半胱氨酸蛋白酶參與調節ephrinBs/EphBs信號通路活化誘發神經病理性疼痛研究

楊　梅，李　建，楊　蕊，王浩偉，袁紅斌

半胱氨酸蛋白酶參與調節ephrinBs/EphBs信號通路活化誘發神經病理性疼痛研究

楊梅，李建，楊蕊，王浩偉，袁紅斌

[摘要]目的觀察小鼠鞘內注射酪氨酸激酶受體EphB1及其配體ephrinB2-Fc對其神經病理性疼痛行為的作用及對半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)表達水平的影響。方法昆明小鼠36只，采用數字表法隨機分為假手術+生理鹽水組(Sham+NS，n=6)、假手術+酪氨酸蛋白激酶受體B1組(Sham+EphB1，n=6)、坐骨神經壓迫性損傷+生理鹽水組(CCI+NS，n=12)以及CCI+EphB1組(n=12)，于制模前1 d及制模后1、3、5、7、14 d時測定各組小鼠的機械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)，并于第5天將CCI+NS和CCI+EphB1組中的6只小鼠處死，取L4-5段脊髓，采用免疫組化方法測定caspase-3陽性細胞數的含量。 另取昆明小鼠24只，采用數字表法隨機分為4組，每組6只，即空白對照組、生理鹽水對照組(NS, 鞘內注射5 μl NS)、ephrinB2-Fc 0.1 μg組(注射濃度0.02 g/L，體積5 μl)、ephrinB2-Fc 0.5 μg組(注射濃度0.1 g/L，體積5 μl)。于給藥前3 h和給藥后3、6、9、12、24、48 h測定各組小鼠MWT和TWL，術后48 h取L4-5段脊髓，采用免疫組化方法測定脊髓中caspase-3陽性細胞數的含量。結果在CCI模型中，與Sham+NS和Sham+EphB1比較，CCI+EphB1與CCI+NS 組術后第1、3、5、7 d MWT及術后第3、5、7 d TWL疼痛閾值明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與CCI+NS相比，CCI+EphB1組MWT和TWL顯著提高， caspase-3陽性細胞數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。與空白對照組及NS對照組相比，ephrinB2-Fc 0.1 μg、0.5 μg組MWT和TWL顯著降低， caspase-3陽性細胞數的含量明顯增多，差異均有統計學意義(P<0.05)，且濃度越高痛閾值越低，陽性細胞數越多。結論鞘內注射ephrinB2-Fc、EphB1可分別引起小鼠機械痛敏和熱痛敏的升高和降低，其機制可能與調節caspase-3表達變化有關。

[關鍵詞]神經病理性疼痛；半胱氨酸蛋白酶3；ephrinB2-Fc ；EphB1 ；鞘內注射

神經病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是指由中樞或者外周神經系統損傷和病變所引起的一種疼痛綜合征，以自發性疼痛、痛覺過敏和疼痛超敏為主要表現[1]，目前發病機制不明，但已成為臨床亟待解決的難題之一[2]。新近研究證實，軸突導向因子參與了神經病理性痛的病理生理過程，其中，受體型酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinase,RTKs)亞家族Ephs及其配體ephrins在成年大鼠神經組織，尤其是傷害性信息調制相關的脊髓后角I-III板層以及脊神經節的中小直徑的神經元中有表達[3-4]，并在疼痛調節及炎癥反應等多種病理生理過程中發揮重要作用。Ephs分為EphA(A1～A8)和EphB(B1～B6)兩大亞家族，其配體分別為ephrinA(A1～A5)和ephrinB(B1～B6)。除此之外，還有研究發現，神經元凋亡也與神經病理性疼痛關系密切。 de Novellis 等[5]發現 ，阻滯谷氨酸mGlu5受體可減少凋 亡基因的表達及凋亡狀態，從而減輕痛覺過敏,脊髓背角神經元的凋亡對神經病理性疼痛起著重要作用[6]。而caspase-3是半胱氨酸蛋白酶caspase家族的一員，是細胞凋亡的關鍵酶，那么在ephrinBs/EphBs信號通路誘發的神經病理性疼痛的過程中，caspase-3調節的神經元凋亡是否發揮作用還需進一步研究。因此，本研究以正常小鼠和坐骨神經結扎模型(CCI)小鼠為對象，對其鞘內注射ephrinB2-Fc(Fc標記)和EphB1來觀察、明確ephrinBs/EphBs信號通路在神經病理性疼痛中的作用及其此過程中caspase-3的表達變化，從而探討caspase-3在ephrinB2/EphB1引起疼痛過程中可能發揮的作用。現報道如下。

