胡桃醌對卵巢癌SKOV3細胞氧化應激和凋亡的影響*

方　芳，　趙良中，　李　強，　陳　爽，　姜曉明，　張　鐸，　王立國

(吉林醫藥學院 1免疫學教研室， 2附屬醫院，吉林 吉林 132013)

胡桃醌對卵巢癌SKOV3細胞氧化應激和凋亡的影響*

方芳1，趙良中1，李強1，陳爽1，姜曉明1，張鐸1，王立國2△

(吉林醫藥學院1免疫學教研室，2附屬醫院，吉林 吉林 132013)

[摘要]目的： 探討胡桃醌對人卵巢癌SKOV3細胞的毒性作用及機制。方法: 采用MTT法檢測胡桃醌對卵巢癌SKOV3細胞生長的作用；流式細胞術檢測胡桃醌對卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響；采用DCF-DA染色熒光顯微鏡觀察細胞內的活性氧簇(ROS)水平；采用Western blot檢測卵巢癌SKOV3細胞細胞色素C(Cyt C)和活化caspase-3的水平。結果: 與對照組比較，胡桃醌對SKOV3細胞的生長有明顯抑制作用，且抑制作用隨藥物濃度和時間的增加而增強(P<0.05)。流式細胞術檢測50 μmol/L胡桃醌作用細胞24 h和48 h后誘導細胞凋亡，早期凋亡率和晚期凋亡率均高于對照組(P<0.01)。胡桃醌顯著提高細胞內的ROS水平，上調細胞Cyt C和活化caspase-3的蛋白水平。結論: 胡桃醌通過促進SKOV3細胞ROS的積累誘導細胞凋亡和抑制細胞生長。

[關鍵詞]胡桃醌； 卵巢癌； 活性氧簇；細胞凋亡

人們很早就發現核桃楸樹皮、果皮具有抗腫瘤、抗炎和殺蟲的作用，在中國許多治療癌癥的驗方中都含有核桃楸成分。胡桃醌(juglone)又名5-羥基-1, 4-萘醌，是一種天然環狀醌類，可從胡桃楸的葉及外殼中提取。目前已有報道胡桃醌具有抗肝癌、肉瘤、前列腺癌、白血病等作用[1-4]。胡桃醌是否能夠抑制卵巢癌細胞生長相關報道較少。本研究在體外利用胡桃醌刺激卵巢癌SKOV-3細胞，通過檢測細胞增殖、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)及凋亡相關分子的表達等，探討胡桃醌對人卵巢癌SKOV3細胞的抗腫瘤作用。

材料和方法

1材料和主要試劑

胡桃醌和溴化四氮唑藍[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2， 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT](Sigma)；活性氧檢測試劑盒和Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒(碧云天生物有限公司)；DMEM 培養基及胰酶(Gibco)；胎牛血清(fetal calf serum，FCS)購自杭州四季青公司；細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)抗體和活化caspase-3 抗體(Epitomics)。

2主要方法

2.1細胞培養人卵巢癌細胞SKOV3細胞株為本實驗室保存。將人卵巢癌細胞SKOV3細胞株于37 ℃、5% CO2培養箱中，用DMEM+10% FCS培養，隔日換液，取對數生長期細胞進行實驗。

2.2MTT比色法檢測SKOV3細胞的活力取對數生長期細胞，制備成SKOV3單細胞懸液，調整細胞濃度為1×108/L，體積為200 μL，接種于96 孔板內，于37 ℃、5% CO2條件下培養。加入胡桃醌培養液，每組設3復孔(終濃度分別為100、50、25、12.5和6.25 μmol/L)，同時設立正常對照組。體外培養24 h和48 h以MTT法測定吸光度(A)值，實驗重復3次。

2.3細胞死亡檢測取對數生長期細胞，制備成SKOV3單細胞懸液，調整細胞濃度為1×108/L，體積為200 μL，接種于96 孔板內，于37 ℃、5% CO2條件下培養。加入胡桃醌培養液，每組設3復孔(終濃度分別為100、50、25、12.5和6.25 μmol/L)，同時設立正常對照組。將培養板中細胞用消化液消化并離心收集細胞，取100 μL細胞懸液，加100 μL 0.8%臺盼藍溶液，混勻，每個樣品至少計數200個細胞，并重復3次，藍色的細胞被記為死亡細胞，迅速用計數板計數。

