乳腺癌細胞的容積敏感性氯電流*

張可凡，　厲冰雪，　馬蓮順，　楊　琳，　朱林燕，　陳麗新，　王立偉

(暨南大學醫學院藥理學系，廣東 廣州 510632)

乳腺癌細胞的容積敏感性氯電流*

張可凡，厲冰雪，馬蓮順，楊琳，朱林燕△，陳麗新，王立偉

(暨南大學醫學院藥理學系，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 探討乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231中的容積敏感性氯電流及其生理學和藥理學特性。方法: 采用全細胞膜片鉗記錄模式，在等滲條件下記錄MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞的背景氯電流；在細胞外灌流47%低滲灌流液使細胞腫脹或灌流47%高滲灌流液使細胞皺縮時，記錄氯電流的變化；加入氯通道阻斷劑NPPB(100 μmol/L)或Tamoxifen(20 μmol/L)記錄容積敏感性氯電流的改變，分析該電流的特性。結果: (1)等滲條件下，記錄到MCF-7細胞與MDA-MB-231細胞的背景氯電流有顯著差異；(2)胞外低滲誘導細胞腫脹時，可以激活MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞容積敏感性氯電流；(3)胞外高滲誘導細胞皺縮時，抑制了低滲激活的容積敏感性氯電流；(4)低滲激活的容積敏感性氯電流能被氯通道阻斷劑NPPB抑制；(5)雌激素受體(estrogen receptor,ER)調節劑，同時也是氯通道阻斷劑的Tamoxifen也能抑制低滲激活的容積敏感性氯電流。結論: MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞均可以記錄到容積敏感性氯電流，高滲狀態及使用氯通道阻斷劑可抑制該氯電流。

[關鍵詞]乳腺癌細胞； 背景氯電流； 容積敏感性氯電流

容積敏感性氯通道參與細胞容積調節功能：在正常生理條件下，細胞容積處于不斷的變化中，并通過容積調節功能來維持正常生理活動。當細胞受到非等滲刺激而使容積增大或減小時，細胞自身會通過調節機制使細胞容積向正常恢復，稱為調節性容積回縮(regulatory volume decrease,RVD)或調節性容積回升(regulatory volume increase,RVI)。研究表明[1]容積敏感性氯通道參與細胞增殖、細胞周期[2]及細胞遷移[3]過程；本實驗室研究證明氯通道阻斷劑NPPB能夠濃度依賴性抑制容積激活性氯電流，從而抑制細胞RVD的過程[4]，進而阻斷細胞增殖過程。

乳腺癌是發生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，雌激素對乳腺組織的影響非常重要，它可以與雌激素受體(estrogen receptor, ER)結合形成一種雌激素受體復合物，影響轉錄和復制，從而產生生理效應[5]。MCF-7細胞是乳腺癌體外實驗常用的細胞株，這個細胞系能夠保持乳腺組織的許多特性，表達雌激素受體，MDA-MB-231細胞是乳腺癌體外實驗的另一種重要的細胞株，該細胞株與MCF-7細胞不同的是不表達雌激素受體。Tamoxifen是一種ER調節劑,作為乳腺癌內分泌治療的代表藥物已被應用于臨床30多年，被證實能顯著提高乳腺癌患者的無復發生存率及總存活率[6]。經典的ER調節劑Tamoxifen也是常用的氯通道阻斷劑。有報道[7]，Tamoxifen也可以阻斷低滲誘導的雌激素受體陰性細胞容積敏感性氯電流。鮮有文獻報道容積敏感性氯通道在乳腺癌細胞是否有表達。本研究利用全細胞膜片鉗技術觀察記錄MCF-7細胞、MDA-MB-231細胞容積敏感性氯電流及其生理學和藥理學特性。