1材料與方法

1.1動物來源與主要試劑雄性昆明小鼠，體質量22～25 g，購自第二軍醫大學實驗動物中心[動物生產許可證號SCXK(滬)2012- 0003，使用許可證號SYXK(滬)2012- 0003]。ephrinB2-Fc購自R&D公司；小鼠EphB1/Aek5蛋白購自SB公司；兔抗caspase-3購自Cell Signaling公司；羊抗兔IgG二抗購自Abcam公司。多聚甲醛(PFA)、PBS等其他常用試劑均由第二軍醫大學附屬東方肝膽外科醫院疼痛診療教研室提供。Von Frey細絲購自美國Stoelting公司，熱痛刺激儀ME-410C購自中國醫學科學院生物醫學工程研究所。

1.2鞘內給藥及CCI動物模型的制備小鼠按簡化后的Hylden和Wilcox[7]方法鞘內給藥：腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，定位L6并剪毛、消毒。按壓小鼠腰骶兩側固定，自L5-6棘突間隙進針，以鼠尾突然出現側向擺動為進針成功標志。注射用10 μl微量進樣器進行，注射容積為5 μl，注射時間為10 s，留針20 s。 36只雄性小鼠隨機分為4組，參考Bennett等[8]的方法建立左后肢CCI模型。小鼠稱質量后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，俯臥位固定于手術臺上，暴露出坐骨神經主干，用4-0鉻制腸線環繞神經干分別做 4個輕度結扎環，間距1 mm，結扎強度以引起小腿肌肉輕度顫動反應但不影響神經血運為宜。局部敷以青霉素粉，縫合肌筋膜及各層組織后縫合皮膚。假手術組只暴露坐骨神經，不做神經結扎。術畢將大鼠放入底部鋪有熱毯的塑料盒中待其自由蘇醒，后于安靜、溫暖環境自由喂養。

1.3實驗分組及處理取36只雄性昆明小鼠，隨機分為4組：(1)假手術(Sham)+生理鹽水(NS)對照組(n=6)，鞘內注射NS，0.5 h后暴露左后肢坐骨神經主干，但不予結扎，后逐層縫合；(2)Sham+磷酸化酪氨酸蛋白激酶受體B1(EphB1)組(n=6)，鞘內注射EphB1 0.1 g/L，0.5 h后暴露左后肢坐骨神經主干，但不予結扎，后逐層縫合；(3)坐骨神經壓迫性損傷(CCI)+NS組(n=12)，鞘內注射NS，0.5 h后暴露左后肢坐骨神經主干并結扎，后逐層縫合；(4)CCI+EphB1組(n=12)，鞘內注射EphB1 0.1 g/L，0.5 h后暴露左后肢坐骨神經主干并結扎，后逐層縫合。各組小鼠均于術前1 h測基礎痛閾值，術前0.5 h行鞘內注射，注射劑量均為5 μl，術后第1、3、5、7、14天測定小鼠的機械性縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)，其中CCI+NS和CCI+EphB1組在術后第5天將其中6只處死灌流取L4-5段脊髓做免疫組化，剩余6只繼續參與后續行為測定。另取24只昆明小鼠，隨機分為4組(每組6只)：(1)空白對照組，不做任何處理，只在相應的時間點測定MWT、TWL和caspase-3；(2)NS對照組，鞘內注射 NS；(3)ephrinB2-Fc 0.1 μg組，鞘內注射ephrinB2-Fc 0.02 g/L；(4)ephrinB2-Fc 0.5 μg組，鞘內注射ephrinB2-Fc 0.1 g/L。各組注射劑量均為5 μl，于測定完MWT和TWL基礎值(術前3 h)后1 h給予鞘內注射相應溶劑，之后分別于3、6、9、12、24、48 h測定MWT和TWL，并于48 h測定完所有數值后將小鼠處死，灌流，取L4-5段脊髓做免疫組化染色。

