上海市浦東新區2012-2013年病毒性腹瀉檢測情況分析

丁　明，劉春利，潘麗峰，陸　嵐，邱慧芳，劉　青，朱林英，馬　平，郝莉鵬，傅益飛

上海市浦東新區2012-2013年病毒性腹瀉檢測情況分析

丁明，劉春利，潘麗峰，陸嵐，邱慧芳，劉青，朱林英，馬平，郝莉鵬，傅益飛

[摘要]目的了解上海市浦東新區2012-2013年間常見病毒性腹瀉的病原學特征，為腹瀉病的防控提供依據。方法收集2012-2013年上海市浦東新區14家監測醫院腹瀉患者的糞便標本，采用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應(real-time PCR)檢測輪狀病毒、諾如病毒GI型、諾如病毒GII型、星狀病毒、扎如病毒和腸腺病毒。結果共檢測糞便樣本4 214份。1 255份樣本檢出至少1種病毒核酸，核酸陽性檢出率為29.78%。輪狀病毒、諾如病毒GI型、諾如病毒GII型、扎如病毒、星狀病毒以及腸腺病毒的檢出率分別為7.6%、1.4%、18.6%、1.6%、1.5%和1.1%。各年齡組均有病毒檢出，其中年齡最小的為1歲，最大為92歲，分別為感染輪狀病毒和諾如病毒。病毒性腹瀉感染不存在男女差異，但不同年齡組的病毒性腹瀉感染有差異。不同病毒病原的感染存在不同的高峰期，但主要集中在秋冬季。結論諾如病毒和輪狀病毒是浦東地區病毒性腹瀉的主要病原。應該加強對病毒性腹瀉的監測，尤其是諾如病毒和輪狀病毒。

[關鍵詞]病毒性腹瀉；諾如病毒；輪狀病毒；扎如病毒；星狀病毒；腸腺病毒

諾如病毒(norovirus，NV)、輪狀病毒(rotavirus，RV)、扎如病毒(sapovirus，SPV)、星狀病毒(astrovirus，ASTV)和腺病毒(adenovirus，ADV)等是引起人類腹瀉的主要病毒性病原，近年來全國各地開展的腹瀉綜合監測發現，病毒性腹瀉占有較高比例，諾如病毒和輪狀病毒為主[1-5]。上海市浦東新區疾病預防控制中心從2011年開始對轄區內14家醫療機構腹瀉患者進行監測[6]，采集患者的糞便樣本進行上述腹瀉病毒的檢測。現將2012年1月到2013年12月的檢測結果報道如下。

1材料與方法

1.1標本來源及數量

本研究所采集的標本為24 h內大便次數3次或以上、且大便性狀有改變(呈稀便、水樣便、黏膿便或膿血便等)的門診病例的糞便標本。標本采自仁濟醫院東院(以下簡稱仁濟)、上海市兒童醫學中心(以下簡稱兒中心)、東方醫院(以下簡稱東方)、公利醫院(以下簡稱公利)、浦南醫院(以下簡稱浦南)、周浦醫院(以下簡稱周浦)及金楊社區衛生服務中心(以下簡稱金楊)、上海市第六人民醫院東院(以下簡稱六院)、浦東新區人民醫院(以下簡稱浦人醫)、浦東醫院(原南匯中心醫院，以下簡稱浦東)、上海市第七人民醫院(以下簡稱七院)、南華醫院(以下簡稱南華)、機場鎮社區衛生服務中心(以下簡稱機場鎮)、泥城社區衛生服務中心(以下簡稱泥城)等沿海片區的腸道門診。從2012年1月到2013年12月，共采集腹瀉糞便樣本4 214份，各醫療機構樣本采集數量見圖1。樣本采集后運送至上海市浦東新區疾病預防控制中心微生物實驗室進行檢測。

1.2主要儀器

核酸提取采用QIAxtractor全自動核酸抽提儀(德國QIAGEN公司)。實時熒光檢測采用Opticon 2實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)、7500fast實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、7000實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、LightCycler480II(瑞士羅氏公司)。

1.3實驗方法

1.3.1糞便樣本處理取2 g左右糞便加入裝有10 ml磷酸緩沖液的15 ml離心管中，擰緊離心管，用震蕩器劇烈震蕩，用冷凍離心機3 000×g，離心10 min，取上清備用。

