Nestin在不同形態包皮和年齡患者中的表達

強濟斌, 蘭曉煦

(山西醫科大學第二臨床醫學院泌尿外科，太原　030001；*通訊作者，E-mail：xiaoxulan1962@163.com)

Nestin在不同形態包皮和年齡患者中的表達

強濟斌, 蘭曉煦*

(山西醫科大學第二臨床醫學院泌尿外科，太原030001；*通訊作者，E-mail：xiaoxulan1962@163.com)

摘要：目的探討巢蛋白(Nestin)在不同形態包皮和年齡中的表達規律。方法收集我院36例包皮標本，其中包皮過長18例，包莖18例，上述兩組包皮患者均排除感染。兩組實驗對象分別分為：6-13歲組，14-16歲組，17-20歲組，>20歲組。采用免疫組織化學方法檢測包皮組織中巢蛋白(Nestin)的表達情況，比較各年齡組包皮過長和包莖患者巢蛋白表達差異。因考慮本實驗樣本量較少，比較14-16歲組,<14歲以及>16歲男性患者包皮中巢蛋白表達情況。結果包皮過長和包莖患者在同年齡組巢蛋白表達差異無統計學意義。男性包皮過長和包莖患者巢蛋白表達在<14歲組均較14-16歲組升高，差異有統計學意義(P=0.000,0.048)。包皮過長和包莖患者巢蛋白表達在>16歲組也較14-16歲組增高，差異也有統計學意義(P=0.043,0.026)。結論巢蛋白可能不是男性人群形成不同形態包皮的重要因素。但男性包皮組織中的巢蛋白表達水平與年齡因素可能有關。

關鍵詞：巢蛋白;包皮;免疫組化;年齡

成年男性包皮有多種不同形態，Cold等[1]把成年男性包皮大致分為4型，即全露型、半露型、包莖型以及包皮過長型。男嬰剛出生時外生殖器呈包莖狀態[2]，此現象多為生理性。但生理性包莖的消退機制目前尚不清楚，大部分男嬰在不斷成長過程中，由于間斷的陰莖勃起和雄激素的刺激，使得在成年后包皮松解外翻。成年男性最常見的兩種外生殖器畸形是包莖(phimosis)和包皮過長(redundant prepuce)。包皮過長指包皮不能使陰莖頭外露，但可以外翻，包莖指包皮口太小，呈緊箍狀態，不能外翻[3]。包莖和包皮過長不僅影響男性陰莖的正常發育，而且易誘發男性泌尿系感染以及女性生殖系統疾患[4]。包皮在組織學上分為5層，由內向外分別是黏膜層、固有層、肉膜肌層、真皮層和表面上皮層。包皮上皮細胞中含有多種細胞蛋白，如肌動蛋白、巢蛋白、波形蛋白、結蛋白等中間絲蛋白。巢蛋白(Nestin)是間質細胞中最主要的中間纖維蛋白，它在多種細胞中表達，如成肌細胞、骨骼肌細胞、環層小體等[5-7]，Nestin屬于第Ⅵ類中間絲細胞骨架蛋白,主要在未分化、具有增殖分裂能力的細胞胞質中表達[8，9]，并與微管、微絲共同形成一個細胞支架網絡，維持細胞完整性。本研究采用免疫組化方法觀察Nestin在不同形態包皮和不同年齡中的表達，探索不同形態包皮的發病機制，為臨床行包皮環切手術時機提供重要依據。

1材料與方法

1.1一般資料

本實驗取自我院住院和門診患者36例，其中包皮過長組：18例，年齡9-48歲，平均(22.9±9.84)歲;包莖組：18例，年齡8-28歲，平均(14.3±5.04)歲。所有包皮過長患者在陰莖勃起狀態下，陰莖頭部分外漏或者完全不能外漏。所有包莖患者包皮都不能外翻，但包皮內板與陰莖頭無粘連。上述兩組包皮患者均排除感染，因為它可能會影響實驗結果。上述所有患者在局麻下行包皮環切術，包皮標本用10%福爾馬林統一固定保存，采取相同取材部位，即：包皮背部正中內、外板交界處全層組織，然后用常規石蠟包埋,組織切片厚度為2 μm。

1.2免疫組化染色方法

主要試劑：高壓兔抗巢蛋白單克隆抗體(北京中杉公司)；采用基于聚合物的新型免疫組化檢測系統，Maxvision試劑盒，顯色劑為DAB(北京中杉公司)。一抗采用即用型抗巢蛋白單克隆抗體。