1.4行為學測定機械痛測定參照Dixon[9]的測試方法，Von Frey纖維細絲測定MWT，將一有機玻璃箱(20 cm×25 cm×15 cm)置于金屬篩網上，小鼠放置于玻璃箱中，待小鼠在有機玻璃箱中適應30 min后，用Von Frey纖維絲垂直刺激小鼠后肢足底中部，持續時間≤4 s，小鼠出現抬足或者舔足行為視為陽性反應，否則為陰性反應。測定首先從1.0 g開始，4.0 g結束，當該力度的刺激不能引起陽性反應，則給予相鄰大一級力度的刺激；如果出現陽性反應則給予相鄰小一級力度的刺激，如此連續進行，直至出現第2次陽性和陰性反應的騎跨，再連續測定4次。每次刺激間隔30 s，以此向下推算小鼠50%縮足閾值。

熱痛測定按Hargreaves法[10]測定TWL，將有機玻璃箱(7 cm×9 cm×11 cm)置于3 mm厚的玻璃板上，將小鼠放入其中并適應1 h，后用熱痛刺激儀照射小鼠足底，照射開始至小鼠出現抬腿回避時即為TWL。自動切斷時間為20 s，以防止組織損傷。熱刺激強度在整個實驗中維持一致。每只動物測定5次，每次間隔3 min，取后3次平均值為小鼠TWL值。

1.5免疫組織化學染色按實驗安排時間點及個數取小鼠脊髓背角測定caspase-3陽性細胞數的變化。所有小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后開胸，分離暴露心臟，用事先將針頭磨平的頭皮針插至小鼠左心室，剪破右心耳，4 ℃的0.1 mol/L PBS 40 ml快速沖洗，繼之以4 ℃ 4%多聚甲醛溶液(內含0.1 mol/L PBS，pH7.4)60 ml灌注固定，后取L4-5脊髓，在4 ℃ 4%多聚甲醛中固定8 h，然后石蠟包埋，每個標本于石蠟切片機上切取6張(同一部位)，片厚5 μm。免疫組織化學染色采用ABC復合物(1∶200)室溫30 min，最后用DAB/H2O2溶液進行呈色反應。用0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。每只小鼠取6張脊髓切片染色(其中1張用于陰性對照染色)，在脊髓背角淺層先于20×10倍光鏡下觀察，然后用MoticB5顯微攝像系統(MotieChina，北京)進行圖片采集，后在圖片上以中央管為標志，橫豎均垂直90°觀察約1/4脊髓即一側脊髓背角內caspase-3的陽性細胞數量，每個分組統計5張切片的數量，匯總后求平均數得所需結果。

1.6統計學處理計量數據采用均數±標準差(x±s)表示，采用SPSS 21.0統計軟件進行處理。各組術前痛的比較采用單因素方差分析；術后各組機械痛和熱痛的比較采用重復測量資料方差分析。各組小鼠在CCI前后疼痛的比較以及caspase-3免疫組化結果變化的比較采用單因素方差分析。檢驗水平α為0.05。P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1鞘內注射EphB1對CCI小鼠痛閾值及脊髓背角凋亡的影響

(1)鞘內注射EphB1對CCI模型小鼠熱痛及機械痛閾值的影響與鞘內注射前比較，Sham+NS組與Sham+Eph組小鼠的MWT和TWL差異均無統計學意義(P>0.05)。與Sham+NS組和Sham+Eph組比較，CCI+NS和CCI+Eph組小鼠MWT、TWL降低，差異有統計學意義(P<0.05)，根據均值可得在第5天痛閾值達到最低，14 d接近正常； CCI+Eph組與CCI+NS組小鼠MWT、TWL明顯有所提高，即機械痛及熱痛均減輕，第3、5、7天尤為明顯。結果提示，在CCI模型中，鞘內注射EphB1可以明顯減輕CCI小鼠3～7 d機械痛及熱痛閾值。見圖1、2。

注：與Sham+NS及Sham+Eph組比較，aP<0.01；與CCI+NS組比較，aP<0.05圖1　鞘內注射EphB1的CCI模型小鼠各測試點的機械痛閾值(n=6)

注：與Sham+NS及Sham+Eph組比較，aP<0.05；與CCI+NS組比較，aP<0.05圖2　鞘內注射EphB1的CCI模型小鼠各測試點的熱潛伏期(n=6)

2.1.2鞘內注射EphB1對CCI模型小鼠脊髓背角caspase-3表達的影響免疫組化染色結果顯示CCI+Eph組與CCI+NS組小鼠相比，陽性細胞數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。以上結果綜合提示，CCI模型組小鼠鞘內注射EphB1可明顯提高疼痛閾值并減少Caspse-3陽性細胞表達。