1.3.2核酸提取根據QIAxtractor全自動核酸抽提儀核酸提取操作方案進行。樣本體積為200 μl，提取以后得到總核酸體積為60 μl。

1.3.3實時熒光定量-聚合酶鏈反應(real-time PCR)引物根據Liu等[7]文獻所述，由Invitrogen公司合成。試劑采用Qiagen公司生產的QuantiTect Probe RT-PCR Kit，反應體系為25 μl，由12.5 μl、2×QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix， 0.6 μl、0.4 μmol/L 上下游引物，0.3 μl、0.2 μmol/L探針， 0.3 μl QuantiTect RT Mix、5.7 μl RNase-free Water以及5 μl模板核酸組成。根據各儀器操作說明，設置反應條件為：50 ℃，30 min；95 ℃，15min；再按94 ℃，15 s→60 ℃，60 s循環40次，熒光檢測在60 ℃。Ct值≤35時，判斷結果為陽性。

1.4統計學處理

病例信息和檢測結果均錄入Excel 2007進行整理，用SPSS 18.0軟件進行統計分析，計數資料采用卡方檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1腹瀉病例感染病原的檢出情況

對4 214份標本都進行了RV、諾如病毒GI型(NV GI)、諾如病毒GII型(NV GII)、ASTV、SPV和ADV的real-time PCR檢測，共檢出1 255份標本含有至少1種病毒核酸。其中1 170份為單一病毒核酸陽性，80份為雙重病毒核酸陽性，5份為三重及以上病毒核酸陽性的樣本檢出。核酸陽性檢出率為29.78%(1 255/4 214)。各病毒按檢出陽性率排列依次為NV GII 18.6%(784/4 214)、RV 7.6%(321/4 214)、SPV 1.6%(69/4 214)、ASTV 1.5%(63/4 214)、NV GI 1.4% (59/4 214)以及ADV 1.1%(48/4 214)。

2.2腹瀉病毒感染的性別構成情況

在所有的4 214份樣本中，男性患者2 180份(51.73%)，女性患者2 034份(48.27%)，男女比1.07∶1接近1∶1。陽性樣本中，男性患者663份(52.83%)，女性患者592份(47.17%)，經檢驗，病毒性腹瀉男女患者陽性率差異無統計學意義(χ2=3.398，P=0.334)。

2.3腹瀉患者的年齡分布情況

1 255例病毒性腹瀉患者的年齡在1～98歲，其中感染NV的患者年齡為1～92歲、感染RV的患者年齡為1～92歲、感染SPV的患者年齡為1～79歲、感染ASTV的患者年齡為1～84歲、感染EADV的患者年齡為1～92歲。經檢驗，各年齡組間的檢出率差異有統計學意義(χ2=55.484，P<0.05)。各年齡組腹瀉病毒感染的檢出情況見表1。

注：A-F分別為輪狀病毒、諾如病毒GI型、諾如病毒GII型、扎如病毒、星狀病毒以及腸道腺病毒在2012年1月到2013年12月間檢出數及檢出率；RV為輪狀病毒，NV GI為諾如病毒GI型，NV GII為諾如病毒GII型，SPV為扎如病毒，ASTV為星狀病毒，ADV為腺病毒圖2　2012-2013年上海市浦東新區腹瀉病毒的檢出情況

年齡組RVNVGINVGIISPVASTVADV合計1～1052185692718011～2094230123921～304811132208422331～4056121391615123941～502769595414651～606714164912627261～704888969116171～80101343104981～92422403336合計321597856963481345

注：RV為輪狀病毒，NV GI為諾如病毒GI型，NV GII為諾如病毒GII型，SPV為扎如病毒，ASTV為星狀病毒，ADV為腺病毒

2.4腹瀉患者的時間分布情況

2012-2013年各月間均有腹瀉病毒檢出，其中10月最多為76份，9月最少為14份。經檢驗，各月間腹瀉病毒的檢出率有顯著差異(χ2= 136.847，P<0.05)。2012-2013年各月間，各病毒的檢出情況見圖2。

3討論

浦東新區疾病預防控制中心自2011年7月開始對轄區內腹瀉病的感染情況進行監測。2011年對1 327份腹瀉標本進行檢測，核酸的陽性率為13.49%[6]，遠低于本研究時段的29.78%。NV在本研究時段中出現了高檢出率，尤其是GII型，達到了18.6%，比2011年所有病原的總檢出率還要高。RV的檢出率從8.29%降低為7.6%，是所有病原中檢出率唯一降低的病毒。而SPV、ASTV和ADV的檢出率均有增加。這可能與2011年只是半年時間的檢測，不是一個完整的年度監測結果，因此不能完整的反映出病毒病原在一個完整年度中的流行趨勢有關。同時，也有可能與病毒病原在不同年度的流行強度相關。

