視網(wǎng)膜感光細(xì)胞退變過程中內(nèi)層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的變化*

張　佳，　項(xiàng)宗勤，　徐　穎

(暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院，廣東 廣州 510632 )

▲并列第1作者

視網(wǎng)膜感光細(xì)胞退變過程中內(nèi)層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的變化*

張佳▲，項(xiàng)宗勤▲，徐穎△

(暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院，廣東 廣州 510632 )

[關(guān)鍵詞]感光細(xì)胞退變； 雙極細(xì)胞； 節(jié)細(xì)胞

視網(wǎng)膜退行性疾病是現(xiàn)今引起人類失明的嚴(yán)重疾病，它主要包括視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)等多種眼科常見病。RP發(fā)病率大約1/4 000～1/3 500。常染色體隱形遺傳占 15%～20%，顯性 20%～25%，其中10%～15%為 X連鎖遺傳[1]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)45個(gè)致病基因位點(diǎn)[2]。RP患者的臨床表現(xiàn)為視力下降，夜盲和視野逐漸變窄，主要的病理特征為感光細(xì)胞死亡，視網(wǎng)膜血管逐漸萎縮和堵塞，骨樣細(xì)胞色素沉淀。隨著感光細(xì)胞進(jìn)行性凋亡，患者視力逐漸下降最終導(dǎo)致失明。目前，視網(wǎng)膜退變的主要治療方案是，延緩感光細(xì)胞凋亡和視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元(主要是雙極細(xì)胞和節(jié)細(xì)胞)對光反應(yīng)消失的進(jìn)程后，重建光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，使內(nèi)層神經(jīng)元對光產(chǎn)生反應(yīng)。目前對于治療視網(wǎng)膜退變疾病的研究取得了一些成果，主要包括前體感光細(xì)胞的移植[3]、干細(xì)胞移植[4]、人工視覺假體電刺激[5]、基因治療感光細(xì)胞[6]、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)光感受蛋白誘導(dǎo)節(jié)細(xì)胞或雙極細(xì)胞直接對光敏感[7-8]等。例如，熊國吟等[9]使用甲基亞硝基脲(methyl-nitroso-urea，MNU)誘導(dǎo)損傷視網(wǎng)膜感光細(xì)胞，然后通過電穿孔技術(shù)將黑視素基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入給光雙極細(xì)胞，恢復(fù)了小鼠部分視覺。這些實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物模型上都有效，并且有一部分還進(jìn)入臨床試驗(yàn)并取得了良好的效果。但是，這些治療方法都要求在治療階段視網(wǎng)膜下游神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的完整。如果雙極細(xì)胞或者節(jié)細(xì)胞喪失了對上級神經(jīng)元信號刺激的興奮性反應(yīng)或喪失了往下級神經(jīng)元傳遞興奮性的功能，即使在治療中成功誘導(dǎo)退變感光細(xì)胞、雙極細(xì)胞或節(jié)細(xì)胞直接對光產(chǎn)生反應(yīng)，也無法將信息傳遞到大腦產(chǎn)生視覺。因此了解感光細(xì)胞退變過程中雙極細(xì)胞和節(jié)細(xì)胞的形態(tài)功能變化，對于尋找治療視網(wǎng)膜退行性疾病的有效治療窗口有重要意義。

目前在實(shí)驗(yàn)中最廣泛和具有特征性視網(wǎng)膜退變的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是rd1和rd10小鼠模型。rd1和rd10小鼠視網(wǎng)膜變性由Pde6b基因突變引起[10-11]，導(dǎo)致Pde6b蛋白功能缺失，細(xì)胞內(nèi)cGMP堆積[13]，造成感光細(xì)胞死亡。rd1的感光細(xì)胞退變過程非常迅速，大概在出生后第8天感光細(xì)胞開始退變，到出生后21 d感光細(xì)胞幾乎完全凋亡[13]。但是rd1突變小鼠視網(wǎng)膜很早就開始退變，視網(wǎng)膜還沒有發(fā)育完全，誘發(fā)細(xì)胞死亡在一定程度上與細(xì)胞發(fā)育過程中的凋亡重疊，導(dǎo)致很難區(qū)別是病理學(xué)上的死亡還是生理學(xué)上的凋亡。rd10小鼠感光細(xì)胞凋亡慢，變性大概在出生后17 d開始，到出生后45 d左右視桿完全凋亡，直到180 d感光細(xì)胞幾乎全部凋亡[11]。此外，rd10小鼠中的這種突變并未導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能完全喪失[11, 14]。因此rd10小鼠的變性比rd1小鼠的快速細(xì)胞死亡更加精準(zhǔn)地反映了人類視網(wǎng)膜色素變性疾病。除了這2種常用退變小鼠動(dòng)物模型外，實(shí)驗(yàn)中用到的視網(wǎng)膜退變小鼠模型還包括crx基因敲除小鼠模型[15]、rdcl小鼠模型及hrho小鼠模型[16]；大鼠模型有RCS大鼠模型[17-18]、P23H大鼠模型[19]和S334ter大鼠模型[20]；P347L視紫質(zhì)轉(zhuǎn)基因兔模型[21]中也有相關(guān)報(bào)導(dǎo)。