注：與CCI+NS比較，CCI+Eph組陽性細胞數明顯減少。A：CCI+Eph組； B：CCI+NS組圖3　CCI各組小鼠脊髓背角caspase-3免疫組化圖(HE×200)

2.2鞘內注射ephrinB2-Fc對正常小鼠痛閾值及脊髓背角凋亡的影響

2.2.1鞘內注射ephrinB2-Fc對正常小鼠熱痛及機械痛閾值的影響與鞘內注射前比較，空白對照組與NS對照組小鼠無明顯差異(P>0.05)。 與空白對照組或NS對照組相比，鞘內注射0.5 g/L或0.1 g/L ephrinB2-Fc會導致熱痛閾值和機械痛閾值隨時間變化的降低，且濃度越高痛閾值降低越明顯，恢復越慢，其中痛閾值在鞘內注射后6 h達到最低(P<0.01)，24 h后回升，48 h基本接近正常，該結果提示鞘內注射ephrinB2-Fc可引起時間及劑量依賴性的疼痛反應。見圖4、5。

注：與空白對照線及對NS對照組比較，aP<0.01；與ephrinB2-Fc 0.1 g/L組比較，aP<0.01圖4　鞘內注射ephrinB2-Fc的正常小鼠各測試點的機械痛閾值

注：與空白對照組及NS對照組相比，aP<0.01；與ephrinB2-Fc 0.1 g/L組相比，aP<0.01圖5　鞘內注射ephrinB2-Fc的正常小鼠各測試點的熱潛伏期

注：A為NS對照組；B為空白對照組；C為ephrinB2-Fc 0.02 g/L組；D為ephrinB2-Fc 0.5 g/L組圖6　正常小鼠鞘內注射ephrinB2-Fc后脊髓背角caspase-3免疫組化HE染色結果(×200)

2.2.2鞘內注射ephrinB2-Fc對正常小鼠脊髓背角caspase-3表達的影響免疫組化染色顯示(圖6、7)空白對照組與NS對照組小鼠caspase-3陽性細胞數無明顯差異(P>0.05)。與空白對照組或NS對照組小鼠相比，鞘內注射0.02 g/L或0.1 g/L ephrinB2-Fc的caspase-3陽性細胞數明顯增多，且注射濃度越高陽性細胞數越多(P<0.01)。

注：與空白對照組及NS對照組比較，aP<0.05；與ephrinB2-Fc 0.1 g/L組比較，aP<0.05圖7　正常小鼠鞘內注射ephrinB2-Fc后脊髓背角caspase-3免疫組化指數(n=6)

3討論

EphB/ephrinB參與脊神經節段性組織[11]，在脊髓和脊神經的發展中持續表達[12]，通過正向與逆向傳導通路調控樹突棘的細胞骨架促進樹突棘的生長間接誘導NPP的產生[13]，包含軸索導向、血管發生、組織結構的形成、細胞遷移以及樹突形態和突觸的發生等多種生物功能[14]。近有研究證實在新生小鼠鞘內或足底注射ephrinB1-Fc可引起小鼠時間及劑量依賴性的痛覺過敏，術后2～8 h尤為明顯，持續約24 h后基本接近正常[15]，這與本研究中鞘內注射ephrinB2-Fc后出現與基礎值相比的MWT和TWL降低，6～12 h明顯，24 h開始恢復，且濃度越高疼痛越重、恢復越慢的結果基本一致。該現象可能與脊髓星形膠質細胞參與疼痛調節，通過C纖維誘發脊髓背角神經元的長時程增強(LTP)及降低LTP的刺激閾值有關[16]。另外，直接進行鞘內注射作用于中樞也保證了效果的確切性，比外周注射更有優勢，更易誘發疼痛的產生。CCI模型小鼠鞘內注射EphB1，發現CCI+NS組小鼠疼痛閾值在第5 d達最低，后逐漸回升，其中CCI+EphB1組小鼠與CCI+NS組相比MWT和TWL均上升，疼痛減輕，說明EphB1與ephrinB1一樣參與疼痛的產生過程。

