過表達IGF-1對臍帶間充質干細胞氧化損傷的抑制作用*

趙　雷，　陳　昕，　馮業童，　劉朋飛

(暨南大學第二臨床醫學院，深圳市人民醫院 1 麻醉科， 2檢驗科，廣東 深圳 518020； 3中山大學人類病毒學研究所，廣東 廣州 510080； 4吉林大學藥學院再生醫學系，吉林 長春 130021)

過表達IGF-1對臍帶間充質干細胞氧化損傷的抑制作用*

趙雷1，陳昕2，馮業童3，劉朋飛4△

(暨南大學第二臨床醫學院，深圳市人民醫院1麻醉科，2檢驗科，廣東 深圳 518020；3中山大學人類病毒學研究所，廣東 廣州 510080；4吉林大學藥學院再生醫學系，吉林 長春 130021)

[摘要]目的： 分析過表達胰島素樣生長因子1(IGF-1)對臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)氧化損傷的抑制作用，開發UC-MSCs新的應用模式。方法: 通過酶消化法，從臍帶組織中分離UC-MSCs，并采用流式細胞術對細胞的表面特異標志物進行鑒定，通過逆轉錄病毒感染體系，構建過表達IGF-1的UC-MSCs(UC-MSCs-IGF-1)，并進一步通過實時熒光定量PCR和流式細胞術對UC-MSCs-IGF-1的IGF-1表達水平進行評價，同時分析UC-MSCs-IGF-1的表面標志物及成骨成脂分化能力；用不同濃度的H2O2(0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L)處理細胞，分析UC-MSCs-IGF-1在增殖活力維持、抗氧化損傷和抗凋亡方面的優勢。結果: UC-MSCs表面標志物CD29、CD90和CD105的表達均呈陽性，而CD34的表達為陰性，符合正常間充質干細胞的表型特征；實時熒光定量PCR和流式細胞術結果表明，應用逆轉錄病毒感染體系構建的UC-MSCs-IGF-1在IGF-1表達方面遠高于正常UC-MSCs，同時干細胞表型與UC-MSCs一致，且具備正常的成脂成骨分化能力；在H2O2的氧化損傷作用下，與UC-MSCs相比，UC-MSCs-IGF-1具有較強的增殖活力和抗氧化、抗凋亡功能，同時細胞中的SOD活性略高于UC-MSCs。結論: 過表達IGF-1對UC-MSCs的氧化損傷及氧化引起的凋亡均具有一定的防護作用，與正常UC-MSCs相比，UC-MSCs-IGF-1可能在臨床應用方面具有一定的優勢。

[關鍵詞]臍帶間充質干細胞； 胰島素樣生長因子1； 氧化損傷；細胞凋亡

近年來，以干細胞特別是成體干細胞為基礎的新型治療模式，已在多種疾病的治療上進行了深入研究[1-4]。臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)具有多向分化潛能，還能夠遷移至受損組織處，通過分泌營養因子促進損傷組織修復，在體內發揮功能的過程中未見成瘤性[5-6]。同時，UC-MSCs的免疫學特性也在很大程度上擴寬了它的應用范圍，這種細胞不僅具有免疫調節能力，而且，基于自身的低免疫源性特點，該細胞在異體移植方面也具有著較好的應用前景[3, 7-9]。

胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor-1，IGF-1)是一種結構類似胰島素的多肽類細胞因子，主要在肝臟合成，是具有促進細胞分化和增殖作用的單鏈蛋白，生物作用廣泛，參與機體多種器官功能調節，在人和脊椎動物的胚胎發育和機體正常成長發育過程中起著重要作用[10]。近年來，研究人員發現IGF-1具有一定的抗氧化損傷的作用，該功能在多種細胞氧化損傷的抑制方面均得到了一定驗證，即在細胞培養體系中加入IGF-1，可以起到抵抗氧化損傷的作用[11-12]。但是，IGF-1對UC-MSCs的氧化損傷抑制作用尚不明確。此外，這種技術模式需要持續給予外源的IGF-1，對許多應用方面具有一定的局限性。

針對這些問題，本課題組擬通過基因調控技術，使UC-MSCs能持續表達IGF-1，探索過表達IGF-1的UC-MSCs在抗氧化功能方面的優越性，為UC-MSCs在臨床方面的合理化應用提供一定的理論參考和技術支持。