2.4流式細胞術檢測細胞凋亡變化取對數生長期細胞，調整細胞濃度為1×108/L，接種于6孔板中，每組設3個平行孔，加入50 μmol/L胡桃醌，培養24 h后70%乙醇4 ℃固定過夜。上機前離心去除乙醇，PBS洗2次，加入含2% Triton X-100和50 mg/L RNase A 的PBS 100 μL，每孔加入PI溶液100 μL，4 h避光染色30 min，再加200 μL PBS將細胞懸起，用流式細胞儀檢測。

2.5ROS活性的檢測終濃度為50 μmol/L胡桃醌作用SKOV3細胞24 h后，棄培養液，加入無血清DMEM培養液稀釋的DCF-DA(2 μmol/L)，37 ℃繼續培養1 h，PBS洗3次，熒光顯微鏡(Olympus)觀察結果。使用圖像分析軟件進行熒光強度分析。

2.6蛋白免疫印跡法檢測Cyt C和活化caspase-3蛋白水平終濃度為50 μmol/L胡桃醌刺激細胞24 h后，PBS 洗1次，加入細胞裂解液100 μL，加入蛋白酶抑制劑，冰上裂解1 h，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，蛋白定量后，加入2×上樣緩沖液，煮沸5 min，12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳轉印到硝酸纖維素膜上，利用Cyt C和活化caspase-3特異性抗體和辣根過氧化物酶標記的 II 抗檢測，加底物發光顯影。使用Quantity One軟件掃描并做灰度分析。

3統計學處理

應用SPSS 17. 0 軟件進行數據分析，數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，組間差異比較采用t檢驗或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1胡桃醌對SKOV3細胞的生長抑制

不同濃度胡桃醌處理SKOV3細胞24 h和48 h后采用MTT法檢測各組吸光度。與對照組比較，胡桃醌對SKOV3細胞的活力具有明顯的抑制作用。隨著胡桃醌濃度和刺激時間的增加，SKOV3細胞活力逐漸降低,細胞死亡數量逐漸增高，見圖1。

Figure 1.The effect of juglone on the proliferation of SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1胡桃醌對SKOV3細胞增殖的影響

2Annexin V/PI 雙染色法檢測凋亡率

50 μmol/L的胡桃醌作用SKOV3細胞24 h和48 h后，通過Annexin V/PI雙染細胞，經流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果顯示，對照組早期凋亡率分別為0.8%±0.1%和1.7%±0.1%；晚期凋亡率分別為1.8%±0.3%和3.6%±0.8%。實驗組早期凋亡率分別為19.7%±2.9%和8.9%±0.6%；晚期凋亡率分別為51.1%±4.7%和70.1%±5.9%，2組間差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effect of juglone on the apoptosis of SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2胡桃醌誘導SKOV3 細胞凋亡的影響

3胡桃醌對SKOV3細胞ROS水平的影響

熒光探針DCF-DA能夠被細胞內的ROS氧化生成DCF，在熒光顯微鏡下發出綠色熒光，其熒光強度與細胞內的ROS水平呈正比。50 μmol/L胡桃醌作用SKOV3細胞24 h后，實驗組熒光強度為45.3±4.1，對照組熒光強度為21.7±1.9。與對照組比較，實驗組熒光強度顯著增加(P<0.05)。

4Western blot 檢測Cyt C和活化caspase-3的蛋白水平變化

50 μmol/L的胡桃醌處理SKOV3細胞24 h后，蛋白免疫印跡法檢測Cyt C和活化caspase-3表達水平。結果顯示，與對照組比較Cyt C和活化caspase-3的表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖 3。

討論

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一，其發病率居婦科腫瘤第3位。然而卵巢癌的死亡率高居婦科瘤首位，5年生存率仍然徘徊在30%左右[5]。因此，迫切需要尋找新的治療方法，以延緩復發和提高卵巢癌患者的生存率。我國的藥用植物物質資源豐富，已發現含有抗癌活性成分的植物有200種左右。胡桃醌是從胡桃屬植物中的新鮮根皮、枝皮、青果皮中分離出來的羥基萘醌類化合物，能夠抑制細胞生長，具有抗腫瘤作用。因此，有必要研究對卵巢癌治療有效的藥物。