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子。關于caspase-3在疼痛中的作用的研究，Scholz[17]等就有神經病理性疼痛及炎癥性疼痛模型上發現神經元凋亡的相關報道，同時發現在疼痛刺激下caspase-3表達上調。基于上述理論不難發現，caspase-3在多種類型的疼痛中均發揮作用，那么caspase-3與ephrinBs/EphBs信號通過誘發的疼痛關系怎樣，筆者提出如下假設：caspase與疼痛關系密切，是NPP中的調節分子，并且該調節作用同樣適用于ephrinBs/EphBs信號通路引發的疼痛。在結果中可見，ephrinB2-Fc誘發的疼痛模型中隨著小鼠疼痛的產生，脊髓caspase-3陽性細胞數的含量明顯比NS和空白對照組增多，且隨著時間及濃度的增加小鼠的疼痛也增加，呈現出時間及劑量依賴性；在CCI+NS組與CCI+Eph組中，后者caspase-3表達減少，說明EphBs在減輕疼痛的過程中可能通過caspase-3發揮作用。上述結果間接驗證了假設的合理性。

綜上所述，不難得出結論，ephrinB2/EphB1信號通路參與疼痛過程，其中ephrin引起疼痛而Eph可減輕疼痛，并且此信號通路是通過caspase-3機制發揮作用，這一理論提示脊髓背角神經元的凋亡可能是ephrinB2/EphB1信號通路作用于疼痛的機制之一，該通路將成為臨床治療疼痛的又一新靶點。

[參考文獻]

[1]Kunihiro N, Aya N, Sosuke O, et al. P2X4 receptor expression in a rat model of trigeminal neuropathic pain[J].Neuroreport , 2010,21(8):559-563. DOI: 10.1097/WNR.0b013e32833980b2.

[2]Attal N. Neuropathic pain: mechanisms, therapeutic approach, and interpretation of clinical trials[J].Continuum(MinneapMinn),2012,18(1):161-175. DOI:10.1212/01.CON.0000411564.41709.2d.

[3]呂正濤，牟子君，李熳. 軸突導向因子與疼痛之間關系的研究進展[J]. 中國醫藥導報，2014,10(21):34-37. DOI: 10.3969/j.ism.1673-7210.2013.21.010.

[4]de Wit J, Verhaagen J. Proteoglycans as modulators of axon guidance cue function[J]. Adv Exp Med Biol , 2007,600(7):73- 89.DOI: 10.1007/978-0-387-70956-7_7.

[5]de Novellis V, Siniscalco D, Galderisi U, et al.Blockade of glutamate mGlu5 receptors in a rat model of neuropathic pain prevents early over-expression of pro-apoptotic genes and morphological change in dorsal horn lamina II[J]. Neuropharmacology,2004,46(4):468-479.

[6]Sekiquchi M, Sekiquchi Y, Konno S, et al. Comparison of neuropathic pain and neuronal apoptosis following nerve root or spinal nerve compression[J]. Eur Spine J, 2009,18(12):1978-1985. DOI: 10.1007/s00586-009-1064-z.

[7]Hylden JL, Wilcox GL. Intrathecal morphine in mice: a new technique[J]. Eur J Pharmacol,1980,67(2-3):313-316.

[8]Bennett GJ, Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man[J].Pain,1988,33(1):87- 107. DOI: 10.1016/0304-3959(88)90209-6.

[9]Dixon WJ． Efficient analysis of experimental observations[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol，1980,20:441-462 . DOI: 10.1146/annurev.pa.20.040180.002301.

[10] Hargreaves K, Dubner R, Brown F, et al. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia[J].Pain,1988,32(1):77-88.DOI: 10.1016/0304-3959(88)90026-7.

[11] Yu LN, Zhou XL, Yu J,et al. PI3K contributed to modulation of spinal nociceptive information related to ephrinBs/EphBs[J]. PLoS ONE, 2012,7(8):e40930. DOI: 10.1371/journal.pone.0040930.

[12] Barthet G, Dunys J, Shao Z, et al. Presenilin mediates neuroprotective functions of efnB and BDNF and regulates ligand-induced internalization and metabolism of EphB2 and TrkB receptors[J]. Neurobiol Aging,2013 34(2): 499-510. DOI: 10.1016/j.neurobiolaging.2012.02.024.

[13] Krull CE, Lansford R, Gale NW, et al. Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration[J]. Curr Biol, 1997,7(8):571-580.

[14] 黃小麗，彭彬.突觸可塑性與神經病理性疼痛[J].中國疼痛醫學雜志,2014,20(9):655-657. DOI:10.3969/j.issn.1006-9852.2014.09.012.