1視網(wǎng)膜退變過程中內(nèi)層神經(jīng)元形態(tài)上的改變

早在1980年，Sanyal等[22]在不同感光細(xì)胞退變的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了視網(wǎng)膜內(nèi)核層變得更薄更不規(guī)則。Santos等[23]在人類視網(wǎng)膜退變捐贈者的視網(wǎng)膜上發(fā)現(xiàn)了在內(nèi)核層(inner nuclear layer，INL)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglion cell layer，GCL)的神經(jīng)元發(fā)生不同程度的丟失。在2002年，Strettoi等[24]在Rp模型小鼠上發(fā)現(xiàn)隨著感光細(xì)胞的消失，視網(wǎng)膜下游神經(jīng)元發(fā)生了下列相應(yīng)改變：

1.1雙極細(xì)胞在視網(wǎng)膜退變過程中形態(tài)上的改變在出生后的10～20 d的rd10小鼠和野生型小鼠中，雙極細(xì)胞的形態(tài)和層次上沒有什么區(qū)別，胞體橢圓形，樹突呈樹枝狀且密度大，軸突很長，伸入到內(nèi)網(wǎng)狀層(inner plexiform layer，IPL)的深層。在出生后25 d的rd10小鼠中，雙極細(xì)胞的形態(tài)開始變化。視桿雙極細(xì)胞(retinal bipolar cells，RBCs)的樹突變得更短，這個(gè)差別在視網(wǎng)膜中心較外周區(qū)域更加明顯。在rd10小鼠出生后30 d，隨著感光細(xì)胞退變的進(jìn)行，RBCs的樹突回縮變得更明顯。在出生后45 d的rd10小鼠中，RBCs的樹突在視網(wǎng)膜外周區(qū)域只有少許殘留，而在中心區(qū)域內(nèi)樹突消失[14]。Puthussery等[25]更是發(fā)現(xiàn)了在視網(wǎng)膜退變雙極細(xì)胞重構(gòu)過程中，RBCs與視錐存在短暫的錯(cuò)位連接。

1.2視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在視網(wǎng)膜退變過程中形態(tài)上的改變在正常C57小鼠中，樹突的延伸從出生后8 d開始直到睜眼(大約在出生13 d左右)，之后節(jié)細(xì)胞的側(cè)面和垂直于內(nèi)網(wǎng)層的樹突不斷回縮，節(jié)細(xì)胞樹突野不斷減小[26]。在rd1小鼠的節(jié)細(xì)胞中，樹突野的減小發(fā)生在出生后30 d左右，此時(shí)約有50%的節(jié)細(xì)胞的樹突野減小到原來的50%[28]。但是在rd10小鼠中，節(jié)細(xì)胞的樹突野等其他形態(tài)卻沒有任何明顯異常[28]。

2正常視網(wǎng)膜中谷氨酸受體在內(nèi)層神經(jīng)元中的表達(dá)

視覺傳導(dǎo)過程主要分為ON型通路和OFF型通路，分別對應(yīng)給光和撤光時(shí)視網(wǎng)膜各級神經(jīng)元中谷氨酸信號通道的反應(yīng)，其中谷氨酸信號通道是視網(wǎng)膜信息傳遞的最主要通道(圖1[29])。谷氨酸受體分為離子型谷氨酸受體(ionic glutamate receptor，iGluR)和代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor，mGluR)2大類。iGluR包括AMPA、kainate(KA)和NMDA 3類，含有GluR1～7、KA1～2和NR1～3多種亞型；mGluR包括Group I、II、III 3類，含有mGluR1～8各種亞型。在正常視網(wǎng)膜中谷氨酸受體在內(nèi)層神經(jīng)元中有不同的表達(dá)及功能，其中各類細(xì)胞均表達(dá)一定的iGluR和mGluR，但ON雙極細(xì)胞(包括視桿雙極細(xì)胞和ON視錐雙極細(xì)胞)主要表達(dá)功能性的mGluR，而OFF雙極細(xì)胞(均為視錐雙極細(xì)胞)主要表達(dá)功能性的iGluR，而節(jié)細(xì)胞表達(dá)的mGluR和iGluR均有一定功能[30]，具體總結(jié)見表1。

在黑暗環(huán)境下，感光細(xì)胞會釋放谷氨酸，作用于突觸后的ON型和OFF型雙極細(xì)胞。谷氨酸作用的這2種細(xì)胞引起的是相反的作用，這是因?yàn)檫@2種細(xì)胞在突觸后的谷氨酸受體不同。RBCs和ON型視錐雙極細(xì)胞(ON-cone bipolar cells,ON-CBCs)表達(dá)代謝型的谷氨酸受體mGluR6[31]，mGluR6被谷氨酸激活后會關(guān)閉一種非選擇性的陽離子通道TRPM1[32-36]，從而使得細(xì)胞超極化。在OFF型視錐雙極細(xì)胞(OFF-CBCs)中，谷氨酸會激活kainate/AMPA型離子通道使細(xì)胞去極化。研究表明，在感光細(xì)胞退變的過程，RBCs和CBCs上的各種谷氨酸受體的分布和表達(dá)均發(fā)生了明顯的改變[25, 37-39]。

