Cripto-1基因沉默對人肝癌MHCC-97H細胞侵襲、遷移能力的影響*

黃　濤，　李紹強，　郭奕展，　付順軍，　彭寶崗，　梁力建

(中山大學附屬第一醫(yī)院肝外科，廣東 廣州 510080)

Cripto-1基因沉默對人肝癌MHCC-97H細胞侵襲、遷移能力的影響*

黃濤，李紹強△，郭奕展，付順軍，彭寶崗，梁力建

(中山大學附屬第一醫(yī)院肝外科，廣東 廣州 510080)

[摘要]目的： 探討Cripto-1蛋白在人肝癌組織和肝癌細胞系中的表達，研究沉默Cripto-1基因后對肝癌細胞MHCC-97H侵襲和遷移能力的影響及可能的機制。方法: 采用Western blot檢測11對肝癌組織及相應的癌旁組織和不同肝癌細胞株中Cripto-1蛋白的表達；收集80例肝癌石蠟標本，免疫組織化學方法檢測Cripto-1蛋白的表達情況；Cripto-1 siRNA轉染肝癌細胞MHCC-97H細胞后，real-time PCR和Western blot分別檢測轉染效率；Transwell遷移和侵襲實驗分別檢測細胞的遷移和侵襲能力；Western blot分別檢測基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白的表達。結果: Western blot檢測結果顯示肝癌組織中Cripto-1蛋白的表達明顯高于對應的癌旁組織,Cripto-1蛋白在各肝癌細胞系中均有表達，且表達量高于對照細胞，其中高侵襲性肝癌細胞MHCC-97H表達量最高；免疫組織化學結果顯示Cripto-1蛋白在88.7%的肝癌組織中表達；Cripto-1 siRNA轉染MHCC-97H細胞后能顯著降低Cripto-1 mRNA和蛋白的表達水平，并且能降低其侵襲和遷移能力；Western blot結果表明，Cripto-1基因沉默后能抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表達。結論: Cripto-1在肝細胞癌中的高表達可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，下調Cripto-1的表達可以抑制肝癌細胞侵襲和遷移能力，其機制可能與下調MMP-2、MMP-9的表達有關。

[關鍵詞]腫瘤侵襲； 腫瘤轉移； 小干擾RNA； Cripto-1基因； 肝細胞癌

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上常見的惡性腫瘤，我國HCC的死亡率已升至惡性腫瘤的第2位。目前肝癌的治療方法很多，但是效果大多不理想，即使是小于2 cm的小肝癌，治愈性切除術后的5年復發(fā)和轉移率高達70%[1]，侵襲轉移和術后復發(fā)是大多數HCC患者死亡的主要原因。然而其具體的機制尚不明確。研究、闡明HCC侵襲轉移的機制，并針對性地設計相應的治療對策，對提高HCC臨床治療效果和改善患者的預后更具意義。

Cripto-1，又稱畸胎瘤衍生生長因子-1 (teratocarcinoma-derived growth factor-1,TDGF-1)，是表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)-Cripto-1/成纖維細胞生長因子相關配體1(fibroblast growth factor-related ligand-1，FRL-1)/Cryptic家族的成員。Cripto-1作為胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的基因，在成人組織中僅有極少部分器官低度表達[2]。研究發(fā)現Cripto-1在腫瘤形成過程中會再次出現高表達，并且能促進腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成[3-4]。目前研究已經證實Cripto-1在乳腺癌[5]、惡性黑色素瘤[6]、胰腺癌[7]、膀胱癌[8]、結腸癌[9]等腫瘤中高表達，但在肝細胞癌中是否表達卻少有報導。因此我們檢測肝癌細胞和組織中Cripto-1的表達，并用Cripto-1 siRNA轉染Cripto-1表達量最高的肝癌MHCC-97H細胞，研究Cripto-1表達下調后對肝癌細胞的侵襲和遷移能力的影響及可能的機制。

材料和方法

1主要材料和試劑

人肝癌細胞株MHCC-97H、MHCC-97L、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Bel-7402、Huh7及對照細胞株LO2(中國科學院上海細胞庫)；人肝癌組織及相應癌旁組織、肝癌組織石蠟切片(中山大學附屬第一醫(yī)院)；高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和磷酸鹽緩沖液(Gibco)；GAPDH抗體(北京博奧森)；Cripto-1兔抗人多克隆抗體(Abcam)；基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2抗體、MMP-9抗體、山羊抗兔IgG Ⅱ抗(CST)；Cripto-1 siRNA和control siRNA(廣州銳博)；Matrigel基質膠(BD)；Transwell小室(Corning)；Lipofectamine 3000(Invitrogen)；引物合成、RNA逆轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒(TaKaRa)；全蛋白提取試劑盒、免疫組織化學染色試劑盒(南京凱基)；BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀)。

