蛋白激酶D1促血管新生的體內外實驗分析*

楊　雷，　劉　暖,　毛秉豫，　徐國昌，　葉松山，　張培華，　張瓅方

(南陽理工學院醫學實驗中心，河南 南陽 473004)

·短篇論著·

蛋白激酶D1促血管新生的體內外實驗分析*

楊雷，劉暖,毛秉豫△，徐國昌，葉松山，張培華，張瓅方

(南陽理工學院醫學實驗中心，河南 南陽 473004)

[摘要]目的： 探討蛋白激酶D1(PKD1)促血管新生的作用，為心肌梗死等缺血性疾病以PKD1為治療靶點提供新的思路。方法: 體外培養、分離和鑒定內皮祖細胞(EPCs)，觀察PKD1及其特異性阻斷劑CID755673對EPCs中血管內皮生長因子(VEGF)及其受體KDR表達的影響。復制大鼠心肌梗死模型，分析PKD1及CID755673干預對大鼠心肌梗死后受損心肌組織病理形態學、微血管和內皮細胞變化以及VEGF、KDR表達的影響。結果: EPCs體外細胞培養實驗表明，PKD1可明顯上調EPCs中VEGF和KDR的表達水平。大鼠心肌梗死動物實驗結果表明，PKD1干預后的大鼠心肌組織排列較為有序，結構較為清晰，內皮細胞胞膜光滑、完整，周細胞可見，心肌組織中的VEGF和KDR表達水平顯著上調。結論: PKD1有明顯的促血管新生作用，該作用可能是通過VEGF介導而實現的。

[關鍵詞]蛋白激酶D1； 心肌梗死； 血管新生； 內皮祖細胞； 血管內皮生長因子

蛋白激酶D(protein kinase D, PKD)屬于鈣/鈣調蛋白依賴性的絲氨酸/蘇氨酸激酶，家族成員主要包括PKD1、PKD2以及PKD3，參與多種組織細胞的遷移、增殖、跨膜轉運、免疫反應等[1-2]。PKD1還是腫瘤血管形成進程中的關鍵調控蛋白之一，抗PKD1抑制腫瘤血管的成熟而促進腫瘤細胞凋亡的治療策略已應用于臨床并取得了較為積極的效果[3]。和腫瘤治療策略相反，促血管新生療法是心肌梗死治療的理想策略之一，PKD1既然是腫瘤血管新生的關鍵調控蛋白之一，是否也在缺血受損的心肌組織中發揮著重要的作用？是否有望成為心肌梗死治療的潛在靶點？

在本課題組前期的實驗研究中，我們從體外細胞培養水平觀察到PKD1有明顯的促進骨髓源性內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的黏附、遷移、增殖和血管形成能力的作用，并且上調EPCs中eNOS mRNA的表達和蛋白表達水平[4]。在此基礎上，我們擬進一步探討PKD1對EPCs中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及含激酶插入區受體(kinase insert domain receptor, KDR)表達的影響，并從動物整體實驗水平探討PKD1對心肌梗死后受損心肌組織病理形態學變化以及VEGF、KDR表達的影響，為以“PKD1”為靶點治療心肌梗死提供更深入的理論支持。

材料和方法

1實驗動物、儀器、藥物與試劑

SD大鼠購自河南省實驗動物中心，雄性，清潔級，8周齡，重約200～240 g，動物生產許可證號為SCXK(豫)2010-0002，動物質量合格證號為1000142。

A2-1389型生物安全柜(Thermo Scientific)；164-5052型PowerPac HC 電泳儀及FACSCanto II型流式細胞儀(Bio-Rad)；Bullet Blender Storm組織細胞破碎儀(Next Advance)； T25組織勻漿機(IKA)；HX-100E型小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)；ERM-3100型半自動病理切片機(蘇州郝思琳科技有限公司)；TKY-BMB型石蠟包埋機(深圳博大精科技實業有限公司)；Nikon Tis型熒光顯微鏡及NIS-Elements Software BR分析系統(Nikon)； SU3500型高清掃描電子顯微鏡(HITACHI)。

PKD1購自Pierce；PKD1特異阻斷劑CID755673購自Med Chem Express；DNA酶 I、Dulbecco’s PBS、胎牛血清、膠原酶I購自上海寶曼生物科技有限公司；EBM-2培養基購自北京達科為生物技術有限公司；VEGF、KDR抗體購自天津恒業生物科技有限公司；羊抗兔IgG、DAB顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司；纖連蛋白(fibronectin，FN)、FITC和DAPI購自北京碧橙藍生物科技有限責任公司；其它試劑為國產分析純。

