假地楓皮根皮提取液對神經細胞生長的影響

趙　氚，何　玲

·論著·

假地楓皮根皮提取液對神經細胞生長的影響

趙氚，何玲

[摘要]目的評價八角屬植物假地楓皮的根皮提取液對神經細胞生長的影響。方法采用經神經竽長因子誘導的PC12細胞，以神經生長因子為陽性對照, 在無血清和有血清培養條件下分別對存活細胞進行MTT染色測定；以未分化的PC12 為效應細胞，采用圖象分析法顯微觀測分化細胞的百分率。結果假地楓皮根皮提取液對經神經生長因子誘導的PC12細胞的增殖以及未分化PC12細胞凸起的生長均有促進作用。結論初步確認假地楓皮根皮提取液可能有促進神經增殖和生長的作用。

[關鍵詞]假地楓皮；PC12細胞；增殖；分化

神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是一種對神經細胞生長發育、分化、新陳代謝等方面具有重要調控作用的活性多肽[1]。NGF作為一種靶源性神經營養因子維持著特定神經元的存活和發育，它能促進發育中的感覺神經元及交感神經元的存活和分化，營養成熟的神經元，維持其正常的生物學功能，在神經系統損傷后起修復、營養作用。然而NGF的某些蛋白質性質(如化學性質不穩定，半衰期短，藥代動力學特性欠佳，且不易通過血腦屏障等)限制了其成為理想的臨床用藥。此外，NGF可以與其低親和力 p75NTR受體相互作用引起神經元死亡，這或許也是影響其臨床應用的因素之一。因此，尋找小分子NGF類似物成為藥物研發的熱點之一[2]。近年來國內外對八角屬植物進行了更為廣泛的藥理活性研究，相關研究結果表明利用PC12細胞模型，八角屬植物紅茴香根皮(IlliciumangustisepalumA.C.Smith)中的化學成分可能對PC12細胞有促進生長的作用[3]。本研究選用PC12細胞作為體外培養的實驗模型進行觀察，并采用MTT法和圖像分析法考察另一種八角屬植物假地楓皮根皮提取液對PC12細胞增殖、分化的影響，期望得到結論，并希望今后能為從八角屬植物根皮中純化其活性成分、探討其化學性質提供一些參考[4]。

1材料與方法

1.1材料PC12細胞由中國藥科大學新藥篩選中心提供、保存；注射用鼠NGF購自武漢海特生物制藥股份有限公司；假地楓皮根皮提取液由浙江泰康藥業集團有限公司提供；新生小牛血清購自PAA Laboratories GmbH；DMEM粉末購自Invitrogen Corporation；MTT購自Amresco公司。

1.2方法(1)MTT方法：參照文獻[3]。取對數生長期的經NGF誘導分化的PC12，復蘇、擴增培養，調整細胞濃度為1×105，接種于96孔板，5% CO2、37℃分別在無血清培養條件下或有血清正常培養條件下培養箱中培養。將細胞分成：假地楓皮根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組、以及假地楓皮根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ與陽性藥NGF(300 μg/L)聯合用藥組、陽性對照組、陰性對照組。陽性對照組給予NGF，NGF用磷酸鹽緩沖液配制成4 000 μmol/L的母液濃度備用，給藥時15 μl/孔/200 μl，終濃度為300 μg/L。陰性對照組給予與陽性對照等體積的磷酸鹽緩沖液15 μl/孔/200 μl。各組各劑量采用3批細胞，重復3個孔。培養48 h后，加入MTT，5% CO2、37℃培養箱中繼續孵育4 h后吸去上清液，每孔加DMSO 150 μl，振蕩10 min，用酶聯免疫檢測儀測定570 nm處的光吸收(OD570nm)。(2)圖像分析法：參照文獻[3]。將未分化的PC12細胞復蘇、擴增培養，胰酶消化制成細胞懸液，用DMEM細胞培養液調節細胞密度5×103接種于96孔板繼續培養。24 h后，將培養細胞分成：假地楓皮根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組、以及假地楓皮根皮提取液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別與陽性藥NGF(50 μg/L)聯合用藥組、陽性對照組、陰性對照組。每組設5孔細胞，每孔隨機觀測20個細胞，共100個細胞。24、48、72 h進行光鏡觀察，計數突起生長細胞(≥2倍細胞直徑)占總細胞的百分率。增殖率(%)=(給藥組OD值-陰性對照組OD值)/陰性對照組OD值×100%。

