連翹苷對Lewis肺癌VEGF和內皮抑素表達的影響*

鄭　末，　姜忠敏

(天津市第五中心醫院病理科，天津 300450)

連翹苷對Lewis肺癌VEGF和內皮抑素表達的影響*

鄭末△，姜忠敏

(天津市第五中心醫院病理科，天津 300450)

[摘要]目的： 探討連翹苷對Lewis肺癌組織中血管內皮生長因子(VEGF)和血管生成抑制因子內皮抑制素(endostatin)蛋白表達的影響。方法: 免疫組化染色檢測臨床收集的正常肺部組織、癌旁組織和肺癌組織樣本中VEGF和endostatin的蛋白表達。設空白對照組10只，同時于40只小鼠右肢腋窩皮下接種Lewis瘤細胞，隨機分為模型組、連翹苷低劑量組、連翹苷中劑量組和連翹苷高劑量組，每組10只。模型組每天1次灌胃等體積無菌水；連翹苷低、中劑量組每天灌胃5、10 g/kg連翹苷1次；高劑量組每天灌胃10 g/kg連翹苷2次。給藥20 d后取肺部組織進行HE染色和免疫組化染色檢測腫瘤組織形態學與肺部組織中VEGF和endostatin的蛋白表達。 結果: 臨床樣本中，與正常組織和癌旁組織相比，肺癌組織中的VEGF呈高表達，endostatin呈低表達。連翹苷隨劑量增加可顯著減少Lewis肺癌小鼠腫瘤體積和瘤組織密度；給予不同劑量連翹苷后，VEGF在肺癌組織中表達顯著低于模型對照組，而endostatin表達則明顯高于模型對照組。結論: 連翹苷通過下調VEGF的表達、上調endostatin的表達而發揮抑制肺部腫瘤發展的作用。

[關鍵詞]連翹苷； Lewis肺癌； 血管內皮生長因子； 內皮抑制素

研究表明肺癌已成為世界上發生率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩大類[1]。其中非小細胞肺癌占肺癌總數的80%～85%。由于肺癌很容易發生早期轉移，從而導致早期診斷和治療效果不明顯，患者的5年生存率往往不足20%[2]。隨著環境污染日益加重以及生活習慣的改變，近年來我國的肺癌發生率迅速上升，預計到2025年，我國將成為世界第一肺癌大國[3]。常見的肺癌治療以手術為主，結合化療和放療，取得了一定的療效。但由于治療普遍缺乏針對患者病情的特異性，而放、化療常出現較強的毒副作用以及耐受性，往往難以取得進一步的療效。另一方面，西方醫療手段聯合中醫中藥對腫瘤患者進行治療也是我國特色之一。近年來隨著腫瘤分子生物學的迅速發展，從基因的角度進行研究，使得基因治療也有可能得以實現。本研究采用免疫組化方法研究連翹苷(phillyrin)對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成抑制因子內皮抑制素(endostatin)蛋白表達的變化，并初步研究其機制。

材料和方法

1樣本來源

收集醫院2012年1月～2014年12月間手術切除的54例非小細胞肺癌組織(男性28例，女性26例)，另取癌旁正常組織36例，正常肺部組織28例，組織切除后立即置于-80 ℃液氮中冷凍；樣本年齡均大于18歲，中位年齡56.7歲；所有組織均經過病理學專家確診，經本院倫理委員會通過。

2材料

Lewis肺癌細胞株購自中國醫學科學院；C57BL/6J小鼠購于北京維通利華實驗動物中心；連翹苷購自南京澤朗醫藥科技有限公司，純度98%；VEGF和endostatin抗體購自Abcam；其它試劑為國產分析純。

3方法

3.1肺癌模型建立與實驗分組將Lewis肺癌細胞株在37 ℃中復蘇，接種于10只C57BL/6J小鼠右肢腋窩皮下作為瘤源動物。約10 d后，待小鼠右腋部皮下瘤體明顯隆起，在超凈工作臺內無菌條件下剝離瘤組織，剪碎，研磨制備細胞懸液，用無菌生理鹽水調整細胞濃度約為1×1010/L。取此細胞懸液0.2 mL接種于40只C57BL/6J小鼠右肢腋窩皮下。實驗分為空白對照組、模型組、連翹苷低劑量組、連翹苷中劑量組和連翹苷高劑量組。

3.2給藥方法空白對照組：C57BL/6J小鼠正常飲食；模型組：造模第1天，以0.2 mL無菌水灌胃，每日1次；連翹苷低劑量組：造模第1天，以5 g/kg，0.2 mL灌胃，每日1次；連翹苷中劑量組：造模第1天，以10 g/kg，0.2 mL灌胃，每日1次；連翹苷高劑量組：造模第1天，以10 g/kg，0.2 mL灌胃，每日2次。連續給藥20 d。于最后一次給藥后處死，取出肺部組織，標記，置于-80 ℃液氮中冷凍備用。