2方法

2.1EPCs的體外分離、培養和鑒定及實驗分組EPCs的體外分離、培養和鑒定參見本課題組前期的研究文獻[4]。提前用FN(50 mg/L)包被6孔細胞培養板，將EPCs用含2% 胎牛血清的EBM-2的基礎培養基重懸，每孔105個加入6孔培養板中，待細胞貼壁后，更換無血清培養基培養。實驗分3個組：空白對照組；PKD1(100 μg/L)處理組；PKD1+CID755673(100 μg/L)處理組，以下簡稱CID755673處理組。每組設置6個復孔，實驗重復3次。

2.2PKD1對EPCs中VEGF、 KDR mRNA轉錄表達的影響TRIzol法提取EPCs中總RNA，根據GenBank序列，分別設計VEGF、KDR的上、下游引物，VEGF的上游引物為5’-ATGAACTTTCTGCTCTCTTGGG-3’，下游引物為5’-CTCTCCTATGTGCTGGCTTTG-3’，產物長度354 bp；KDR上游引物為5’-TCACGGTTGGGCTACTGC-3’，下游引物為5’-AGACCTTCTGCCATCACG-3’，產物長度418 bp。每組細胞取2 μg總RNA，根據試劑盒的說明書逆轉錄合成cDNA，再取2 μg逆轉錄產物進行普通PCR，擴增條件為：94 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；延伸5 min。取反應產物10 μg進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后AlphaView SA軟件攝圖，并分析VEGF、KDR與β-actin的灰度比值。

2.3PKD1對EPCs中VEGF、KDR蛋白表達的影響應用Next Advance Bullet Blender Storm組織細胞破碎儀將EPCs打碎，勻漿，4 ℃下12 000×g離心2 min，提取組織總蛋白后Bradford法測定蛋白濃度，取其中20 μg蛋白進行12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h后洗膜，標記1∶1 000稀釋的VEGF、KDR的 I 抗，4 ℃過夜，洗膜，與辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG(1∶2 000稀釋)孵育1 h后TBST洗膜，沖洗后暗室曝光顯影。同時以β-actin蛋白表達水平作為內參照。膠片經成像分析系統掃描，并應用AlphaView SA軟件分析各樣本與β-actin蛋白灰度的比值，記錄蛋白相對含量。

2.4心肌梗死模型建立及分組參照我們之前的研究[2]，采用冠狀動脈左前降支結扎造模方法復制大鼠心肌梗死模型。術后存活達2 d以上的心肌梗死大鼠隨機被分為模型組、PKD1處理組、CID755673處理組，另設正常對照組，每組8只大鼠。PKD1處理組大鼠按照10 mg·kg-1·d-1的標準腹腔注射PKD1，模型組注射等量的生理鹽水，CID755673處理組大鼠在PKD1處理組的基礎上按照10 mg·kg-1·d-1的標準同時腹腔注射CID755673。連續飼養14 d后處死大鼠。

2.5HE染色下PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織形態學變化的影響取大鼠術后的心尖部心肌組織，用液氮快速冷凍，之后用10%的甲醛浸泡固定，沿左室長軸的中點行組織切片，其厚度保持在4 μm左右。用去離子水清洗切片組織后，蘇木精染色3～5 min，再次用去離子水清洗后，置入含1% HCl的無水乙醇中固定，之后再用伊紅染色1～4 min，去離子水清洗干凈，無水乙醇固定后石蠟包埋，光學顯微鏡下觀察分析。

2.6電鏡下PKD1對心肌梗死大鼠心肌超微結構變化的影響剪取大鼠術后的心尖部梗死區少許心肌組織，用生理鹽水洗去血跡并移至盛滿碎冰的玻璃培養皿上，組織周圍保持有適量2.5%戊二醛，用雙面刀片迅速將組織切成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm小塊，立即移至2.5%戊二醛固定液中固定3 h后1%鋨酸固定，梯度脫水，環氧樹脂與丙酮包埋、聚合成塊，超薄切片(50 nm)，醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察、攝片。

2.7PKD1對心肌梗死大鼠VEGF和KDR mRNA轉錄表達的影響取出-80 ℃冰箱的凍存管中100 mg梗死區心肌組織，IKA-T 25勻漿機制成勻漿，4 ℃下12 000×g離心5 min，TRIzol法提取總RNA后進行mRNA檢測。