2方法和步驟

2.1肝癌組織及癌旁組織中Cripto-1蛋白的表達收集中山大學附屬第一醫(yī)院手術室切下的新鮮的原發(fā)性肝癌組織及相應的癌旁組織11對，低溫快速運輸到實驗室，分別剪碎后置于液氮中碾磨成粉狀，加入RIPA及PMSF、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，按照蛋白提取試劑盒說明書步驟提取總蛋白液，BCA法測定蛋白濃度，Western blot法檢測Cripto-1蛋白的表達量。

2.2細胞株中Cripto-1蛋白的表達將復蘇的MHCC-97H、MHCC-97L、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Bel-7402、Huh7和LO2細胞分別置于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后提取蛋白。Western blot法檢測7株細胞中Cripto-1蛋白的表達量。

2.3免疫組織化學染色將取自中山大學附屬第一醫(yī)院病理科的80例石蠟標本各制成4 μm厚切片，經過二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，置于檸檬酸鹽緩沖液中行微波抗原修復15 min。冷卻至室溫后，以3%雙氧水封閉內源性過氧化物酶，山羊血清封閉30 min后滴加Cripto-1抗體(1∶100稀釋)覆蓋切片上的組織，放置于濕盒內4 ℃過夜。PBS漂洗干凈后滴加II抗30 min，顯微鏡下DAB顯色,蘇木素復染細胞核，梯度乙醇二甲苯脫水后，中性樹膠封片。

2.4轉染及分組挑選Cripto-1蛋白表達量最高的MHCC-97H細胞用于轉染Cripto-1 siRNA。轉染前24 h，選取生長狀態(tài)良好的MHCC-97H細胞按4×105個細胞接種于6孔板里，培養(yǎng)24 h后，待細胞匯合度達到70%左右，按照Lipofectamine 3000說明書操作步驟分別將Cripto-1 siRNA(針對靶序列5’-GGAATTTGCTCGTCCATCT-3’設計)和control siRNA轉染至MHCC-97H細胞。實驗分為Cripto-1 siRNA組和control siRNA組。

2.5Real-time PCR驗證轉染效率轉染48 h后，TRIzol法提取各組細胞RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。SYBR Green染料法進行實時熒光定量PCR反應，以β-actin為內參照。Cripto-1的上游引物序列為5’-TCTACGGACGGAACTGTGAGC-3’，下游引物序列為5’-CTTCTTGGGCAGCCAGGTGT-3’，產物80 bp；β-actin的上游引物序列為5’-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3’,下游引物序列為5’-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3’，產物317 bp。反應條件為95℃10 min；95℃15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)。

2.6Western blot法檢測蛋白的表達轉染后72 h收集各實驗組細胞，加入RIPA及PMSF、磷酸酶抑制劑，按照蛋白提取試劑盒說明書步驟提取總蛋白液，BCA法測定蛋白濃度，將總蛋白液與上樣緩沖液按4∶1的比例混合，煮沸5 min后制成蛋白質樣品。配置5%濃縮膠和15%分離膠，每組各取40 μg蛋白樣品加入泳道，進行SDS-PAGE，濃縮膠60 V 30 min，分離膠100 V 90 min。再將電泳產物恒壓90 V 100 min轉至PVDF膜上。含5% BSA的TBST搖床上封閉1 h后，分別加入稀釋好的Cripto-1、MMP-2、MMP-9、GAPDH(稀釋比均為1∶1 000)抗體中，置于搖床4℃孵育過夜。次日，TBST漂洗緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入山羊抗兔IgG II抗(稀釋比1∶3 000)，室溫孵育1 h，TBST漂洗緩沖液洗膜3次，每次10 min；配制ECL化學發(fā)光液，滴加到PVDF膜上，放入化學發(fā)光成像系統(tǒng)中成像，獲得蛋白條帶圖片。