染色方法參照陳罡等[10]的報道，簡述如下：①石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min。②對組織抗原進行Nestin檸檬酸高壓修復(pH 6.0),加熱時間為10-15 min。③每張切片加1滴第一抗體，使抗體全部覆蓋組織切片，室溫下孵育60 min。④PBS沖洗3次，每次3-5 min。除去PBS液，每張切片加1滴即用型Maxvision試劑，室溫下孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。⑤除去PBS液，每張切片加新鮮配制的DAB，鏡下控制顯色結果。⑥自來水沖洗，蘇木素-伊紅復染，PBS沖洗返藍。切片經過梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封片固定。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3免疫組化染色評定標準

標本中出現棕色顆粒即Nestin陽性表達。本文將包皮上皮細胞的Nestin表達程度進行半定量分析測定。陽性表達的上皮細胞胞質和胞膜為棕黃色，巢蛋白主要表達于胞膜，部分在胞質。采用HPIAS21000高清晰彩色病理圖像測量系統對切片進行分析。以組織切片的平均灰度值為定量參數進行統計分析，測定巢蛋白的表達。所有免疫組化染色的標本由1名病理醫生在不被告知標本臨床資料的情況下進行分析。

1.4統計學分析

2結果

2.1不同包皮形態中巢蛋白表達

36例包皮標本中，上皮細胞的胞膜和少量胞質中Nestin蛋白表達呈不同程度陽性，包皮表皮細胞中Nestin的表達在各年齡組不同包皮形態中具有一定的差異(見圖1)。男性包皮過長和包莖上皮細胞內巢蛋白表達在14-16歲組比其他年齡組都低。在同年齡組中，包皮過長和包莖患者巢蛋白的表達均無統計學意義(P>0.05，見表1)。

表1包莖組與包皮過長組Nestin表達水平比較

年齡 包皮過長組包莖組nx±snx±sP6-13歲2142.35±1.9311135.67±10.430.07914-16歲2131.21±5.123132.60±9.000.56217-20歲5136.70±9.962139.81±7.890.358>20歲9148.45±10.622145.93±10.840.726

2.2兩組包皮中巢蛋白表達與年齡關系

因考慮本實驗樣本量較少，組別合并為三組，男性在14歲之前，包皮過長和包莖中巢蛋白表達較14-16歲較高，差異有統計學意義(P=0.000,0.048)。16歲之后包皮過長組和包莖組巢蛋白表達也較14-16歲增高，差異也有統計學意義(P=0.043,0.026，見表2)。

表2不同年齡和不同形態包皮中巢蛋白表達比較

年齡組<14歲14-16歲>16歲nx±snx±snx±s包皮過長組2142.35±1.93**2131.21±5.1214133.45±10.1*包莖組11135.67±10.43*3132.60±9.004148.62±7.86*

與14-16歲相比，*P<0.05，**P<0.01

3討論

Nestin是最新發現的分子量最大的中間絲蛋白,主要在未分化、具有分裂能力的細胞胞質中表達，其表達具有嚴格的時空性。Nestin主要參與細胞結構支撐，決定細胞形態、創傷愈合以及參與細胞纖維化的過程。而Nestin參與細胞纖維化過程與波形蛋白(Vimentin)、結蛋白(Destin)的表達有著密切關系，因為Nestin是波形蛋白、結蛋白的先導蛋白。在參與細胞纖維化過程中，成纖維細胞首先表達Nestin后，其他中間絲蛋白如波形蛋白、結蛋白才會相繼表達，這些蛋白相互作用執行前體細胞內在功能，誘導前體細胞向成熟細胞分化。Liu等[11]研究表明Nestin、Vimentin在腎小球上皮細胞的表達決定尿蛋白的嚴重程度，主要因為二者共同參與細胞收縮。此外董志強等[12]研究表明Vimentin參與包皮內成纖維細胞轉化成肌纖維細胞，后者表達α-平滑肌肌動蛋白，具有收縮和遷移能力。而Nestin又是Vimentin等中間絲蛋白的前體，故筆者認為Nestin在包皮組織中表達明顯增高可能導致波形蛋白的增加，波性蛋白的增加促使包皮口表皮細胞收縮和遷移，從而導致包莖和包皮過長。