2.8PKD1對心肌梗死大鼠心肌VEGF、KDR蛋白表達變化的影響組織勻漿的制作方法同2.7部分，常規方法提取勻漿組織總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度后進行蛋白檢測。

3統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間均數比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1EPCs的鑒定

EPCs呈卵圓形、紡錘形或者不規則狀，EPCs結合FITC后呈現綠色，DAPI 復染后胞核呈藍色；CD133、CD34或KDR表達呈陽性，相關結果已在本課題組前期論文[4]中發表。

2PKD1對EPCs中VEGF和KDR mRNA及蛋白表達的影響

和對照組相比，PKD1處理組VEGF、KDR mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01)，加入CID755673處理之后，EPCs中VEGF、KDR mRNA和蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The effects of PKD1 on the mRNA and protein expression of VEGF and KDR in the EPCs.Mean±SD.n=6.**P<0.01vsPKD1 group.

圖1PKD1對EPCs中VEGF和KDR mRNA及蛋白表達的影響

3HE染色下PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織形態學的影響

正常對照組大鼠組織形態規整，細胞輪廓清晰。模型大鼠心肌組織排列錯亂，細胞輪廓模糊，有核溶解現象，壞死心肌組織呈現明顯的纖維化，形態學上清晰完整的血管少見；和模型組相比，PKD1處理組大鼠心肌組織排列相對有序，心肌細胞輪廓較為清晰，明顯可見形態學上清晰完整的血管;加入CID755673處理之后，心肌組織形態學接近模型組大鼠，見圖2。

Figure 2.The effects of PKD1 on the myocardial pathomorphology and myocardial ultrastructure in the rats with myocardial infarction.

圖2PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織形態學變化的影響

4PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織超微結構變化的影響

正常對照組大鼠心肌組織排列整齊，閏盤清晰，內皮細胞完整。模型組大鼠心肌組織排練紊亂，閏盤不太清晰，殘存的血管管壁內皮細胞嚴重皺縮，體積明顯縮小，完整的內皮細胞少見；和模型組比較，PKD1處理組大鼠心肌組織形態清晰、規則，血管內皮細胞胞膜光滑完整，處在增殖狀態的胞核較多，周細胞可見；加入CID755673處理之后，內皮細胞皺縮，胞膜模糊，周細胞消失，清晰完整的內皮細胞明顯減少，見圖2。

5PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織VEGF和KDR mRNA及蛋白表達的影響

和正常對照組相比，模型組大鼠心肌組織VEGF的mRNA和蛋白表達水平略有升高，KDR mRNA和蛋白表達水平略有降低，但均無統計學差異；和模型組比較，PKD1處理組大鼠心肌組織VEGF、KDR mRNA和蛋白表達水平均顯著增加(P<0.01)；加入CID755673處理之后，VEGF的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The effects of PKD1 on the mRNA and protein expression of VEGF and KDR in the rats with myocardial infarction. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsPKD1 group.

圖3PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織VEGF和KDR mRNA及蛋白表達的影響

討論

在前期的實驗研究中，我們分別從PKD1誘導和阻斷2個截然相反的角度證實了PKD1可以明顯促進大鼠骨髓源性EPCs的黏附、遷移和血管形成能力，并且時間依賴性地促進EPCs增殖[4]。骨髓源性EPCs的黏附、遷移和增殖是應對心肌梗死等缺血性組織損傷的一種自然反應，明顯促進受損組織區域內微血管的新生。本研究進一步證實，PKD1可顯著上調骨髓源性EPCs中VEGF及其受體KDR的表達。VEGF是EPCs介導的血管新生的重要參與者，在血管新生和管腔形成中扮演著重要的角色[5-6]，小鼠[7]和成人[8]VEGF基因移植治療缺血受損心肌的療法均證實VEGF通過動員骨髓源性EPCs而在血管新生中發揮著關鍵作用。在促血管新生的進程中，VEGF的受體KDR介導的信號通路可活化絲裂原活化蛋白激酶相關途徑，誘導肌動蛋白的改組、內皮細胞的趨化和遷移，增加細胞有絲分裂的能力，促進內皮細胞的增殖[9]。同時，還可以調節內皮細胞間及內皮細胞與基質間的相互作用，表現出明顯的血管腔化作用和增加血管的通透性[10]。這表明，PKD1促大鼠骨髓源性EPCs黏附、增殖、遷移和血管形成能力的作用與VEGF及其受體KDR密切相關。