材料和方法

1主要試劑和儀器

DMEM/F12培養基及胎牛血清購自Gibco；TRIzol RNA提取液購自Invitrogen；RNA反轉錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒均購自TaKaRa；所有引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成；CCK-8試劑盒購自Dojindo；人源CD29-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC和IGF-1-PE單克隆抗體均購自BD；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)染色試劑盒、油紅O(oil red O)染色試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)分型測試盒購自南京建成生物工程研究所。

IX-70倒置相差顯微鏡及正置生物學顯微鏡均購自日本 Olympus；PCR儀購自北京東勝創新生物科技有限公司；CFX96實時定量PCR儀購自Bio-Rad；FACSCalibur 流式細胞儀購自BD；EXL-808酶標檢測儀購自Bio-Tek。

2實驗方法

2.1人源UC-MSCs的分離和鑒定取分娩后的臍帶組織，用PBS液清洗組織3遍，用眼科剪刀將組織標本剪碎；加IV型膠原蛋白酶(2 g/L)與剪碎組織混勻，置于37 ℃、5% CO2培養箱消化4 h，3 000 r/min室溫下離心10 min，棄上清液；再添加I型脫氧核糖核酸酶(1 g/L)重懸細胞沉淀，置于37 ℃、5% CO2培養箱消化15 min，按上述離心條件再次離心，棄上清液；添加0.25%胰酶重懸組織細胞，置于37 ℃、5% CO2培養箱消化15 min，再次離心棄上清液；添加UC-MSCs細胞培養液(DMEM/F12+10%胎牛血清)重懸組織細胞，應用40 μm細胞容器過濾組織塊，將濾液移入鋪有明膠的培養皿中，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養。

收集第3代的UC-MSCs進行后續的檢測和評價。在表面特異標記檢測方面，將1×106UC-MSCs懸浮于0.1 mL PBS中，人源CD29-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC和CD105-FITC單克隆抗體均按1∶50的稀釋比例與UC-MSCs混合，室溫孵育30 min后，用PBS清洗2次，通過流式細胞儀檢測細胞表面標記。另一方面，對細胞在成骨分化和成脂分化方面的能力進行評價，分別采用成骨分化培養基(在基礎培養基中，附加地塞米松10-4mmol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L和維生素C 50 mg/L)和成脂分化培養基(在基礎培養基中，附加地塞米松10-3mmol/L、胰島素10 mg/L、IBMX 0.5 mmol/L和吲哚美辛0.2 mmol/L)對細胞進行培養，隔日換液1次，培養3～4周后，分別用AP染色和油紅O染色評價細胞的分化潛能，具體分化方法及檢測同參考文獻[4]。

2.2過表達IGF-1的UC-MSCs的構建pMX-IGF-1過表達載體由吉林大學藥學院生物工程實驗中心提供。本課題中采用293T細胞制備逆轉錄病毒，通過逆轉錄病毒感染的方法構建過表達IGF-1的UC-MSCs(UC-MSCs-IGF-1)。具體實驗方法同參考文獻[13-14]。

對本課題所構建的UC-MSCs-IGF-1其細胞表面標記、成骨分化能力和成脂分化能力進行評價，方法同2.1。此外，分別通過實時熒光定量PCR和流式細胞術方法檢測細胞過表達IGF-1的程度。同時，通過實時熒光定量PCR檢測UC-MSCs-IGF-1干細胞標志物的表達情況。收集構建的UC-MSCs-IGF-1，用TRIzol裂解，提取細胞RNA，并進一步通過反轉錄試劑盒獲得細胞基因組cDNA，采用實時熒光定量PCR檢測UC-MSCs-IGF-1中相關基因的表達程度，檢測過程中以正常UC-MSCs和轉染空載體的UC-MSCs-vector為對照組，具體操作按照試劑盒說明書進行，引物序列見表1。