Figure 1.ON and OFF signaling pathways in normal retina. OFF CBC： OFF cone bipolar cell; ON RBC： ON rod bipolar cell; ON CBC： ON cone bipolar cell; AII： AII amacrine cell; OFF GC： OFF ganglion cell; ON GC： ON ganglion cell; iGluR： ionic glutamate receptor; mGluR： metabotropic glutamate receptor.

圖1視網(wǎng)膜的給光和撤光信號通路

3視網(wǎng)膜退變過程中內(nèi)層神經(jīng)元谷氨酸受體表達(dá)的變化

3.1代謝型谷氨酸受體的變化已經(jīng)證實(shí)在視網(wǎng)膜退變過程中，rd1小鼠模型[40]、rd10小鼠模型[15, 26, 39]和crx基因敲除小鼠模型[16]中mGluR6蛋白表達(dá)下調(diào)。除了表達(dá)量下降之外，殘余mGluR6受體的表達(dá)位置也發(fā)生改變，過多的在給光雙極細(xì)胞胞體和軸突上表達(dá)，并且形成簇。相似的發(fā)現(xiàn)也在RCS大鼠[18-19]、P23H大鼠[20]和S334ter大鼠[21]模型中有報(bào)道。但是，在這些視網(wǎng)膜退變大鼠模型中mGluR6受體表達(dá)位置的錯(cuò)誤比在小鼠視網(wǎng)膜退變模型中更加顯著。更加有趣的是，在這些大鼠視網(wǎng)膜退變模型中mGluR6受體的表達(dá)分布與其相應(yīng)動(dòng)物早期發(fā)育過程中的表達(dá)分布十分相似[41-42]。正常狀態(tài)下，mGluR6在給光雙極細(xì)胞樹突頂端表達(dá)，使得RBCs或ON-CBCs超極化。Gargini等[15]發(fā)現(xiàn)在出生后25 d的rd10小鼠視網(wǎng)膜中，mGluR6染色結(jié)果顯示與野生型小鼠基本一致，但是不僅僅限于雙極細(xì)胞樹突終端，而在其軸突和胞體上也有表達(dá)。隨著視網(wǎng)膜退變的進(jìn)行，染色顯示mGluR6的表達(dá)逐漸減少。在出生后45 d的rd10小鼠視網(wǎng)膜中，染色顯示在OPL剩余的mGluR6只有少量，并且與RBCs樹突不一致。

3.2離子型谷氨酸受體的變化在感光細(xì)胞退變過程中，離子型谷氨酸受體在雙極細(xì)胞中的表達(dá)幾乎不變，甚至有所上調(diào)。Puthussery等[26]在rd10小鼠視網(wǎng)膜上用免疫組化方法對AMPA受體，包括iGluR1、iGluR2和iGluR4的表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)這3種受體的表達(dá)都正常，甚至在視錐完全凋亡之后都沒有什么變化。但是Namekata等[43]對表達(dá)iGluR1、iGluR3和iGluR4這3種受體rd1小鼠的基因進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示在視網(wǎng)膜退變高峰之后，三者的表達(dá)上調(diào)；此外，在ON視錐雙極細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了iGluR的異常表達(dá)[44]。這些研究的結(jié)論不一致可能是因?yàn)槭褂昧瞬煌俗兯俣鹊男∈蟆?/p>

除了上述研究外，在小鼠感光細(xì)胞退變過程中，mGluR是否在OFF雙極細(xì)胞中的表達(dá)和分布有所變化并不清楚，mGluR和iGluR是否在節(jié)細(xì)胞中有不同的表達(dá)及分布變化，目前也未見任何報(bào)道。這些都需要進(jìn)一步去研究。

4雙極細(xì)胞在視網(wǎng)膜退變過程中功能的改變

4.1ON型雙極細(xì)胞電生理反應(yīng)的改變感光細(xì)胞退變過程中，ON雙極細(xì)胞的對光反應(yīng)逐漸消失，谷氨酸受體調(diào)控的陽離子通道關(guān)閉，mGluR反應(yīng)消失或不變，iGluR反應(yīng)出現(xiàn)或增強(qiáng)，基本符合mGluR和iGluR受體表達(dá)的變化趨勢。