在本研究時段內，人群的性別差異基本與2011年和其他涉及到成人研究的地區相一致，男女比在1∶1左右[2-3，8]。對嬰幼兒腹瀉的研究發現男性感染者要多于女性[9]，可能與男童較女童頑皮，個人衛生沒有搞好相關。

病毒感染是引起腹瀉的原因之一。在涉及到成人的病毒性腹瀉病原研究中，NV感染是引起成人腹瀉的主要病毒病原[2-3，8]，而RV感染則是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原[1，5，10-14]，ASTV、SPV和EADV則根據地區的不同，檢出情況也不盡相同，但檢出率均在5%以下[1-6，8，10-16]。因此，NV和RV是目前引起病毒性腹瀉的主要病原。同時，21～60歲年齡組在本研究時段內青壯年病毒性腹瀉的主要病毒性病原是NV，在本研究中接近50%。

在流行季節上，NV呈全年流行狀態，但是每年的冬季是流行期，尤其是1、2月份是感染的高峰期。其余病毒也呈現出冬季是流行高峰的狀態。特別的是SPV和ASTV，兩者在2013年7月以后均未檢出，而NV、RV和EADV則在此時出現較高的檢出率。在檢測試劑沒有變化的情況下，出現SPV和ASTV未檢出，提示可能出現病毒變異的情況。

總之，需要對NV和RV做好監測和防控工作，同時，在開展病毒性腹瀉核酸檢測的基礎上，還要繼續對相關病毒進行細胞培養和分子流行病學研究，為本地區病毒性腹瀉的防控工作打下扎實的基礎。

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(本文編輯：林永麗)

Detection and analysis of viral diarrhea in Shanghai Pudong New District from 2012 to 2013

Ding Ming, Liu Chunli, Pan Lifeng, Lu Lan, Qiu Huifang, Liu Qing, Zhu Linying, MA Ping, Hao Lipeng, Fu Yifei

(DiseasePreventionandControlCenter,PudongNewDistrict,Shanghai200136,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the pathogenic features of viral diarrhea in Shanghai Pudong New District, from 2012 to 2013, so as to provide solid evidence for the prevention and control of infectious diarrhea.Methods Stool samples were collected from diarrhea patients in 14 hospitals under surveillance in Pudong New District from 2012 to 2013. Rotavirus, norovirus (types GI and GII), sapovirus, astrovirus and enteric adenovirus were detected by using real-time polymerase chain reaction (real-time PCR).ResultsTotally, 4214 stool samples were detected and at least one virus nucleic acid was detected in 1255 samples, with a positive detection rate of 29.78%. The detection rates of rotavirus, norovirus type GI and GII, sapovirus, astrovirus and enteric adenovirus were 7.6%,1.4%,18.6%,1.6%,1.5% and 1.1% respectively. Viruses were detected in all age groups, in which the youngest was just one year old and the oldest was 92 years old, who were infected respectively by rotavirus and norovirus. There were no differences in the infection of viral diarrhea between male and female, however, differences could be seen in the infection of viral diarrhea between different age groups. Different viruses had different prevalent seasons, the peak seasons were in autumn and winter.ConclusionNorovirus and rotavirus were the major pathogens to cause viral diarrhea in Pudong. Efforts should be made for the detection of viral diarrhea, particularly the diarrhea induced by norovirus and rotavirus.

[Key words]Viral diarrhea; Norovirus; Rotavirus; Sapovirus; Astrovirus; Enteric Adenovirus

[基金項目]上海市浦東新區衛生系統優秀青年醫學人才培養計劃資助(PWRq2012-23)

[作者單位]200136上海，浦東新區疾病預防控制中心(丁明、潘麗峰、陸嵐、邱慧芳、劉青、朱林英、馬平、郝莉鵬、傅益飛)；解放軍92763部隊醫院(劉春利)

[通信作者]潘麗峰，電子信箱：alexpan0804@163.com

[中圖分類號]R573.3

[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.03.016

(收稿日期：2015-05-04)

·臨床醫學··論著·