2.3過表達IGF-1的UC-MSCs的抗氧化損傷能力分析分別將正常UC-MSCs、UC-MSCs-vector和UC-MSCs-IGF-1，以每孔2×103cells的數量接種到96孔板中，每組細胞進一步用不同濃度的H2O2(0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L)進行作用處理，采用CCK-8試劑盒檢測細胞在H2O2作用24 h、48 h后的細胞活力，評價各實驗組的抗氧化能力，用僅含培養基的組作為背景組，測量絕對吸光度(實驗組絕對吸光度值=實驗組吸光度值-空白組吸光度值)，每組設4個復孔，具體操作按CCK-8試劑盒說明書進行。另一方面，將細胞以每孔2×105cells的數量接種到6孔板中，處理方法及分組同上，直接用細胞計數器在鏡下計數細胞，結合CCK-8實驗觀察的細胞活力結果，觀察UC-MSCs-IGF-1的增殖能力。

收集各實驗組細胞，采用MDA測定試劑盒和SOD分型測試盒檢測各組細胞MDA 的含量及SOD的活性，觀察過表達IGF-1對細胞凋亡和SOD活性的影響，進一步明確各組細胞的抗氧化能力。具體操作按試劑盒說明書進行。

2.4過表達IGF-1的UC-MSCs在抗氧化損傷過程中的凋亡相關基因分析在H2O2作用48 h后，收集各個實驗組的RNA，反轉錄后檢測各組細胞凋亡基因caspase-3、bax和抗凋亡基因bcl-2的表達程度，從而明確各組細胞的凋亡情況。在凋亡基因檢測中，以β-actin作為內參照，將正常UC-MSCs作為空白對照組，并將基因在空白對照組的表達水平作為“1”，通過等比例比較各實驗組的基因表達水平。實時熒光定量PCR所用引物序列見表1。

3統計學處理

（2）改善鉆井液潤滑性。施工中通過加入1%油基潤滑劑來優化鉆井液潤滑性，作用機理是在親水性的井壁和鉆具表面形成一層疏水性油膜，在增強吸附表面潤滑性的同時，也有助于抑制泥頁巖吸水膨脹分散，降低摩阻。若是摩阻較大的定向井，可向鉆井液中加入10% 原油，并使其充分乳化，以改善鉆井液的潤滑性能和摩阻，阻止壓差卡鉆現象的發生［1］。

應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示；多組均數間比較采用單因素方差分析，并用SNK-q檢驗進行各組之間的兩兩比較。以P<0.05表示差異有統計學意義。

表1　引物序列

F: forward; R: reverse.

結果

1人源UC-MSCs的分離和鑒定結果

分離的人源UC-MSCs在培養1 d后，呈長梭形貼壁狀態生長，隨著培養時間的延長，可見細胞生長密度逐漸增大，由此說明細胞具有一定的增殖能力。此外，通過流式細胞術檢測可見UC-MSCs表達CD29、CD90和CD105(表達效率分別為98.1%、97.2%和90.2%)，基本不表達CD34(表達效率為0.52%)，這種表面標記特征與正常的間充質干細胞相符合，滿足本課題后續研究的需要。同時，細胞具備成骨分化和成脂分化的能力，可見分化后的細胞AP染色和油紅O染色均為陽性，見圖1。

2過表達IGF-1的UC-MSCs的構建及鑒定

將基因在UC-MSCs-IGF-1組的表達水平定為“1”，通過等比例比較各實驗組的基因表達水平。實時熒光定量PCR結果表明，IGF-1逆轉錄病毒感染后的UC-MSCs，在IGF-1表達方面遠高于正常UC-MSCs以及UC-MSCs-vector，差異有統計學意義(P<0.05)。流式細胞術的檢測結果與實時熒光定量PCR的結果相一致，與陰性對照組相比，UC-MSCs、UC-MSCs-vector和UC-MSCs-IGF-1的IGF-1表達效率分別為0.25%、0.32%和97.5%，UC-MSCs-IGF-1中IGF的表達效率遠高于正常UC-MSCs以及UC-MSCs-vector。上述結果證明本課題中所采用的逆轉錄病毒過表達體系效果明顯，可以成功構建過表達IGF-1的UC-MSCs，見圖2。

Figure 1.The morphology and identification of human UC-MSCs and UC-MSCs-IGF-1.