材料和方法

1細胞株

本實驗采用MCF-7細胞以及MDA-MB-231細胞(購于ATCC細胞庫，由本實驗室保存)。

2主要藥物、試劑和儀器

DMEM培養基、1640培養基、胎牛血清(Gibco)；等滲灌流液(isotonic solution,ISO)含(mmol/L)：NaCl 70、MgCl20.5、CaCl22、Hepes 10、D-甘露醇 140。47%高滲灌流液(hypotonic solution,HYPO)滲透壓為440 mOsmol/L,除溶液中D-甘露醇為280 mmol/L外，其余同等滲液。47%低滲灌流液(hypertonic solution,HYPER)不含D-甘露醇，滲透壓為160 mOsmol/L。配制好的液體用冰點滲透壓計(Osmomat030)測定滲透壓，Tris堿調pH值至7.4。氯通道阻斷劑NPPB(Sigma)用二甲基亞砜(DMSO)配制成100 mmol/L的儲存液，儲存在4 ℃冰箱中，用時用等滲液稀釋至最終濃度100 μmol/L。另一種常用的氯通道阻斷劑Tamoxifen (Sigma)在使用當天用甲醇新鮮配制成50 mmol/L 原液，使用時用等滲液稀釋到最終濃度20 μmol/L。電極內液是灌充在玻璃微電極中起交換細胞內離子作用，組成是(mmol/L):NMDG-Cl 70,MgCl21.2,HEPES 10,EGTA 1,D-甘露醇140，ATP 2，最后用Tris液調pH至7.25，滲透壓調至300 mOsmol/L。

3主要方法

3.1細胞培養將MCF-7細胞接種于含有10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的DMEM培養基中，MDA-MB-231細胞接種于含有10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的1640培養基中，置于5% CO2、37 ℃的孵箱中常規培養，細胞貼壁生長，每2～3 d傳代。用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸消化，收集對數生長期細胞進行實驗。

3.2膜片鉗全細胞紀錄使用外徑為1.5 mm、內徑為0.86 mm的硼硅酸鹽毛細玻璃管，在微電極拉制器上拉制微電極，充灌電極內液，此時其電阻為5～10 MΩ。將貼有細胞的玻片放置在灌流槽中，使用時微電極尖端與細胞膜形成高阻封接，細胞被鉗制在0、±40、±80 mV，不斷反復循環，每個鉗制脈沖波寬200 ms，間隔4 s。用膜片鉗放大器記錄MCF-7、MDA-MB-231細胞的氯電流,并將電流和電壓信號用數模/模數轉換器(Cambrige)數字化(采樣頻率3 kHZ)，實驗數據用膜片鉗軟件包(CED)進行軟件分析。

4統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準誤(mean±SEM)表示，用t檢驗或單因素方差分析檢驗統計學差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1MCF-7細胞與MDA-MB-231細胞的背景氯電流

全細胞膜片鉗技術記錄MCF-7細胞與MDA-MB-231細胞氯電流，給予0、±40和±80 mV的指令電壓，往復循環。在等滲灌流液下MCF-7細胞有微弱而穩定的背景氯電流，±80 mV電壓鉗制下內、外向電流密度分別為(-4.86±0.74)pA/pF、(4.50±0.78)pA/pF,MDA-MB-231細胞在±80 mV電壓下內、外向電流密度分別為(-16.09±1.75) pA/pF、(14.01±1.47)pA/pF，2種細胞間背景氯電流差異顯著(P<0.01)，見圖1。

2低滲誘導的MCF-7細胞與MDA-MB-231細胞容積敏感性氯電流

當等滲狀態下鉗制的MCF-7的電流平穩后換47%低滲液進行灌流，可以在(1.58±0.45) min內迅速激活氯電流，在作用(10.42±1.93) min后電流達峰值;等滲灌流雌激素受體陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的電流平穩后，換47%低滲液進行灌流(1.73±0.33)min后，細胞的電流開始變大，在(12.66±2.84)min 后達峰值。2種細胞在低滲條件下細胞腫脹，氯電流明顯增大(P<0.01)，經計算該電流的翻轉電位為(-5.67±0.61) mV，接近氯離子平衡電位。在本實驗條件下，由于實驗所用電極內液和灌流液均不含K+，并且根據本實驗的細胞外液和細胞內液成分，應用能斯特方程[E非標準電極電勢=E標準電極電勢-(RT/Fn)×(LnJ)]計算出Na+、Ca2+平衡電位均大于200 mV，與翻轉電位相差較遠，故排除了該電流與K+、Na+、Ca2+3種陽離子的關系，而計算得出的Cl-平衡電位為-0.9 mV，相對來說翻轉電位與其是非常接近的，故認為低滲激活的是氯電流，見圖2。

Figure 1.The background chloride currents of MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells in the isotonic bath solution. Whole cell currents in response to 200 ms voltage steps to 0, ±40 and ±80 mV from a holding potential of 0 mV were recorded. Mean±SEM.n=19.**P<0.01vsMCF-7.