Figure 3.The effect of juglone on the protein levels of Cyt C and activated-caspase-3 in the SKOV3 cells. Meran±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3胡桃醌對SKOV3細胞Cyt C和活化caspase-3蛋白水平的影響

本研究通過不同濃度的胡桃醌作用于SKOV3細胞，采用MTT法測定細胞存活率，實驗證明隨著胡桃醌濃度增加對SKOV3細胞抑制作用越顯著。流式細胞術分析其凋亡率發現，胡桃醌對SKOV3細胞抑制作用主要表現為誘導細胞凋亡，但機制不清。已有研究證實，氧化應激與細胞凋亡有密切的關系，其細胞凋亡過程多是由于氧化應激引起。氧化應激通過線粒體、死亡受體、內質網應激等途徑介導細胞凋亡。氧化應激反應可導致 ROS 產生，細胞中 ROS 的增加被認為是腫瘤細胞發生發展的不利因素。ROS 是細胞內氧分子還原而成的一系列具有強氧化活性的小分子，能夠引起線粒體的氧化損傷[6]。線粒體主要可發生線粒體膜電位下降，崩解；能量供給系統受損，轉運小孔開放，膜間內含物Cyt C 從線粒體中釋放到細胞漿。細胞漿中的Cyt C 能與凋亡相關因子1 結合，使其形成多聚體，并促使caspase-9 與其結合形成凋亡小體，進而激活下游caspase-3，引起級聯反應，從而誘導細胞凋亡[7]。研究表明，一些藥物和小分子化合物可引起腫瘤細胞ROS的增加，導致細胞凋亡，而對正常細胞影響較小[8]。一些藥物也正是基于這一理論而起到抗腫瘤作用的，例如三氧化二砷和二甲基雌二醇等皆通過增加胞內 ROS 而誘導腫瘤細胞凋亡[9]。我們發現，經胡桃醌刺激24 h后，SKOV3細胞內ROS水平顯著升高，與胡桃醌誘導的細胞凋亡呈正相關；同時我們發現在胡桃醌組Cyt C和活化caspase-3表達顯著高于對照組。因此，ROS的過度累積導致線粒體損傷可能是胡桃醌殺死腫瘤細胞的主要機制之一。

總之，作為一種高效的抗腫瘤藥物，胡桃醌能夠抑制卵巢癌細胞的增殖、誘導caspase依賴的細胞凋亡，具體機制與細胞內ROS的異常累積有密切關系。

[參考文獻]

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Role of juglone in regulating oxidative stress and apoptosis in ovarian cancer SKOV3 cells

FANG Fang1, ZHAO Liang-zhong1, LI Qiang1, CHEN Shuang1, JIANG Xiao-ming1, ZHANG Duo1, WANG Li-guo2

(1DepartmentofImmunology,2AffiliatedHospital,JilinMedicalUniversity,Jilin132013,China.E-mail:urolancet@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the cytotoxicity of juglone on ovarian cancer SKOV3 cells. METHODS: The activity of SKOV3 cells was detected by MTT assay. The cells apoptosis was examined by flow cytometry. The level of reactive oxygen species (ROS) was measured by DCF-DA staining. The protein levels of cytochrome C (Cyt C) and activated caspase-3 were evaluated by Western blot. RESULTS: MTT assay showed that juglone significantly inhibited the growth of SKOV3 cells in dose- and time-dependent manners (P<0.05). The early apoptotic rate and late apoptotic rate of SKOV3 cells in 50 μmol/L juglone group at 24 and 48 h were higher than those in control group (P<0.01).Moreover, juglone induced ROS accumulation, and increased the protein levels of Cyt C and activated caspase-3.CONCLUSION: Juglone inhibits the cell growth and induces the apoptosis of SKOV3 cells by ROS accumulation.

[KEY WORDS]Juglone; Ovarian cancer; Reactive oxygen species; Apoptosis

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0156- 04

[收稿日期]2015- 06- 25[修回日期] 2015- 11- 03

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81202031);吉林市科技局基金資助項目(No. 2013625028)

通訊作者△Tel: 0432-64560741; E-mail: urolancet@sina.com

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.027