圖1人源UC-MSCs及UC-MSCs-IGF-1的形態及鑒定結果

3過表達IGF-1的UC-MSCs抗氧化損傷的能力評價結果

細胞計數分析結果的大體趨勢與CCK-8的結果基本一致。在用10 μmol/L H2O2處理細胞時，細胞的增殖能力并未見顯著變化，隨著H2O2濃度的提高，各實驗組細胞的增殖能力逐漸下降；在用50 μmol/L H2O2處理時，UC-MSCs和UC-MSCs-vector均呈現一定的增殖抑制現象，而UC-MSCs-IGF-1仍然可以呈現一定程度的增殖趨勢；在用100 μmol/L H2O2處理時，各實驗組均呈現明顯的細胞生長抑制，但是，各實驗組的抑制程度具有顯著區別，作用48 h后，UC-MSCs和UC-MSCs-vector的抑制效率[抑制效率=(0 h相對吸光度-48 h相對吸光度)/0 h相對吸光度×100%]分別為51.9%和51.7%，而UC-MSCs-IGF-1組的抑制效率為16.4%，明顯低于UC-MSCs和UC-MSCs-vector，由此表明UC-MSCs-IGF-1具有一定的抗氧化損傷的作用，見圖3。

對各實驗組SOD的檢測結果表明，UC-MSCs-IGF-1中SOD的活性水平略高于UC-MSCs和UC-MSCs-vector(P<0.05)，所以UC-MSCs-IGF-1可以在一定程度上抵抗H2O2的氧化損傷，維持細胞活力，見圖4。

Figure 2.Evaluation of UC-MSCs-IGF-1 establishment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsUC-MSCs；#P<0.05vsUC-MSCs-vector.

圖2UC-MSCs-IGF-1的構建評價

Figure 3.The proliferation of UC-MSC, UC-MSCs-vector and UC-MSCs-IGF-1 treated with H2O2at different concentrations.A: CCK-8 assay; B: cell counting. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 h；#P<0.05vs24 h.

圖3在不同濃度H2O2的作用下UC-MSCs、UC-MSCs-vector和UC-MSCs-IGF-1的增殖變化

Figure 4.The SOD activity in each group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsUC-MSCs;#P<0.05vsUC-MSCs-vector.

圖4各實驗組SOD活性的檢測結果

4過表達IGF-1的UC-MSCs在抗氧化損傷過程中凋亡相關基因的表達

實時熒光定量PCR檢測的結果表明，在未經H2O2處理或10 μmol/L H2O2處理細胞時，UC-MSCs、UC-MSCs-vector以及UC-MSCs-IGF-1的凋亡基因caspase-3和bas均保持較低水平，而抗凋亡基因bcl-2處于較高的水平，各實驗組未見明顯差異；隨著H2O2濃度的增大，由H2O2引起細胞凋亡逐漸顯著，可見各實驗組均有caspase-3和bax上調，以及bcl-2下調的趨勢，但是，各實驗組的細胞凋亡程度各不一致，與UC-MSCs和UC-MSCs-vector相比，UC-MSCs-IGF-1中的caspase-3和bax的上調程度和bcl-2的下調程度均較弱，且差異有統計學意義(P<0.05)。同時，MDA的檢測結果表明，UC-MSCs-IGF-1中MDA的含量略低于UC-MSCs和UC-MSCs-vector(P<0.05)，由此表明UC-MSCs-IGF-1可以在一定程度上抵抗氧化損傷引起的細胞凋亡，見圖5。

Figure 5.Detection of apoptosis-associated gene expression and MDA in each group treated with H2O2at different concentrations. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsUC-MSCs;#P<0.05vsUC-MSCs-vector.

圖5在不同濃度H2O2的作用下各實驗組凋亡相關基因mRNA表達及MDA的檢測結果

討論

本研究利用逆轉錄病毒構建了UC-MSCs-IGF-1，由于逆轉錄病毒感染體系屬于基因組插入模式，所以，所構建的UC-MSCs-IGF-1是穩定表達IGF-1的UC-MSCs。結果表明，與正常UC-MSCs相比，UC-MSCs-IGF-1在生長形態、表面標記、細胞增殖及成骨成脂分化等方面，未見顯著區別。由此可見，利用逆轉錄病毒感染體系實現的IGF-1過表達，不會影響干細胞的基本生物特性。

