Green(Molecular Probes，Eugene，OR)(濃度5 μmol/L)

1.2椎間盤器官整體獲取及培養

10%水合氯醛(5 ml/kg)麻醉大鼠，無菌操作完整切取包括上、下軟骨終板、纖維環及髓核組織的胸腰段椎間盤整體器官共90個，在操作過程中盡可能的將軟骨終板向鄰近的骨質分離干凈，用含肝素的高滲PBS液充分沖洗后，置入含有滲透壓為410 mOsmol/kg高滲培養液的12孔培養板內，每天換液1次。于培養第0，7，14，21，28天進行以下檢測。

1.3細胞活力的測定

在培養0，7，14，21，28 d各取3個椎間盤，用HBSS液反復漂洗各標本。放入已加入Mitotracker Green分子探針(5 μmol/L)的培養基中，在37 ℃孵箱中共孵育1 h。將椎間盤放入不含熒光染料的新鮮培養基中孵育1 h，以除去未結合的熒光染料。然后，無菌條件下切開椎間盤纖維環，刮出髓核組織，浸入載玻片上的HBSS液中，在熒光顯微鏡下進行觀察，髓核組織中有活力的細胞因被分子探針染色而發出綠色熒光。

1.4組織學及免疫組化

通過病理組織學切片番紅O染色鏡下觀察整體椎間盤的結構，采用免疫熒光染色了解髓核組織內Aggrecan(蛋白聚糖)的表達量，具體方法如下：使用10%多聚甲醛固定，脫鈣液浸泡6 d，沿矢狀位中線切開整體椎間盤，包埋，切片(厚5 μm)，染色觀察，使用倒置顯微鏡觀察并采集圖像。

番紅O染色：切片二甲苯梯度酒精脫蠟至水；蘇木素染色10 min；0.2%亮綠染色10 min；0.1%番紅O染色10 min，1%醋酸酒精分化液分化3 s，樹脂封片后鏡下觀察。

Aggrecan(蛋白聚糖)免疫熒光染色：將上述切片二甲苯梯度酒精脫蠟至水；3%過氧化氫封閉10 min(避光)；微波加熱修復抗原；正常血清封閉處理30 min；添加一抗(小鼠抗兔)4 ℃過夜；添加二抗(羊抗小鼠)37 ℃ 1 h；抗熒光淬滅劑封片；熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.5髓核組織蛋白多糖(sGAG)含量測定

將各時間點椎間盤中髓核組織取出經木瓜蛋白酶1 ml 56 ℃消化24 h；配制1 000 μg/ml硫酸軟骨素溶液：取出數個干凈1.5 ml EP管，按標準做1-100 μg/ml標準液，并做好標記；取木瓜蛋白酶消化的組織混合液0.5 ml，加入100 mmol/L碘乙酸0.5 ml，繼續加入0.5 mol/L Tris 0.5 ml；加入50 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)3 ml；測定標準曲線：取100 μl標準液，加入2.5 ml DMB顯色液，混勻，反應15 s，于525 nm處比色，測吸光度，做標準曲線；DMB顯色：同法測定組織上清液吸光度。根據標準曲線計算樣品sGAG含量。

1.6統計學分析

采用SPSS13.0統計軟件包進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1髓核細胞成活率觀察

Mitotracker Green熒光探針測定顯示：體外培養至第7天，髓核組織內髓核細胞數量較多、活力較好，顯微鏡下表現出較高的熒光強度(見圖1A)；第14天髓核細胞熒光強度出現降低(見圖1B)，第21天時熒光強度進一步下降(見圖1C)；到第28天時顯微鏡下顯示熒光幾乎消失，表明髓核細胞的存活率明顯下降(見圖1D)。髓核細胞不同時期Mitotracker Green熒光定量測定結果見表1。其中第21天時熒光強度較培養第14天明顯降低，有統計學差異(F=5.34，P<0.05)。