[15] Ruan JP, Zhang HX, Lu XF, et al．EphrinBs/EphBs sisllaling is involved in modulation of spinal nocieeptive processing through a mitogen-activated protein kinases-dependent mechanism[J]．Anesthesiology,2010，112(5)：1234-1249． DOI: 10.1097/ALN.0b013e3181d3e0df.

[16] Song XJ, Zheng JH, Cao JL, et al. EphrinB-EphB receptor signaling contributes to neuropathic pain by regulating neural excitability and spinal synaptic plasticity in rats[J]. Pain, 2008, 139(1):168-180.DOI: 10.1016/j.pain.2008.03.019.

[17] Scholz J, Broom DC, Youn DH, et al.Blocking caspase Activity Prevents Transsynaptic Neuronal Apoptosis and the Loss of Inhibition in Lamina II of the Dorsal Horn after Peripheral Nerve Injury[J]. J Neurosci,2005,25(32):7317-7323.

(本文編輯：張陣陣)

Research on the role of caspase-3 in the regulation of neuropathic pain induced by ephrinBs/EphBs signal pathway in mice

Yang Mei, Li Jian, Yang Rui, Wang Haowei, Yuan Hongbin

(DepartmentofAnesthesiology,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of intrathecal ephrinB2-Fc and EphB1 treatment on the neuropathic pain and the expression level of caspase-3 in dorsal horn of spinal cord in mice.Methods A total of 36 KM mice were evenly randomized into 4 groups: the Sham surgery + normal saline control group (or the Sham + NS group) (n=6), the Sham surgery + EphB1 group (or the Sham+ EphB1 group)( n=6), the CCI + NS group(n=12)and the CCI + EphB1 group(n=12). Mechanical withdrawal threshold (MWT)and thermal withdrawal latency(TWL)were detected one day before and 1, 3, 5, 7 and 14 days after the development of the model. Then, at day 5, 6 mice from the CCI+NS and CCI+EphB1 groups were sacrificed, and L4-5 segments of the spinal cord were collected for the detection of caspase-3 positive cell counts by immunohistochemistry. Another 24 KM mice were taken for study and they were randomly divided into the 4 groups, i.e. the blank control group, normal saline control group (intrathecal injection of 5 μl NS), the 0.1 μg ephrinB2-Fc group (at a dosage of 0.02 g/L, volume 5 μl) and the 0.5 μg ephrinB2-Fc group(at a dosage of 0.1 g/L, volume 5 μl). MWT and TWL of various groups were detected 3 hours before medication and 3, 6, 9, 12, 24 and 48 hours after medication. Forty-eight hours after surgery, L4-5 segments of the spinal cord were collected for the detection of caspase-3 positive cell counts by immunohistochemistry.ResultsIn the CCI+EphB1 and CCI+NS groups of the CCl model, the MWT levels at day 1, 3, 5 and 7 after surgery and TWL levels at day 3, 5 and 7 after surgery were all significantly decreased, as compared with those of the Sham+NS and Sham+EphB1 groups (P<0.05). As compared with the blank control and NS control groups, the expression level of caspase-3 was obviously decreased, and MWT and TWL were significantly increased(P<0.05). In the ephrin B2-Fc group, there were no significant changes in MWT, TWL and caspase-3 levels for the bland control and NS groups, as compared with those before treatment(P>0.05). As compared with those before treatment, the MWT and TWL levels for the 0.1 μg and 0.5 μg ephrinB2-Fc groups were significantly decreased, positive Caspase-3 counts were significantly increased. Statistical significance could be seen, when comparisons were made(P<0.05). The higher the concentrations, the lower the levels of MWT and TWL, and there were more positive cells.ConclusionIntrathecal injection of ephrinB2-Fc and EphB1 could increase and reduce the mechanical and heat hyperalgesia, the mechanism of which might be associated with the regulation of the expression of caspase-3.

[Key words]Neuropathic pain; Caspase-3; EphrinB2-Fc; EphB1; Intrathecal injection

[基金項目]國家自然科學基金面上項目(81371253、81171054)，上海市教委創新基金重點項目(1477083)

[作者單位]200003上海，第二軍醫大學長征醫院麻醉科

[通信作者]袁紅斌，電子信箱：jfjczyy@aliyun.com

[中圖分類號]R747

[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.03.009

(收稿日期：2016-01-03)

·基礎醫學··論著·