調查研究發現我國男性性成熟年齡大約在14-16歲[13]，男童發育到14-16歲時幾乎所有生理性包莖消失,龜頭可以上翻外露。故我們可以認為男性在性成熟之前包莖多為生理性的，因生理性包莖有自行消退的可能性，故無需手術干預。本實驗從臨床治療角度將兩組實驗對象分為:<14歲組，此年齡段包莖多為生理性的，因生理性包莖有自行消退的可能，無需手術干預。14-16歲組是男性性成熟期的過渡階段。17-20歲組，此年齡段包皮過長和包莖，如無明顯泌尿系感染、包皮龜頭炎等并發癥，可暫不必行手術治療。20歲之后包莖多為病理性，病理性包莖已失去自行轉化為正常包皮的可能性，故一般都行外科治療。本免疫組化染色結果顯示，男性包皮中的表皮細胞有Nestin的陽性表達,在以往研究中發現包皮的表皮細胞中有結蛋白、肌動蛋白的表達[14],它們有相互協同、相互促進發揮收縮和改變細胞形態的作用。通過SPSS17.0統計學分析，36例包皮標本中表皮細胞內Nestin的表達呈不同程度的陽性，但其表達在同年齡組中不同的包皮形態差異無統計學意義(P>0.05)，由此推斷巢蛋白可能不是形成男性不同形態包皮的重要因素，或者巢蛋白可能只是包皮形成過程中的一個影響因素而不是決定性因素。為進一步明確巢蛋白表達在14-16歲組是否較其他組低，因考慮到本實驗樣本量較少，避免因偶然誤差造成實驗結果偏倚，故將超過16歲患者標本合并，以增強說服力。合并后研究結果顯示，男性在14歲之前包皮過長和包莖中巢蛋白表達較14-16歲較高，差異有統計學意義(P=0.000,0.048)。16歲之后包皮過長和包莖組巢蛋白表達也較14-16歲增高，差異也有統計學意義(P=0.043,0.026)，可見男性無論在14歲之前還是16歲之后，巢蛋白的表達都較14-16歲組高，雖然這兩組標本都顯示巢蛋白表達有增高趨勢，但實際臨床意義有所不同，14歲之前生理性包莖可能與巢蛋白表達增高有關，但因生理性包莖有自行消退的可能性，故暫不需要手術干預。而16歲之后，巢蛋白表達增加多為病理性增加，持續的病理性包莖可能造成包皮內巢蛋白持續增高，病理性包莖因失去自行轉化為正常包皮，在臨床上為避免相關并發癥的發生，故一般建議手術治療。對于男性在14-16歲時，無論是包皮過長還是包莖，其巢蛋白的表達都是各年齡段最低的，這一現象的解釋目前尚不清楚。導致這種現象的原因可能有兩種:其一,本實驗的樣本量太少，統計結果存在偏倚;其二,缺乏正常男性包皮作為對照。因本實驗涉及人體標本，存在倫理道德問題，實驗方法無法進一步完善，也不能動態觀察，生理性包莖無需手術治療待其自然消退后，包皮內巢蛋白表達情況。但我們可以在今后的研究中，動態觀察雄性動物從幼齡到性成熟過程中，包皮內巢蛋白表達情況，用來彌補本實驗的不足，使本實驗結果更有說服力。雖然目前我們尚不清楚正常包皮組織中巢蛋白表達情況，但有相關研究[12，13]表明，男性在14-16歲時，無論包莖還是包皮過長，包皮組織中波形蛋白和結蛋白的表達與其他各年齡組相比都是最低的。而巢蛋白又是波形蛋白和結蛋白的先導蛋白，故我們可以推斷，巢蛋白也可能在男性14-16歲時表達水平較其他年齡組低。本實驗結果也印證了這樣的結論。同時本實驗研究發現，包皮表皮細胞中的Nestin的表達在13歲以前一直保持著較高的水平,這可能與生理性包莖和性成熟過程保持著緊密聯系,說明Nestin在男性外生殖器的發育成熟過程中,特別是生理性包莖中可能起到一定作用。而16歲之后患者的包莖多呈病理性包莖，此年齡段包皮表皮細胞中Nestin表達水平明顯增高，說明巢蛋白在病理性包莖形成過程中也起到一定作用，這可能與Nestin參與包皮組織纖維化有關，導致包皮口狹小使包皮不能外翻。此外近期研究發現,成體分化發育成熟的上皮細胞在炎癥、創傷等因素的作用下,通過EMT產生間質纖維母細胞,參與組織纖維化的形成[15]。包皮過長和包莖患者的包皮內板上有不同程度的慢性炎細胞浸潤，嚴重情況下會伴有不同程度的血管充血，可見包皮過長和包莖上皮細胞出現不同程度纖維化可能也與慢性炎癥刺激有關。故我們可以認為,人類包皮上皮細胞可能在Nestin和慢性炎癥的共同刺激作用下轉化為成纖維細胞(myofibroblast,MyoFb)，使包皮口狹小，導致病理性包莖的發生。關于包皮組織中Nestin表達水平的調節機制是一個值得深究的課題。有相關研究顯示，TGF-α能夠促進Nestin基因表達[16]，TGF-β下調Nestin基因表達，另外鋅的缺乏也可導致巢蛋白表達下降。

綜上所述，包皮組織中巢蛋白表達水平的高低對包皮解剖形態的形成可能無關，但男性包皮組織中的巢蛋白表達水平與年齡因素可能有關。

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作者簡介：強濟斌，男，1988-11生，碩士，E-mail：1032750266@qq.com

收稿日期：2015-11-20

中圖分類號：R697.1

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)06-0547-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.014