視網(wǎng)膜電位(electroretinography，ERG)記錄是一種非損傷的在體記錄視網(wǎng)膜細(xì)胞群體光反應(yīng)的電生理記錄手段。ERG中的b波主要來自O(shè)N型雙極細(xì)胞，通過測量b波的峰值和到達(dá)峰值的時(shí)間可以反映其功能狀況。Gargini等[15]發(fā)現(xiàn)來自O(shè)N雙極細(xì)胞對光反應(yīng)的b波在視網(wǎng)膜退變過程中逐漸減弱并消失，提示ON型雙極細(xì)胞對光反應(yīng)消失，但難以判斷b波的缺失是來自于突觸前感光細(xì)胞的變化還是突觸后ON雙極細(xì)胞的變化。Varela等[45]用酶裂解4～8周的rd1小鼠視網(wǎng)膜，然后應(yīng)用膜片鉗記錄分離出來的視桿雙極細(xì)胞，他們僅從13個(gè)細(xì)胞中的1個(gè)細(xì)胞記錄到谷氨酸反應(yīng)，提示視桿雙極細(xì)胞的谷氨酸反應(yīng)缺失。但由于在rd1小鼠視網(wǎng)膜中視桿到視桿雙極細(xì)胞的突觸發(fā)育是不正常的，無法說明觀察到的功能缺失是由于rd1小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育異常引起還是由于感光細(xì)胞退變造成的。Barhoum等[39]在出生后60 d 的rd10小鼠(這時(shí)視桿細(xì)胞已經(jīng)完全凋亡)和野生型小鼠視網(wǎng)膜上記錄視桿雙極細(xì)胞對局部噴發(fā)谷氨酸的反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rd10小鼠的視桿雙極細(xì)胞與正常小鼠一樣，均可以在50%的細(xì)胞上記錄到谷氨酸誘發(fā)電流，而且反應(yīng)幅度無顯著差別。而與之相反的是， Puthussery等[26]在rd10小鼠視網(wǎng)膜中視桿雙極細(xì)胞上噴發(fā)mGluR6特異激動(dòng)劑L-AP-4，發(fā)現(xiàn)mGluR6誘發(fā)電流進(jìn)行性減小，到出生后45 d電流峰值減少了91%，直到出生后180 d反應(yīng)完全消失。這些結(jié)果的不同可能是由于不同的誘發(fā)刺激激活了不同類型的谷氨酸受體。

表1　正常視網(wǎng)膜中雙極細(xì)胞和節(jié)細(xì)胞上表達(dá)的谷氨酸受體及其功能

NMDA receptor (NR): NR1, NR2A, NR2B, NR2C, NR2D, NR3A, NR3B; AMPA receptor: iGluR1, iGluR2, iGluR3, iGluR4; KA receptor: iGluR5, iGluR6, iGluR7, KA1, KA2; Group I mGluR: mGluR1, mGluR5; Group II mGluR: mGluR2, mGluR3; Group III mGluR: mGluR4, mGluR5, mGluR6, mGluR7, mGluR8.

有機(jī)陽離子agmatine(AGB)示蹤法是一種鑒定離散細(xì)胞活性的方法，AGB能夠通過開放的陽離子通道進(jìn)入細(xì)胞，從而顯示細(xì)胞的活性。 研究表明，感光細(xì)胞完全敲除的小鼠(rdcl)中ON雙極細(xì)胞沒有任何AGB信號，表明由iGluR或mGluR調(diào)控的陽離子通道處于關(guān)閉狀態(tài)[17]。在退變小鼠視網(wǎng)膜ON雙極細(xì)胞中通過AGB示蹤法發(fā)現(xiàn)開始異常表達(dá)功能性的iGluR[44]，盡管采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)并沒有記錄到AMPA/kainate引起的iGluR電流[26]；而在退變的P23H大鼠中發(fā)現(xiàn)ON雙極細(xì)胞在感光細(xì)胞退變后的很長一段時(shí)間都維持正常的iGluR反應(yīng)[46]，提示感光細(xì)胞退變時(shí)ON雙極細(xì)胞中iGluR可能發(fā)揮作用。AGB示蹤法也被應(yīng)用到P347L視紫質(zhì)轉(zhuǎn)基因兔模型中，用于檢測視網(wǎng)膜退變過程中kainate受體的活性。研究顯示出了大量活化的雙極細(xì)胞，表明在退變過程中視桿雙極細(xì)胞iGluR受體通道具有很高的活性[22]。

4.2OFF型雙極細(xì)胞電生理反應(yīng)的改變感光細(xì)胞退變過程中，OFF雙極細(xì)胞的iGluR反應(yīng)維持不變或消失，mGluR反應(yīng)未見報(bào)道。

Puthussery等[26]在出生后6個(gè)月齡rd10小鼠視網(wǎng)膜OFF雙極細(xì)胞中應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗記錄到了正常的AMPA和kainate激發(fā)電流，表明在視錐死亡后kainate/AMPA受體通道功能仍然正常。但是在退變速度更快的rdcl和hrho小鼠模型中，通過AGB檢測并未發(fā)現(xiàn)OFF雙極細(xì)胞中任何kainate受體活性[17]，提示iGluR反應(yīng)消失。此外，在視網(wǎng)膜色素變性患者的視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)了顯著增高的iGluR活性[17]，但這來自于OFF還是ON雙極細(xì)胞中表達(dá)增加的iGluR并不清楚。而OFF雙極細(xì)胞中mGluR電流是否發(fā)生變化并不清楚。