3.3石蠟切片和HE染色將各C57BL/6J小鼠腫瘤組織置于4%甲醛中固定，常規石蠟包埋，切片，分別用二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡10 min，梯度乙醇分別浸泡5 min，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，0.2%氨水返藍，伊紅染色，再次用乙醇脫水3 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ透明5 min，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察各組織形態學變化。

3.4免疫組化染色法將各組織切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中脫蠟，梯度乙醇分別浸泡5 min，洗滌，置于3% H2O2去離子水孵育10 min，封閉，加入 I 抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌，加入Ⅱ抗，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌，DAB顯色。蘇木素復染，返藍，脫水透明，封片晾干。光鏡下觀察免疫組化切片染色結果，計算陽性細胞率。評分方法：陽性細胞率≤1%為0分，2%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；無染色為0分，弱強度染色為1分，中等強度染色為2分，強染色為3分；以陽性細胞率和染色強度之積進行綜合判斷：0～1分為陰性(-)；2～4分為弱陽性(+)，5～8分為中等陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

4統計學處理

數據處理采用SPSS 15.0軟件，結果以均數±標準差(Mean±SD)表示，采用t檢驗或方差分析(one-way ANOVA)行組間差異的統計推斷，以P<0.05為差異有統計學顯著性。

結果

1VEGF和endostatin蛋白在臨床不同肺部組織的表達

VEGF和endostatin的陽性表達呈棕黃色或棕褐色。在臨床收集的樣本中， VEGF的表達在正常組織中為弱陽性，癌旁組織為中等陽性，肺癌組織為強陽性；endostatin的表達在正常組織中為中等陽性，癌旁組織為弱陽性，肺癌組織為陰性，見圖1。

2Lewis肺癌小鼠腫瘤組織病理形態學的變化

空白對照組肉眼未發現腫物，光鏡下可見細胞排列規則，整齊，分布均勻。模型組肉眼見腫瘤體積巨大，不規則形狀，光鏡下瘤組織大片分布，排列緊密，細胞形狀不一。連翹苷低劑量組肉眼見腫瘤體積比模型組減小，光鏡下見瘤細胞密度降低，瘤組織片狀分布，未見顯著改變。連翹苷中劑量組肉眼見腫瘤體積顯著小于模型組與低劑量組，光鏡下瘤細胞明顯分散，排列疏松，呈大片壞死。連翹苷高劑量組肉眼見腫瘤體積比模型組明顯減小，瘤細胞密度明顯降低，部分核細胞固縮，見圖2。各組小鼠腫瘤重量和形態見圖3、4。

Figure 1.The protein expression of VEGF and endostatin in different lung tissues (immunohistochemical staining,×400). Mean±SD.n=10.*P<0.05vsnormal lung tissues.

圖1VEGF和Endostatin在不同肺部組織中的蛋白表達

Figure 2.Morphological observation in each group (HE staining,×40).

圖2各處理組的組織形態觀察

Figure 3.Statistical data of tumor weight in each group. Mean±SD.n=10*P<0.05vsmodel.

圖3各組小鼠腫瘤重量統計

3VEGF和endostatin蛋白在各組織中的表達

采用免疫組化染色法檢測連翹苷對Lewis肺癌小鼠中VEGF和endostatin蛋白表達的影響。隨連翹苷劑量的升高，VEGF的蛋白表達逐漸減弱，而endostatin的蛋白表達則逐漸減少,見圖5、6。

討論

腫瘤血管的生成是一個多因素多步驟的過程，包括了細胞增殖、遷移和胞外基質降解等。多種惡性實體腫瘤均是血管依賴性的腫瘤，通常是由于血管異常增生，導致的一系列級聯反應，主要取決于血管生成促進因子和抑制因子二者之間的比例[4]。這兩類因子以VEGF和endostatin最具代表性。

Figure 4.Tumor size observation in each group.

圖4各處理組腫瘤大小

Figure 5.The protein expression of VEGF in the tumor tissues isolated from Lewis lung carcinoma treated with phillyrin (immunohistochemical staining,×400). Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol.

圖5Lewis肺癌小鼠給予連翹苷后腫瘤組織中VEGF的表達

Figure 6.The protein expression of endostatin in the tumor tissues isolated from Lewis lung carcinoma treated with phillyrin (immunohistochemical staining,×400). Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol.