2.7Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力侵襲實驗按1∶8將Matrigel膠稀釋于無血清DMEM培養(yǎng)基中，Transwell小室置于24孔板中，每個小室加入上述稀釋液100 μL后置于37 ℃恒溫箱1 h，待膠凝結后，下室加入700 μL 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，上室加入200 μL含2%胎牛血清的細胞(7×104個)懸液，置于細胞培養(yǎng)箱中。36 h后吸去上室培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定20 min后0.1%結晶紫溶液染色15 min,PBS清洗干凈，棉簽擦拭上室，置于顯微鏡下觀察小室下面穿過的細胞數量。隨機選取5個視野，細胞計數并記錄。遷移實驗則無需在小室中加入Matrigel，培養(yǎng)時間為24 h，其它步驟同侵襲實驗。

3統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 16.0分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組之間均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1肝癌組織及肝癌細胞系中Cripto-1蛋白的表達

11對肝癌組織中有10對Cripto-1蛋白的表達明顯高于相應的癌旁組織(P<0.05)，見圖1。6株肝癌細胞系均有Cripto-1蛋白表達，除SMMC-7721外，其余5株與正常對照細胞LO2相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且高侵襲性的MHCC-97H細胞表達量最高，見圖2。

Figure 1.The expression of Cripto-1 in 11 samples of tumor and paracancerous tissues.T: tumor tissues; P: parcancerous tissues. Mean±SD.n=11.*P<0.05vsP.

圖1Cripto-1蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達

Figure 2.The protein expression of Cripto-1 in the HCC cell lines.The expression of Cripto-1 in HCC cells was significantly higher than that in the control cell line LO2.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsLO2.

圖2Cripto-1蛋白在肝癌細胞株中的表達

2免疫組織化學染色結果

對80例肝癌組織石蠟切片進行免疫組織化學方法染色,結果顯示其中71例有Cripto-1蛋白的表達，9例無表達，陽性率88.7%，典型表達圖片見圖3。

Figure 3.Representative immunohistochemical images showing the expression of Cripto-1 in the HCC tissues.

圖3Cripto-1蛋白在原發(fā)性肝癌組織中表達的免疫組化典型圖片

3Cripto-1 siRNA降低MHCC-97H細胞Cripto-1 mRNA和蛋白的表達

Real-time PCR 和Western blot實驗結果顯示，與對照組相比，Cripto-1基因沉默組中Cripto-1 mRNA水平和蛋白的水平明顯下降(P<0.05)，表明Cripto-1 siRNA對MHCC-97H細胞的Cripto-1基因沉默有效，見圖4、5。

Figure 4.The mRNA expression of Cripto-1 in the MHCC-97H cells transfected with Cripto-1 siRNA.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol siRNA group.

圖4mRNA水平檢測 Cripto-1 siRNA轉染效率

Figure 5.The protein expression of Cripto-1 in the MHCC-97H cells transfected with Cripto-1 siRNA.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol siRNA group.

圖5蛋白水平檢測Cripto-1 siRNA轉染效率

4下調Cripto-1可以抑制MHCC-97H細胞的侵襲和遷移能力

沉默Cripto-1基因后的MHCC-97H細胞與對照組細胞相比，侵襲和遷移的細胞數目明顯減少(P<0.01),說明沉默Cripto-1基因會降低MHCC-97H細胞的侵襲和遷移能力，見圖6。

Figure 6.The migration and invasion abilities of MHCC-97H cells transfected with Cripto-1 siRNA decreased significantly(×100).Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol siRNA group.

圖6沉默Cripto-1基因對MHCC-97H細胞侵襲和遷移能力的影響

5下調Cripto-1可以減少MMP-2和MMP-9的表達

與對照組相比，Cripto-1 siRNA組的MMP-2和MMP-9的表達下調(P<0.01)，說明沉默Cripto-1基因后會抑制MMP-2和MMP-9的表達，見圖7。

Figure 7.The protein expression of MMP-2 and MMP-9 in the MHCC-97H cells transfected with Cripto-1 siRNA.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol siRNA group.