5節(jié)細(xì)胞在視網(wǎng)膜變性過程中功能的變化

感光細(xì)胞退變過程中，節(jié)細(xì)胞感受野變小，自發(fā)增強(qiáng)，對光反應(yīng)減弱，iGluR 反應(yīng)正常。

5.1感受野變小在rd1小鼠視網(wǎng)膜退變的不同時(shí)期，各種節(jié)細(xì)胞的感受野產(chǎn)生不同的變化，ON型節(jié)細(xì)胞的感受野從小鼠睜眼之后開始持續(xù)減小，直到rd1小鼠出生4周左右，這段時(shí)間正好與視桿感光細(xì)胞凋亡相對應(yīng)；而OFF節(jié)細(xì)胞的感受野在出生后17 d左右才開始減小。同樣，與OFF節(jié)細(xì)胞相對應(yīng)的視錐的凋亡也發(fā)生在視桿凋亡之后。這樣的對應(yīng)關(guān)系說明了在感光細(xì)胞退變時(shí)引起了其下游節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而導(dǎo)致其功能的異常[27]。但是在rd10小鼠視網(wǎng)膜中，節(jié)細(xì)胞的感受野和樹突野均沒有明顯改變。

5.2視網(wǎng)膜退變過程中節(jié)細(xì)胞的自發(fā)增強(qiáng)正常的視網(wǎng)膜中，節(jié)細(xì)胞在動(dòng)物睜眼之前會產(chǎn)生一定頻率的自發(fā)現(xiàn)象，但是睜眼之后，視網(wǎng)膜受到光線的刺激，自發(fā)會降到很低的水平。這一現(xiàn)象在視網(wǎng)膜退變模型小鼠中卻發(fā)生了改變，改變主要發(fā)生在睜眼之后。有大量文獻(xiàn)報(bào)道，在感光細(xì)胞凋亡過程中，伴隨著節(jié)細(xì)胞對光反應(yīng)逐漸降低，特別是OFF型的節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生有規(guī)律的自發(fā)發(fā)放。在視網(wǎng)膜退變的早期，自發(fā)的頻率大約是10 Hz，晚期有所降低[47-48]。

阻斷感光細(xì)胞和ON型雙極細(xì)胞的輸入并不能減少自發(fā)，所以節(jié)細(xì)胞的自發(fā)來自于視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元的相互作用。為了確定節(jié)細(xì)胞的自發(fā)是不是由于其自身性質(zhì)的改變，比如離子通道的作用或分布狀況，或是突觸前的輸入影響，有研究通過電壓鉗技術(shù)探究α節(jié)細(xì)胞的電生理特性。在加入谷氨酸受體阻斷劑CNQX之后，節(jié)細(xì)胞的自發(fā)大部分消失，因此可以確定節(jié)細(xì)胞的大量自發(fā)是通過谷氨酸受體激活引起的[49]。最近更進(jìn)一步的研究證明，節(jié)細(xì)胞的自發(fā)來自于ON型視錐雙極細(xì)胞和AⅡ無長突細(xì)胞的電偶聯(lián)[50-51]。

5.3視網(wǎng)膜退變過程中節(jié)細(xì)胞的光反應(yīng)幅度降低rd1小鼠在視網(wǎng)膜退變過程中，節(jié)細(xì)胞發(fā)放可以分為3個(gè)階段，第1階段為出生后7 d到睜眼之前有著正常的自發(fā)現(xiàn)象；第2階段為在出生14 d時(shí)，全視野光刺激能夠使節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生光反應(yīng)，并且OFF反應(yīng)明顯高于ON反應(yīng)；第3階段為小鼠剛成年后，節(jié)細(xì)胞的光反應(yīng)大部分消失。但是此時(shí)rd1小鼠的視網(wǎng)膜還沒有完全凋亡，還有部分殘余的視錐細(xì)胞，那成年后的小鼠為什么幾乎沒有光反應(yīng)呢[52]？原因是節(jié)細(xì)胞的大量高頻率的自發(fā)掩蓋了部分光反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過阻斷GABA受體或阻斷縫隙連接能夠部分恢復(fù)節(jié)細(xì)胞的光反應(yīng)并且自發(fā)大部分消失[26, 53]，提示也許可能通過GABA阻斷劑延緩感光細(xì)胞退變過程中節(jié)細(xì)胞光反應(yīng)降低的時(shí)程。