2.2椎間盤組織學變化

番紅O染色觀察提示培養第7天、第14天，椎間盤結構完整，與髓核組織界限清晰，髓核組織內可看到完整髓核細胞簇狀分布，染色呈紅色，胞外基質豐富飽滿，纖維環排列有序(見圖2A、B)。培養第21天后髓核組織中細胞含量明顯減少且分布不均勻，形態呈現不規則，纖維環軟骨組織增生，紋理排列紊亂(見圖2C)。培養第28天時髓核組織中主要為纖維軟骨組織，髓核細胞幾乎完全消失，形態進一步呈現不規則狀態(見圖2D)。

圖1　培養第7天、第14天、第21天和第28天Mitotracker Green熒光探針觀察髓核細胞活性 (×40)Figure 1　Cell viability of nucleus pulposus by Mitotracker green fluorescent probe at 7 d, 14 d, 21 d and 28 d after the culture (×40)

時間熒光強度值培養前10435±376培養第7天9976±348培養第14天9899±281培養第21天7782±367*培養第28天7568±298*

與培養前、培養第7，14天比較,*P<0.05

2.3椎間盤組織中蛋白聚糖含量變化

Aggrecan免疫熒光顯示椎間盤組織中蛋白聚糖熒光隨時間延長明顯降低，培養第7,14天髓核組織蛋白聚糖免疫熒光檢測呈現綠色熒光(見圖3A、B)。培養第21天可見熒光含量減少，分布不均勻(見圖3C)。第28天熒光強度減弱更加明顯，髓核組織熒光顯著減少，熒光區域之間被纖維條索狀結構分割(見圖3D)。

圖2　培養第7天、第14天、第21天和第28天整體椎間盤番紅O染色結果 (×40)Figure 2　Safranin O dye results of the whole intervertebral disc after culture for 7 d, 14 d, 21 d and28 d (×40)

圖3　培養第7天、第14天、第21天和第28天免疫熒光觀察椎間盤組織中蛋白聚糖的表達 (×40)Figure 3　Immunofluorescence results of aggrecan content in intervertebral disc tissue after culture for 7 d, 14 d, 21 d and 28 d (×40)

2.4髓核組織蛋白聚糖含量測定

木瓜蛋白酶消化法測得髓核組織中蛋白聚糖含量結果顯示：培養第7天，第14天蛋白多糖含量下降無明顯統計學意義；第21天時與培養前、培養第7，14天相比蛋白聚糖含量下降有明顯統計學意義(P<0.05，見表2)，培養第21天，第28天蛋白多糖含量進行性下降。

時間蛋白多糖含量培養前6.35±0.76培養第7天5.07±0.54培養第14天5.12±0.87培養第21天3.72±0.45*培養第28天2.45±0.32*

與培養前、培養第7，14天比較，*P<0.05

3討論

椎間盤器官培養模型是利用椎間盤自身的三維結構和可調控的培養條件，將完整的椎間盤(包括髓核及其周圍的纖維環和終板)在體外進行整體培養,從而保留了重要的細胞-細胞和細胞-基質的相互作用。近年來國內外學者對椎間盤器官整體培養逐漸重視。椎間盤器官由上、下軟骨終板，中間的纖維環和髓核組織組成，纖維環主要由纖維環細胞及Ⅰ型膠原組成，髓核組織主要由髓核細胞、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖組成[4]。椎間盤髓核及纖維環的營養代謝主要通過軟骨終板的滲透作用得以實現，所以在體外設計這樣的整體器官培養模型對研究下腰痛病因、病理及治療學等方面具有積極的意義。

國外許多學者在取材工程中，盡可能地分離軟骨終板周圍骨質，以縮短營養物質的彌散距離，Ariga等[5]對小鼠的椎間盤進行了器官培養，取材時僅保留了靠近終板1-2 mm厚的椎體骨質；Gantenbein等[6]則在切取羊椎間盤前對椎間盤組織進行了抗凝預處理，防止血凝塊阻塞毛細血管網，從而影響營養物質的彌散。我們則切取包括上、下軟骨終板及難以分離的少量松質骨、纖維環及髓核組織，這一方面有利于體外高滲培養時的營養滲透，而另一方面則保持間盤的結構的完整性。椎間盤的整體結構與功能較大程度地依賴髓核細胞的生存能力及細胞外基質的豐富程度，在椎間盤的生物研究領域已不斷證實，椎間盤的退變最開始發生于髓核細胞的凋亡和髓核組織含水量的下降，在影像學表現為椎間盤高度的下降和MRI上T2相髓核信號的降低。