圖1MCF-7細胞與MDA-MB-231細胞基礎氯電流圖

Figure 2.The hypotonicity-induced chloride currents in MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells. The typical time courses of MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells in the hypotonic bath solution. Mean±SEM.n=9.**P<0.01vsISO.

圖2低滲激活MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞的氯電流

3MCF-7細胞與MDA-MB-231細胞容積敏感性氯電流的特性研究

3.1容積敏感性利用細胞外高滲刺激誘導MCF-7細胞皺縮，分析該低滲激活的氯電流是否具有容積敏感性。當低滲激活的電流平穩約3 min后，換為47%高滲液灌流細胞，電流迅速減小且完全被抑制;MDA-MB-231細胞低滲激活性氯電流同樣具有容積敏感性，可以被高滲液完全抑制。MCF-7細胞在-80 mV鉗制下電流密度抑制率為(98.77±1.80)%；在+80 mV鉗制下，電流密度抑制率為(97.41±2.39)%，高滲組與低滲組相比差異有統計學意義(P<0.01)；MDA-MB-231細胞外向電流密度抑制率為(105.77±5.45)%；內向電流密度抑制率為(103.34±2.13)%，高滲組與低滲組相比差異有統計學意義 (P<0.01)，見圖3。

Figure 3.Inhibition of the hypotonicity-induced chloride currents by the hypertonic solution in MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells. Means±SEM.n=5.**P<0.01vsHYPO.

圖3高滲液抑制低滲激活的MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞氯電流

3.2低滲激活性氯電流的藥理學特性

3.2.1氯通道阻斷劑NPPB對低滲激活性氯電流的作用為分析容積敏感性氯電流的藥理學特性，采用氯通道的一種常用阻斷劑NPPB作用于MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞，可見到電流明顯減小。在±80 mV鉗制下，MCF-7細胞內向的電流密度抑制率為(77.34±2.79)%,外向電流密度抑制率為(77.61±2.72)%；MDA-MB-231細胞在±80 mV鉗制下電流密度抑制率分別為(92.33±7.98)%、(90.92±5.31)%,NPPB抑制組與低滲組相比差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖 4。

Figure 4.Inhibition of the hypotonicity-induced chloride currents by the chloride channel blocker NPPB in MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells. The typical time courses of MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells in the hypotonic bath solution, and in the hypotonic bath solution with 100 μmol/L NPPB. Mean±SEM.n=4.**P<0.01vsHYPO.

圖4NPPB可抑制低滲激活的MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞的全細胞氯電流

3.2.2氯通道阻斷劑Tamoxifen抑制低滲激活的氯電流為進一步分析低滲激活氯電流的特性，觀察Tamoxifen對該電流的作用，可見到MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞低滲激活性氯電流同樣明顯減小且很快被完全抑制。MCF-7細胞在±80 mV鉗制下，細胞內向的電流密度抑制率為(102.68±2.26)%；外向電流密度抑制率為(99.51±1.47)%； MDA-MB-231細胞在±80 mV鉗制下電流密度抑制率分別為(104.49±10.08)%、(104.81±8.51)%，低滲組與Tamoxifen抑制組相比差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖5。

Figure 5.Inhibition of hypotonicity-induced chloride currents by the Tamoxifen in MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells. The typical time courses of MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells in the hypotonic bath solution, and in the hypotonic bath solution with 20 μmol/L Tamoxifen. Mean±SEM.n=4.**P<0.01vsHYPO.

圖5Tamoxifen可抑制低滲激活的MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞的全細胞氯電流

討論

在一定細胞內外離子的情況下，給予細胞一定的鉗制電壓，在不另外施加刺激的情況下可以記錄細胞的背景電流，該電流可以被容積敏感性氯通道阻斷劑所抑制[8]。在本實驗前期的研究中發現，背景氯電流密度在增殖能力強的低分化鼻咽癌細胞比人永生化正常鼻咽上皮細胞明顯增大[7]。MDA-MB-231細胞是雌激素受體表達陰性的細胞，惡性程度遠高于MCF-7細胞。本實驗首先觀察等滲狀態下2種細胞的背景氯電流，但在等滲條件下記錄的MDA-MB-231細胞的背景電流密度明顯高于MCF-7細胞，表明開放的氯通道數目在MDA-MB-231細胞明顯多于MCF-7細胞，這很可能與MDA-MB-231細胞的高增殖能力相關。本實驗室前期研究表明ClC-3(氯通道ClC家族之一)可能是鼻咽癌細胞背景氯電流的重要成分，ClC-3在低分化鼻咽癌細胞中的表達比人永生化正常鼻咽上皮細胞明顯增多,那么本實驗2種乳腺癌細胞背景氯電流的差異是否由于ClC-3的參與有待進一步實驗論證。