5.4視網(wǎng)膜退變過程中節(jié)細(xì)胞的光敏度降低視網(wǎng)膜對光刺激能夠產(chǎn)生反應(yīng)。隨著絕對光強(qiáng)的減小，反應(yīng)強(qiáng)度減小，當(dāng)光強(qiáng)達(dá)到一個(gè)臨界值以下，節(jié)細(xì)胞不能產(chǎn)生光反應(yīng)。這個(gè)臨界值代表著節(jié)細(xì)胞的光敏度。用光點(diǎn)刺激節(jié)細(xì)胞的感受野中心來評估其光敏度的變化發(fā)現(xiàn)，隨著感光細(xì)胞的凋亡，節(jié)細(xì)胞特別是ON型節(jié)細(xì)胞的光敏度逐漸降低。在凋亡的中期階段，光敏度有一個(gè)平臺期，這段時(shí)間，光敏度下降得很平緩，隨后又快速下降，最后穩(wěn)定在一定水平。RCS大鼠在出生后28～30 d時(shí)，光敏度與正常大鼠只有0.25 log cd/m2的差別，在出生后47～48 d時(shí)差異擴(kuò)大到 0.71 log cd/m2[54]。新近文獻(xiàn)報(bào)道用mGluR1受體拮抗劑JNJ16259685阻斷mGluR1信號通道可以增強(qiáng)P23H大鼠節(jié)細(xì)胞對光反應(yīng)的敏感度，從而提高任何來自殘存感光細(xì)胞的微弱信號，延長節(jié)細(xì)胞對光反應(yīng)時(shí)程[55]。

5.5視網(wǎng)膜退變過程中節(jié)細(xì)胞的光反應(yīng)時(shí)間延長在視網(wǎng)膜變性早期，ON型節(jié)細(xì)胞接受信息延遲。通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，比較RCS大鼠和正常大鼠在同一時(shí)間和同種類型節(jié)細(xì)胞的內(nèi)向電流時(shí)程時(shí)，發(fā)現(xiàn)RCS大鼠ON型節(jié)細(xì)胞內(nèi)向電流的潛伏期、上升時(shí)間和達(dá)峰時(shí)間皆比正常大鼠延長。出生30 d時(shí)，信息傳遞到ON型節(jié)細(xì)胞的時(shí)間明顯延遲，到60 d時(shí)更明顯，到90 d時(shí)完全中斷。但是在OFF和ON-OFF型節(jié)細(xì)胞中，出生30 d時(shí)無明顯延遲，而60 d后信息傳遞中斷[56]。

5.6視網(wǎng)膜退變過程中節(jié)細(xì)胞的對比敏感度降低對比敏感度是指正常視網(wǎng)膜在具有灰度背景的相對光強(qiáng)的刺激下，對不同相對光強(qiáng)產(chǎn)生的反應(yīng)強(qiáng)弱不同。隨著對比度的升高，反應(yīng)幅度也不斷增加。有研究將正常的SD大鼠與RCS大鼠做對比敏感度的行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，在出生后28 d～30 d之間，2種大鼠的反應(yīng)幅度沒有明顯差別，均隨著光柵對比度的增加而變大。但出生后47 d，在100%對比度、0.07 cyc/deg(光柵速度)的光柵刺激時(shí)，RCS大鼠的反應(yīng)幅度較正常大鼠明顯降低。更嚴(yán)重的是，在出生76 d之后，雖然仍有殘存的視桿細(xì)胞，RCS大鼠已不能對任何對比度、任何空間頻率的光柵產(chǎn)生反應(yīng)[54]。

5.7視網(wǎng)膜退變過程中節(jié)細(xì)胞的iGluR反應(yīng)正常在P23H大鼠中通過AGB標(biāo)記發(fā)現(xiàn)節(jié)細(xì)胞在很長一段時(shí)間內(nèi)都維持正常的iGluR反應(yīng)，而關(guān)于mGluR的反應(yīng)尚無報(bào)道。用鈣結(jié)合蛋白(CR)和AGB標(biāo)記被kainate激活的視網(wǎng)膜，大約90%左右的節(jié)細(xì)胞能夠被CR和AGB雙標(biāo)，這說明大部分節(jié)細(xì)胞的iGluR反應(yīng)正常[46]。

綜上所述，雖然已有研究報(bào)道感光細(xì)胞退變過程中雙極細(xì)胞和節(jié)細(xì)胞的功能變化，但各研究結(jié)論并不一致甚至相互矛盾，而且沒有系統(tǒng)檢測mGluR和iGluR反應(yīng)在各類神經(jīng)元上的變化。因此，有必要通過不同谷氨酸信號通道的特異性激動(dòng)劑來測試感光細(xì)胞退變過程中ON、OFF雙極細(xì)胞和節(jié)細(xì)胞的mGluR和iGluR電流變化，以確定各細(xì)胞中谷氨酸興奮性的變化情況，從而更全面地評估內(nèi)層神經(jīng)元的功能退變程度，判斷谷氨酸受體表達(dá)的變化與內(nèi)層神經(jīng)元谷氨酸興奮性變化的相關(guān)性。