圖7沉默Cripto-1基因后MMP-2和MMP-9蛋白的表達

討論

肝細胞癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，而中國又是肝細胞癌高發(fā)地區(qū)。近年來，肝癌的治療手段日益增多，但是治療效果卻并不理想，腫瘤的復發(fā)和轉移時有發(fā)生，降低了患者生存率。肝癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉移是多因素綜合影響的過程，研究肝癌細胞在這個過程中的作用機制并設計針對性的干預措施顯得尤為重要。

Cripto-1是一種細胞膜錨定蛋白，它的結構包括N端信號序列、EGF樣結構域、富含半胱氨酸的CFC序列以及一段較短的C端序列，分子量為21 kD。除了表達于細胞膜表面，Cripto-1還可以作為可溶性蛋白表達[10]。已有研究發(fā)現Cripto-1蛋白或者mRNA在多種惡性腫瘤中高表達；而在正常組織中不表達或低表達，并且能促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[11-13]，這提示Cripto-1可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究中，我們發(fā)現Cripto-1在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，不同肝癌細胞株中均有Cripto-1的表達，并且高于對照細胞，這也提示我們在肝癌的發(fā)生發(fā)展中Cripto-1可能扮演者重要的角色。而肝癌細胞的侵襲轉移是一個多步驟、多因素的過程，其機制也十分復雜，而其中一個重要的過程就是腫瘤細胞降解細胞外基質和基底膜從而向遠處轉移。這個過程中MMPs發(fā)揮了重要作用，作為MMPs家族中的重要成員，MMP-2和MMP-9已被學者證實在肝癌中高表達并且能促進癌細胞侵襲和轉移[14-15]。本研究沉默Cripto-1基因后發(fā)現，肝癌MHCC-97H細胞的侵襲、遷移能力明顯減弱。基于此，我們檢測MMP-2和MMP-9的表達，發(fā)現其表達隨著Cripto-1基因的沉默而受到抑制，因此我們推測Cripto-1可能通過調控MMP-2和MMP-9的表達來促進肝癌細胞的侵襲轉移能力。而具體的調控機制還有待進一步的研究。

綜上所訴，本實驗通過對Cripto-1在肝癌組織和肝癌細胞系中的蛋白表達水平研究發(fā)現Cripto-1可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關，體外實驗也表明Cripto-1能促進肝癌的侵襲轉移。因此，Cripto-1基因可能成為肝癌治療的潛在靶點，干預Cripto-1可能為肝癌的治療提供新思路。

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(責任編輯： 盧萍， 余小慧)

Effects of Cripto-1 gene silencing on invasion and migration of hepatocellular carcinoma cell line MHCC-97H

HUANG Tao, LI Shao-qiang, GUO Yi-zhan, FU Shun-jun, PENG Bao-gang, LIANG Li-jian

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:lisq@medmail.com.cn)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the expression of Cripto-1 in hepatocellular carcinoma (HCC) and the effects of Cripto-1 gene silencing on the invasion and migration of MHCC-97H cells. METHODS: The protein expression of Cripto-1 in the tumor tissues, paracancerous tissues and different HCC cell lines was detected by Western blot. The hepatocellular carcinoma paraffin-embedded specimens (n=80) were collected. The protein expression of Cripto-1 was detected by immunohistochemical method. The Cripto-1 siRNA or control siRNA was transfected into the MHCC-97H cells. The expression of Cripto-1 at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blot, respectively. Transwell migration and invasion experiments were performed to measure the migration and invasion abilities. Finally, the protein expression of matrix metalloprotein-ase (MMP)-2 and MMP-9 in the MHCC-97H cells transfected with Cripto-1 siRNA was detected by Western blot. RESULTS: The protein expression of Cripto-1 in the tumor tissues was significantly higher than that in the paracancerous tissues. Meanwhile, the protein expression of Cripto-1 in the HCC cell lines (highest in MHCC-97H cells) was higher than that in the control cell line. The results of immunohistochemistry show the positive rate of Cripto-1 in HCC was 88.7%. Compared with control group, the expression of Cripto-1 at mRNA and protein levels was notably down-regulated in the MHCC-97H cells transfected with Cripto-1 siRNA, so was the expression of MMP-2 and MMP-9. In addition, the migration and invasion abilities of MHCC-97H cells transfected with Cripto-1 siRNA were decreased. CONCLUSION: Over-expression of Cripto-1 may be closely associated with the occurrence and development of HCC. Cripto-1 gene silencing decreases the migration and invasion abilities of MHCC-97H cells, which may act via inhibiting the expression of MMP-2 and MMP9.

[KEY WORDS]Neoplasm invasiveness; Neoplasm metastasis; Small interfering RNA; Cripto-1 gene; Hepatocellular carcinoma

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0089- 06

[收稿日期]2015- 09- 23[修回日期] 2015- 11- 25

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81472254)

通訊作者△Tel:020-87755766; E-mail: lisq@medmail.com.cn

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.015