IGF-1對細胞氧化損傷的抑制作用已逐漸為研究人員所證實，但是，如何將這一科學理論應用于臨床實踐尚不明確。目前研究表明，通過體外調控，可以優化UC-MSCs的某些生物學特性，同時，UC-MSCs通過靜脈途徑進入體內，對多種疾病均有較好的治療效果[3, 7, 15-16]。但是，正常情況下，人體血液內的IGF-1濃度較低，必須在給予UC-MSCs的同時補充IGF-1才能起到抗氧化損傷的效果，這種方法在很大程度上增加了治療成本，同時還需要考慮外源IGF-1在體內的作用劑量和作用時間。針對這一問題，本課題采用基因調控手段構建UC-MSCs-IGF-1，證明UC-MSCs-IGF-1在抗氧化損傷、維持細胞增殖活力、抗凋亡等方面，均具有一定的優勢。同時，課題組對所建立的UC-MSCs-IGF-1進行了一定時期的體外培養，在構建后傳代5次，IGF-1仍然具有較高的表達水平，與初始構建的UC-MSCs-IGF-1并無明顯差別。這些特點均在一定程度上為UC-MSCs的臨床合理化應用提供了一定的技術基礎。但是，本課題對于基因調控方面的機理機制分析較少，尚不明確過表達IGF-1對細胞內其它信號通路及UC-MSCs生物活性的影響；同時，在UC-MSCs-IGF-1抗氧化損傷的能力方面，本課題所建立的體系仍有待進一步優化；特別是本課題仍處于體外研究階段，UC-MSCs-IGF-1相關的體內功能仍需要進一步的探索和研究。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Inhibitory effect of IGF-1 overexpression on oxidative damage in umbilical cord mesenchymal stem cells

ZHAO Lei1, CHEN Xin2, FENG Ye-tong3, LIU Peng-fei4

(1DepartmentofAnesthesiology，2DepartmentofLaboratoryMedicine,SecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,ShenzhenPeople’sHospital,Shenzhen518020,China;3InstituteofHumanVirology,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;4DepartmentofRegenerativeMedicine,SchoolofPharmaceuticalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China.E-mail:rockman123456@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To analyze the inhibitory effect of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) overexpression in umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) on oxidative damage and to develop new application model for UC-MSCs. METHODS: UC-MSCs were isolated from human umbilical cord with enzymatic digestion, and further characte-rized with flow cytometry. IGF-1-overexpressing UC-MSCs (UC-MSCs-IGF-1) were established by retrovirus infection. IGF-1 expression of UC-MSCs-IGF-1 was evaluated by real-time quantitative PCR and flow cytometry, and its surface markers, as well as osteogenic and adipogenic differentiation ability, were further analyzed. The proliferation, anti-oxidative damage and anti-apoptosis abilities of UC-MSCs-IGF-1 were evaluated when treated with H2O2 at different concentrations (0 μmol/L, 10 μmol/L, 50 μmol/L and 100 μmol/L). RESULTS: UC-MSCs showed positive expression of CD29, CD90 and CD105, but negative expression of CD34, which coincided with the normal phenotype of mesenchymal stem cells. UC-MSCs-IGF-1 established with retrovirus infection showed much higher expression of IGF-1 compared with normal UC-MSCs, and expressed the same surface markers as UC-MSCs.The osteogenic and adipogenic differentiation abilities were also observed. With the oxidative damage by H2O2treatment, UC-MSCs-IGF-1 showed more strong proliferation, anti-oxidative damage and anti-apoptosis abilities as compared with normal UC-MSCs. In addition, the activity of SOD in UC-MSCs-IGF-1 was a little higher than that in control group. CONCLUSION: IGF-1 overexpression in UC-MSCs inhibits oxidative damage and cell apoptosis. UC-MSCs-IGF-1 may have more advantagies in clinical application.

[KEY WORDS]Umbilical cord mesenchymal stem cells; Insulin-like growth factor-1; Oxidative damage; Apoptosis

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0160- 07

[收稿日期]2015- 06- 02[修回日期] 2015- 11- 05

*[基金項目]深圳市知識創新計劃 (No. JCYJ20140416122812052)；吉林大學研究生創新基金資助項目(No. 2015009)；深圳市衛生計生系統科研項目 (No. 201401010)

通訊作者△Tel: 0431-85619715； E-mail： rockman123456@sina.com

[中圖分類號]R392.32

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.028