6展望

視網(wǎng)膜變性是一個(gè)進(jìn)展相對比較緩慢的疾病，目前針對內(nèi)層視網(wǎng)膜的研究并不充分，而且爭議頗多。對于視網(wǎng)膜退變疾病的治療，如果僅僅對感光細(xì)胞采取治療，并不能取到很好的效果。例如，雖然視網(wǎng)膜假體的移植已經(jīng)在臨床實(shí)驗(yàn)中取得了可喜的成果[57-58]并形成了商業(yè)化產(chǎn)品，但是在感光細(xì)胞退變的過程中節(jié)細(xì)胞異常的自發(fā)發(fā)放[47, 52]會對人工視覺假體移植后刺激視網(wǎng)膜產(chǎn)生的真實(shí)視覺電信號造成嚴(yán)重干擾，妨礙正確視覺的產(chǎn)生，因此必須有效控制節(jié)細(xì)胞的這種非正常自發(fā)，才能有效提高治療效果。因此，探索視網(wǎng)膜退變時(shí)內(nèi)層視網(wǎng)膜神經(jīng)元功能(包括對光反應(yīng)及對上級信號引起的興奮性反應(yīng))的變化及其機(jī)制，并設(shè)法維持其正常功能或延緩其功能衰退的時(shí)間，將為臨床上尋找有效的防治時(shí)間、作用靶點(diǎn)提供重要參數(shù)；同時(shí)可以為延長治療的時(shí)間窗口尋求可能方案，具有非常重要的臨床和社會意義。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Ferrari S, Di Iorio B, Barbaro B,et al. Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms[J]. Curr Genomics, 2011, 12(4): 238-249.

[2]Hamel C. Retinitis pigmentosa[J]. Orphanet J Rare Dis, 2006, 1:40.

[3]MacLaren RE, Pearson RA, MacNeil A, et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors[J]. Nature, 2006, 444(7116):203-207.

[4]Mooney I, LaMotte J. A review of the potential to restore vision with stem cells [J]. Clin Exp Optometry, 2008, 91(1):78-84.

[5]Nirenberg S, Pandarinath C. Retinal prosthetic strategy with the capacity to restore normal vision [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(37):15012-15017.

[6]Hufnagel RB, Ahmed ZM, Corrêa ZM, et al. Gene therapy for Leber congenital amaurosis: advances and future directions[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2012, 250(8):1117-1128.

[7]Bi A, Cui J, Ma YP, et al. Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration[J]. Neuron, 2006, 50(1):23-33.

[8]Lagali PS, Balya D, Awatramani GB, et al. Light-activated channels targeted to ON bipolar cells restore visual function in retinal degeneration[J]. Nature Neurosci, 2008, 11(6):667-675.

[9]熊國吟，羅小鵬，楊昇炎，等. 黑視素基因轉(zhuǎn)染給光雙極細(xì)胞部分恢復(fù)MNU誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞變性小鼠的視覺[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(7): 1153-1159.

[10]Bowes C, Li T, Danciger M, et al. Retinal degeneration in the rd mouse is caused by a defect in the beta subunit of rod cGMP-phosphodiesterase[J]. Nature, 1990, 347(6294):677-680.

[11]Chang B, Hawes NL, Pardue MT, et al. Two mouse retinal degenerations caused by missense mutations in the beta-subunit of rod cGMP phosphodiesterase gene[J]. Vision Res, 2007, 47(5):624-633.

[12]Farber DB, Lolley RN. Cyclic guanosine monophosphate: elevation in degenerating photoreceptor cells of the C3H mouse retina[J]. Science, 1974, 186(4162):449-451.

[13]Carter-Dawson LD, LaVail MM, Sidman RL. Differential effect of the rd mutation on rods and cones in the mouse retina J]. Invest Ophthalmol Visual Sci, 1978, 17(6):489-498.

[14]Gargini C, Terzibasi E, Mazzoni F, et al. Retinal organization in the retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse: a morphological and ERG study[J]. J Comp Neurol, 2007, 500(2):222-238.

[15]Pignatelli V, Cepko CL, Strettoi E. Inner retinal abnormalities in a mouse model of Leber’s congenital amaurosis[J]. J Comp Neurol, 2004, 469(3): 351-359.

[16]Marc RE, Jones BW, Anderson JR, et al. Neural reprogramming in retinal degeneration[J]. Invest Ophthalmol Visual Sci, 2007, 48(7):3364-3371.

[17]Cuenca N, Pinilla I, Sauve Y, et al. Early changes in synaptic connectivity following progressive photoreceptor degeneration in RCS rats[J]. Eur J Neurosci, 2005, 22(5):1057-1072.

[18]Pinilla I, Cuenca N, Sauve Y, et al. Preservation of outer retina and its synaptic connectivity following subretinal injections of human RPE cells in the royal college of surgeons rat [J]. Exp Eye Res, 2007, 85(3):381-392.

[19]Cuenca N, Pinilla I, Sauvé Y, et al. Regressive and reactive changes in the connectivity patterns of rod and cone pathways of P23H transgenic rat retina [J]. Neuroscience, 2004, 127(2):301-317.

[20]Seiler MJ, Thomas BB, Chen Z, et al. BDNF-treated retinal progenitor sheets transplanted to degenerate rats: improved restoration of visual function[J]. Exp Eye Res, 2008, 86(1):92-104.