本研究表明，在高滲的培養液中，髓核細胞及髓核組織能夠存活2周左右，2周后髓核細胞的生存能力出現明顯的下降。髓核組織內細胞及胞外基質的變化與椎間盤整體的功能密切相關，從椎間盤髓核結構方面和Mitotracker Green熒光探針測定髓核細胞成活率方面觀察，兩種結果呈現出同步退變的過程，即髓核細胞活性下降的同時，椎間盤髓核結構也發生一定程度的紊亂。在特定的滲透壓下，體外整體培養的椎間盤可以有效地存活2周，為椎間盤的生物治療提供了簡便易行的模型，在410 mOsm/kg高滲狀態下，培養基內的營養成分通過軟骨終板或者纖維環滲透入髓核組織內部，供給髓核細胞營養，維持2周內髓核細胞的生存。離體培養的整體椎間盤組織相比于體內缺乏力學刺激而產生向外膨脹的應力，人為的高滲培養基可以產生有效的回縮應力對抗膨脹，還可通過改變細胞外基質的滲透性來維持細胞基質代謝平衡或者直接通過提高培養基的滲透壓來模擬椎間盤在體內所處的力學環境，從而維持髓核細胞基質的代謝平衡[7]。

番紅O染色則可對髓核組織內的蛋白聚糖的變化行大體觀察，從實驗結果中可以看到，2周內椎間盤結構完整，與髓核組織界限清晰，有效地維持了髓核組織的形態，表明整體椎間盤在體外可以良好存活。Aggrecan免疫熒光顯示椎間盤組織中蛋白聚糖熒光含量，培養第21天可見熒光含量減少。第28天熒光強度減弱更加明顯，與木瓜蛋白酶消化法測得髓核組織中蛋白多糖含量結果保持了較大的一致，Mitotracker Green熒光探針測定顯示髓核細胞成活率，獲得了熒光定量測定結果，其結果為組織學和免疫組化檢測提供了佐證。所以我們得出了這樣的結果，在410 mOsm/kg高滲狀態下，大鼠椎間盤整體培養中髓核細胞的存活和髓核組織的生物特性可以至少良好地保持2周。

椎間盤器官整體培養可以最大限度地保留髓核細胞間、細胞與基質間及基質內部的結構完整性，也保證了功能方面的完整性，這也是椎間盤器官整體培養相對于孤立的進行髓核、纖維環或者終板的研究有較明顯的優勢所在。在椎間盤器官整體培養基本可行的基礎上，一些研究者不斷完善培養條件試圖獲得更為理想的椎間盤：Risbud等[8]比較了不同亞型TGF-β對基質表達的影響得出TGF-β3對基質表達的促進作用更強，而且提高了細胞的成活力及代謝活性，同時降低了細胞的凋亡率。近期，Koerner等[9]在椎間盤整體培養模型中利用P多肽激活了椎間盤中炎癥通路，并導致了IL-6在椎間盤內的高表達。Li等[10]在大鼠椎間盤整體培養模型中利用芝麻素抑制盤內炎性物質的分泌和細胞外基質分解。可見椎間盤器官的整體培養模型可為椎間盤退行性變的研究提供更加完整的實驗空間，在整體椎間盤中進行實驗研究能夠更加貼近真實的人類椎間盤退變過程。從而為由椎間盤引起的下腰痛提供更為廣闊的研究舞臺。

本實驗室會在本次實驗的基礎上通過進一步在高滲培養基中添加各種生長因子，了解通過培養基成分的改變對髓核組織體外生存的影響，進而了解整體椎間盤器官體外存活的機制，為了解椎間盤退行性變疾病發病機制及治療策略提供更加有益的科學的研究。

參考文獻：

[1]白亦光，韓小偉，張旭乾，等.穿刺抽吸法誘導兔椎間盤退變模型[J].川北醫學院學報，2013，28(2):91-94.