細胞外滲透壓的變化是研究容積敏感性離子通道的功能和作用的重要方法和手段。研究發現細胞外低滲能夠誘導人星形膠質細胞[9]、人胎兒正常鼻咽細胞[10]、人急性淋巴細胞性白血病細胞[11]、鼠肝癌細胞[12]等多種細胞的氯離子外流，與等滲狀態下相比，低滲激活的氯電流的電流密度明顯增大。在本實驗中灌流低滲溶液，觀察到2種乳腺癌細胞均能被記錄到增大的電流，翻轉電位接近于氯離子的平衡電位，因此推斷2種細胞均能被記錄到低滲激活性的氯電流。經分析比較2種細胞的低滲激活性氯電流潛伏期均較短，增大速度很快，具有明顯的外向優勢，并且可被細胞外高滲抑制，表現出容積敏感性，而且都可以被氯通道阻斷劑NPPB、Tamoxifen抑制。這些均與本實驗室前期的低滲激活性的鼻咽癌細胞、正常鼻咽上皮細胞[7]等的氯電流特性相似。本實驗研究所采用的是低滲刺激細胞激活氯電流，低滲刺激是一種純物理刺激，這樣激活的氯電流具有容積敏感性，可以被高滲溶液抑制，也能被實驗室普遍使用的氯離子通道阻斷劑NPPB和Tamoxifen所抑制。那么使用藥物刺激，通過相應靶點結合后激活的氯電流是否仍具備容積敏感性，并能被抑制？另外本文所提到Tamoxifen在臨床上用作一種內分泌治療乳腺癌的常用藥物，它依賴乳腺癌是否表達雌激素受體來作用，如果它仍可作為一種氯離子通道阻斷劑，那么Tamoxifen在治療乳腺癌的時候是否也通過氯離子通道的途徑發揮作用呢？本研究為進一步探討Tamoxifen抗乳腺癌的作用及機制奠定基礎。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Volume-sensitive chloride current of breast cancer cells

ZHANG Ke-fan, LI Bing-xue, MA Lian-shun, YANG Lin, ZHU Lin-yan, CHEN Li-xin, WANG Li-wei

(PharmacologyDepartment,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tzhuly@jnu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the volume-sensitive chloride current of breast cancer cells MCF-7 and MDA-MB-231. METHODS: The technique of whole-cell patch clamp was used to record the chloride current. The background chloride current of MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells was recorded in isosmotic solution. The changes of chloride current were observed when the cells were perfused by 47% hypotonic or 47% hypertonic solutions. The changes of chloride current were observed after adding the chloride channel blocker NPPB (100 μmol/L) or tamoxifen (20 μmol/L). RESULTS: The background currents in estrogen receptor (ER) positive breast cancer MCF-7 cells and ER negative breast cancer MDA-MB-231 cells were statistically different under isotonic conditions. Perfusion of 47% hypotonic solution induced cellular swelling and activated volume-sensitive chloride current. Perfusion of 47% hypertonic solution induced cell shrinkage and inhibited the volume-sensitive chloride current. NPPB and Tamoxifen inhibited the hypotonicity-activated chloride current. CONCLUSION: The volume-sensitive chloride current was recorded in the breast cancer cells MCF-7 and MDA-MB-231, which was inhibited by hypertonic solution and chloride channel blockers.

[KEY WORDS]Breast cancer; Background chloride current; Volume-sensitive chloride current

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0083- 06

[收稿日期]2015- 07- 10[修回日期] 2015- 09- 21

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.31070997; No.81372382)； 廣東省自然科學基金資助項目(No.S201310013780)

通訊作者△Tel: 020-85220242; E-mail: tzhuly@jnu.edu.cn

[中圖分類號]R329.2+5; R730.23

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.014