圖6Lewis肺癌小鼠給予連翹苷后腫瘤組織中endostatin的表達

VEGF是血管內皮生長因子，能夠促進血管內皮細胞分裂，通過與內皮細胞膜上的特異性受體結合來發揮調節內皮細胞增殖、促進血管生成和調節血管通透性的功能[5]。研究發現，VEGF在多種腫瘤中的表達水平顯著增加，與腫瘤的浸潤、轉移及預后有關[6-7]。腫瘤細胞的生長或轉移，都依賴于VEGF的作用，具有明顯的特異性。我們對臨床收集的肺部正常組織、癌旁組織和非小細胞肺癌組織的樣本進行免疫組化染色，結果顯示在肺癌組織中VEGF呈強陽性表達，顯著高于正常組織和癌旁組織，表明VEGF在肺癌組織中的表達具有特異性。給予Lewis肺癌小鼠不同劑量連翹苷后，肺癌組織中VEGF的表達下調，且與劑量呈負相關。提示連翹苷可能具有抑制肺癌組織中VEGF表達的作用，從而抑制腫瘤血管的進一步生成。

Endostatin是內源性血管生成抑制劑，特異性地抑制內皮細胞的生長、遷移，誘導其凋亡，從而抑制腫瘤血管的形成[8-9]。在多種研究中，endostatin被認為是作用最強，特異性最高的血管生成抑制因子。研究表明endostatin通過抑制eNOS的激活，從而抑制VEGF誘導的內皮細胞遷移和血管形成，也能阻斷VEGF介導的信號傳導通路[10]。同樣地，我們也對肺部正常組織，癌旁組織和非小細胞肺癌組織的臨床樣本進行了免疫組化染色，結果表明，肺癌組織中endostatin呈陰性表達，低于正常組織和癌旁組織，表明endostatin在肺癌組織中的表達同樣具有特異性。給予Lewis肺癌小鼠不同劑量連翹苷后，肺癌組織中endostatin的表達上調，且與劑量呈正相關。提示連翹苷可促進肺癌組織中endostatin的表達，與下調肺癌組織中VEGF表達起協同作用，共同抑制腫瘤血管的生成。

連翹苷是中藥連翹的主要有效成分，已有研究表明連翹苷具有明顯的抗炎、解熱、內毒素中和作用和抗氧化作用。由于連翹在我國的地理分布廣，可廣泛種植，具有很好的開發價值。研究表明連翹苷元對免疫性大鼠纖維化有較好的治療作用[11]。在本實驗中，給予Lewis肺癌小鼠連翹苷治療后能顯著減少VEGF和增加endostatin的表達，提示連翹苷可抑制腫瘤血管的生長。再者，HE切片染色結果顯示，高劑量的連翹苷能顯著減少肝腫瘤的體積，瘤組織密度顯著減少，提示連翹苷具有抑制肝癌發展的作用。具體機制還需進行下一步研究。綜上所述，本研究為連翹苷用于臨床肝癌治療提供了一定的實驗基礎。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Effects of phillyrin on VEGF and endostatin expression in Lewis lung carcinoma

ZHENG Mo, JIANG Zhong-min

(DepartmentofPathology,TianjinFifthCentreHospital,Tianjin300450,China.E-mail:zhengzz1978@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of phillyrin on vascular endothelial growth factor (VEGF) and endostatin expression in lung tumor tissues isolated from Lewis lung carcinoma. METHODS: The expression of VEGF and endostatin in control individuals and the patients with lung cancer was determined by immunohistochemistry. In the animal experiment, 5 groups of animals were examined: control, tumor model, and tumor model with 3 different concentrations of phillyrin treatments. For preparation of transplanted tumor model, Lewis cells were subcutaneously injected into the right limb armpit of the nude mice. After that, phillyrin was administered via oral gavage once daily for 20 d at dose of 5 or 10 g/kg, or twice daily at 10 g/kg. Lung tumor tissues isolated from each group were observed by hematoxylin-eosin staining. VEGF and endostatin expression were examined by immunohistochemistry. RESULTS: VEGF expression was increased in lung tumor tissues as compared with normal and pericarcinous tissues, while endostatin expression was decreased. Phillyrin significantly inhibited the tumor size and tumor tissue density dose-dependently, which was accompanied with a decrease in VEGF expression and an increase in endostatin expression. CONCLUSION: Phillyrin inhibits the development of lung tumor through reducing VEGF expression and increasing endostatin expression.

[KEY WORDS]Phillyrin; Lewis lung carcinoma; Vascular endothelial growth factor; Endostatin

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0167- 06

[收稿日期]2015- 08- 17[修回日期] 2015- 09- 21

*[基金項目]國家自然科學基金青年科學基金資助項目(No. 81001001)

通訊作者△Tel： 022-65665599； E-mail： zhengzz1978@126.com

[中圖分類號]R734.2; R730.23

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.029