心肌梗死后心肌組織的缺血損傷激發促血管新生信號，生長因子、NO和內皮細胞被激活，內皮細胞之間的連接松散，周細胞從血管壁分離，血管通透性增加，血漿蛋白外滲，為內皮細胞的遷移提供了必要的基質成分[11]。之后，在一種叫做“端細胞”的特異內皮細胞的調控下，微血管的“芽”出現，鄰近的內皮細胞增殖以拓展“芽”的長度，最終管腔形成，周細胞聚集以加固新形成的管腔的穩定性[11]，這一進程主要受VEGF及其受體KDR所誘導調控。本研究中PKD1可以明顯改善心肌梗死大鼠紊亂的心肌組織形態，促進大鼠受損心肌組織微血管數量的增加，電鏡下超微結構分析表明PKD1也可以誘導內皮細胞和周細胞的增生，這為受損心肌組織內血管的新生提供了必要的條件。此外，增生的內皮細胞和心肌梗死后心肌組織中殘存的正常細胞之間的“串話”調控著心肌細胞的收縮能力[12]，并且以一種依賴NO的作用方式對缺血損傷的心肌細胞起到藥理學意義上的保護作用[13]。進一步實驗證實，PKD1明顯上調梗死心肌組織中VEGF及其受體KDR的表達。VEGF家族成員在心肌梗死后的血管新生中發揮著極其重要的作用，VEGF與其受體KDR結合后可以促進內皮細胞的分化、增殖和遷移，為新生血管的形成提供了必要條件[14]。在人或者嚙齒類動物心肌梗死后缺血的心肌組織中，受缺氧或者牽張等因素的刺激誘導[15-16]，通過缺氧誘導因子-1的作用，VEGF被快速激活，促進新生血管的管腔形成。這表明，PKD1促血管新生的作用可能是通過VEGF信號通路所介導的。

之前的研究表明，來自血管內皮細胞的VEGF可以誘導PKD1的激活，從而在內皮細胞的增殖和遷移以及微血管的新生中發揮著重要的作用[17]，而本研究證實PKD1有顯著上調EPCs中VEGF mRNA和蛋白表達的作用。這表明，PKD1和VEGF之間可能存在著相互調控、相互促進的作用。這也意味著，PKD1有明顯的促血管新生作用，有望成為繼VEGF之后缺血性心臟病新的治療靶點。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Promoting angiogenesis of protein kinase D1 in vitro and in vivo

YANG Lei, LIU Nuan, MAO Bing-yu, XU Guo-chang, YE Song-shan, ZHANG Pei-hua, ZHANG Li-fang

(MedicalExperimentalCenter,NanyangInstituteofTechnology,Nanyang473004,China.E-mail:maobingyu2005@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the effect of protein kinase D1 (PKD1) on promoting angiogenesis in vitro and in vivo, and to furnish a new idea on targeting PKD1 for the treatment of ischemic heart disease such as myocardial infarction. METHODS: The culture, isolation and identification of endothelial progenitor cells (EPCs) were performed in vitro. The effects of PKD1 and its specific blocking agent CID755673 on expression levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) and kinase insert domain receptor (KDR) in EPCs were determined. The rat model of myocardial infarction was established, the intervention effects of PKD1 and CID755673 on morphology, changes of microvessels and endothelial cells, and the expression of VEGF and KDR in the impaired myocardial tissue were analyzed. RESULTS: PKD1 significantly upregulated the expression of VEGF and KDR in EPCs in vitro. Meanwhile, the structure of myocardial tissue was more regular and clear, the cytomembrane of endothelial cells were more smooth and integrity, the pericytes were visible, and the expression of VEGF and KDR was significantly increased in PKD1 treatment group in vivo.CONCLUSION: PKD1 has the ability of angiogenesis obviously, which might be mediated by VEGF.

[KEY WORDS]Protein kinase D1; Myocardial infarction; Angiogenesis; Endothelial progenitor cells; Vascular endothelial growth factor

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0146- 06

[收稿日期]2015- 04- 06[修回日期] 2015- 11- 24

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目 (No. 81473438; No. 81202791)；河南省中醫內科學重點學科支撐課題(豫教高[2012]186號)

通訊作者△Tel: 0377-62071305； E-mail: maobingyu2005@126.com

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.025