2結果

在有血清的正常培養條件下，假地楓皮根皮提取液中劑量和高劑量組均對PC12細胞有明顯促增殖作用，與陰性對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。受試藥各劑量組未見細胞毒性，與NGF(300 μg/L)聯合應用時，對促進PC12細胞增殖未見明顯協同增效作用。見表1。

表1假地楓皮根皮提取液在有血清培養條件下對

NGF分化的PC12細胞的增殖作用

注：與陰性對照組相比aP<0.05

在無血清的培養條件下，假地楓皮根皮提取液各劑量組均對PC12細胞有明顯促增殖作用，與陰性對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。受試藥各劑量組未見細胞毒性，與NGF(300 ng/ml)聯合應用時，對促進PC12細胞增殖未見協同增效作用。見表2。

表2　假地楓皮根皮提取液在無血清培養條件下

注：與陰性對照組相比aP<0.05

與陰性對照組相比，假地楓皮根皮提取液各劑量組均能顯著促進PC12細胞突起生長，第2天(48 h)誘導分化活性最強，第3天分化細胞百分數遞減，并且呈劑量相關性。受試藥各劑量組與NGF(50 μg/L)聯合應用時，對促進PC12細胞突起生長有明顯的協同增效作用。見表3。

3討論

本研究結果分析表明, 假地楓皮根皮提取液具有顯著促進PC12細胞分化的作用，且與NGF有明顯的協同增效作用。假地楓皮根皮提取液在受試劑量對PC12細胞沒有細胞毒性，均能顯著促進PC12細胞增殖。在無血清培養條件下(缺營養損傷時)的

表3假地楓皮根皮提取液對PC12細胞的

促神經分化作用(每孔20個細胞)

促增殖作用強于在有血清正常培養條件下的作用。與NGF聯合應用時，對促進PC12細胞增殖未見協同增效作用。這從細胞水平為中藥促神經生長的機制提供了佐證。在實驗中,盡管獲得假地楓皮根皮提取液具有明顯促PC12細胞生長的數據, 但這方面的研究還是相當初步的, 藥物的體內過程, 與機體相互作用之后, 再作用于神經細胞的效應如何, 尚有待進一步的探索。此外，真正具有臨床應用前景的神經營養因子類似物,應主要作用于神經系統或對免疫、內分泌等系統無明顯的負面影響[5]。因此，利用PC12 細胞突起生長為指標進行假地楓皮根皮提取液促神經分化作用的確定,體外作用是肯定的但作用機制是不確定的,只能作為一種很實用的初級模型。假地楓皮根皮提取液目標活性的確定需通過作用機制的選擇篩選以及體內試驗完成。

[參考文獻]

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[3]趙氚，張沂，何玲，等. 紅茴香根皮提取液對神經細胞生長和增殖作用的影響[J]. 海軍醫學雜志, 2013, 34(6):361-364. DOI:10.3969/j.issn.1009-0754.2013.06.001.

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[5]王麗梅，陳哲宇，路長林，等. PACAP促PC12細胞突起生長的分子機制[J]. 國外醫學分子生物學分冊, 2001, 23(6):353-357. DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2001.06.012.

(本文編輯：張陣陣)

Effect of Illicium jadifengpi B.N.Chang root bark extract on the enhancement of nerve growth

Zhao Chuan，He Ling

(NavyGeneralHospital,Beijing100048,China)

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the effect of Illicium jiadifengpi B.N.Chang root bark extract on the enhancement of nerve growth.Methods By using NGF as the positive control, the survival rate of the NGF-induced PC12 cells was detected with MTT staining under the culture conditions without or with serum. At the same time, by using the proliferated PC12 as reactive cells, the proliferating rate of PC12 cells was observed with the image analysis method under microscopy.ResultsIllicium jiadifengpi B.N.Chang root bark extract could produce good effects on the proliferation of the NGF-induced PC12 cells and the growth of the undifferentiated PC12 cells.ConclusionIt was preliminarily identified that Illicium jiadifengpi B.N.Chang root bark extract might contain a neurotrophic factor-like substance, which could enhance the proliferation and growth of nerve cells.

[Key words]Illicium jadifengpi B.N.Chang; PC12 cell; Proliferation; Differentiation

[作者單位]100048北京，海軍總醫院(趙氚)；中國藥科大學藥理教研室(何玲)

[中圖分類號]R283.3

[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.03.011

(收稿日期：2016-01-23)