[2]彭寶淦，賈連順，施杞，等.軟骨終板鈣化在椎間盤退變過程中的作用機理[J].中國矯形外科雜志，2000，7(2):147-150.

[3]馮剛.椎間盤退行性變的生物治療研究專題[J].川北醫學院學報，2013，28(2)：89.

[4]Kroeber M,Unglaub F,Guehring T,etal.Effects of controlled dynamic disc distraction on degenerated intervertebral discs:an in vivo study on the rabbit lumbar spine model[J].Spine(Phila Pa 1976),2005,30(2):181-177.

[5]Ariga K,Yonenobu K,Nakase T,etal.Mechanical stress-induced apoptosis of endplate chondrocytes in organ-cultured mouse intervertebral discs:an ex vivo study[J].Spine(Phila Pa 1976),2003,28(14):1528-1533.

[6]Gantenbein B,Grünhagen T,Lee CR,etal.An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates:a feasibility study with ovine caudal discs[J].Spine(Phila Pa 1976),2006,31(23):2665-2673.

[7]Pritchard S,Guilak F.The role of F-actin in hypoosmotically induced cell volume change and calcium signaling in annulus fibrous cells[J].Ann Biomed Eng,200432(1):103-111.

[8]Risbud MV,Di Martino A,Guttapalli A,etal.Toward an optimum system for intervertebral disc organ culture:TGF-3 enhances nucleus pulposus and anulus fibrosus survival and function through modulation of TGF-R expression and ERK signaling[J].Spine (Phila Pa 1976),2006,31(8):884-890.

[9]Koerner JD,Markova DZ,Schroeder GD,etal.The effect of substance p on an intervertebral disc rat organ culture model[J].Spine(Phila Pa 1976),2016:Epub ahead of print.

[10]Li K,Li Y,Xu B,etal.Sesamin inhibits lipopolysaccharide induced inflammation and extracellular matrix catabolism in rat intervertebral disc[J].Connect Tissue Res,2016:Epub ahead of print.

Effect of hypertonic medium on cell viability and metabolism of nucleus pulposus of intervertebral discs

BAI Yiguang1, CHEN Qiaoling2*,LIU Kang3, YANG Zelong1, LUO Xuwei1, FENG Gang3

(1DepartmentofOrthopedics,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China;2DepartmentofOncology,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;3TissueEngineeringandStemCellResearchInstitute，NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:cql166@163.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the effects of hypertonic medium on cell viability and metabolism of nucleus pulposus in the intervertebral discs.MethodsNine thoracolumbar intervertebral discs were harvested from every 6-7-week-old SD rat(n=10) and cultured with hypertonic medium(410 mOsm/kg). Cell viability, structural integrity and proteoglycan content were assessed using Mitotracker Green fluorescent probe, histochemical and biochemical methods at days 0, 7, 14, 21 and 28 after the culture. ResultsThe morphology of the whole intervertebral discs, cell viability and extracellular matrix component of nucleus pulposus at day 14 showed no statistical changes compared with those in fresh intervertebral discs in vitro. However, cell survival fluorescence intensity decreased significantly at day 21 in comparison of that before culture(7 782±367 vs 10 435±376，P<0.05). The proteoglycan content of nucleus pulposus(mg/100 mg) at day 21 markedly reduced in comparison with that before culture (3.72±0.45 vs 6.35±0.76，P<0.05).ConclusionNucleus pulposus cells in the rat intervertebral discs cultured with the hypertonic medium(410 mOsm/kg) could survive at least 14 d. Proteoglycan in nucleus pulposus tissue of rats can effectively keep the richness in 14 d.

Key words:hypertonic medium;intervertebral discs;nucleus pulposus tissue;nucleus pulposus cells

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81171472，81071270，30872614)；四川省教育廳科研基金資助項目(15ZA0216，15ZB0201)；南充市科技局科技支撐項目(14A0017，14A0022)；川北醫學院科研發展計劃基金資助項目(CBY14-A-ZD02，CBY15-A-ZD02)

作者簡介：白亦光，男，1986-07生，碩士，住院醫師，E-mail:baiyiguang@163.com

收稿日期：2016-01-19

中圖分類號：R681.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)06-0531-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.010