[21]Jones BW, Kondo M, Terasaki H, et al. Retinal remodeling in the Tg P347L rabbit, a large-eye model of retinal degeneration[J]. J Comp Neurol, 2011, 519(14):2713-2733.

[22]Sanyal S, De Ruiter A, Hawkins RK. Development and degeneration of retina in rds mutant mice: light microscopy[J]. J Comp Neurol, 1980, 194(1): 193-207.

[23]Santos A, Humayun MS, de Juan E, et al. Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa. A morphometric analysis[J]. Arch Ophthalmol, 1997, 115(4):511-515.

[24]Strettoi E, Porciatti V, Falsini B, et al. Morphological and functional abnormalities in the inner retina of the rd/rd mouse[J]. J Neurosci, 2002, 22(13):5492-5504.

[25]Puthussery T, Gayet-Primo J, Pandey S, et al. Differential loss and preservation of glutamate receptor function in bipolar cells in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa[J]. Eur J Neurosci, 2009, 29(8):1533-1542.

[26]Koehler CL, Akimov NP, Renteria RC. Receptive field center size decreases and firing properties mature in ON and OFF retinal ganglion cells after eye opening in the mouse[J]. J Neurophysiol, 2011, 106(2):895-904.

[27]Damiani D, Novelli E, Mazzoni F, et al. Undersized dendritic arborizations in retinal ganglion cells of the rd1 mutant mouse: a paradigm of early onset photoreceptor degeneration[J].J Comp Neurol, 2012, 520(7):1406-1423.

[28]Mazzoni F, Novelli E, Strettoi E. Retinal ganglion cells survive and maintain normal dendritic morphology in a mouse model of inherited photoreceptor degeneration[J]. J Neurosci, 2008, 28(52):14282-14292.

[29]Seeliger MW, Brombas A, Weiler R, et al. Modulation of rod photoreceptor output by HCN1 channels is essential for regular mesopic cone vision[J]. Nat Commun, 2011, 2:532.

[30]Thoreson WB, Witkovsky P. Glutamate receptors and circuits in the vertebrate retina [J]. Prog Retinal Eye Res, 1999, 18(6):765-810.

[31]Nakajima Y, Iwakabe H, Akazawa C, et al. Molecular characterization of a novel retinal metabotropic glutamate receptor mGluR6 with a high agonist selectivity for L-2-amino-4-phosphonobutyrate[J]. J Biol Chem, 1993, 268(16): 11868-11873.

[32]Slaughter MM, Miller RF. Characterization of an extended glutamate receptor of the on bipolar neuron in the vertebrate retina[J]. J Neurosci, 1985, 5(1): 224-233.

[33]Xu Y, Dhingra A, Fina ME, et al. mGluR6 deletion renders the TRPM1 channel in retina inactive[J]. J Neurophysiol, 2012, 107(3):948-957.

[34]Dhingra A, Ramakrishnan H, Neinstein A, et al. Gbeta3 is required for normal light ON responses and synaptic maintenance[J]. J Neurosci, 2012, 32(33): 11343-11355.

[35]Koike C, Obara T, Uriu Y, et al. TRPM1 is a component of the retinal ON bipolar cell transduction channel in the mGluR6 cascade [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(1):332-337.

[36]Morgans CW, Brown RL, Duvoisin RM. TRPM1: the endpoint of the mGluR6 signal transduction cascade in retinal ON-bipolar cells[J]. BioEssays，2010，32(7)：609-614.

[37]Strettoi E, Pignatelli V, Rossi C, et al. Remodeling of second-order neurons in the retina of rd/rd mutant mice[J]. Vision Res, 2003, 43(8):867-877.

[38]Marc RE, Jones BW, Watt CB, et al. Neural remodeling in retinal degeneration[J]. Prog Retinal Eye Res, 2003, 22(5):607-655.

[39]Barhoum R, Martinez-Navarrete G, Corrochano S, et al. Functional and structural modifications during retinal degeneration in the rd10 mouse[J]. Neurosci, 2008, 155(3):698-713.

[40]Strettoi E, Pignatelli V. Modifications of retinal neurons in a mouse model of retinitis pigmentosa [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(20):11020-11025.

[41]Nomura A, Shigemoto R, Nakamura Y, et al. Developmentally regulated postsynaptic localization of a metabotropic glutamate receptor in rat rod bipolar cells[J]. Cell, 1994, 77(3):361-369.

[42]Ueda Y, Iwakabe H, Masu M, et al. The mGluR6 5' upstream transgene sequence directs a cell-specific and developmentally regulated expression in retinal rod and ON-type cone bipolar cells[J]. J Neurosci, 1997, 17(9): 3014-3023.

[43]Namekata K, Okumura A, Harada C, et al. Effect of photoreceptor degeneration on RNA splicing and expression of AMPA receptors[J]. Mol Vis, 2006, 12:1586-1593.

[44]Chua J, Fletcher EL, Kalloniatis M. Functional remodeling of glutamate receptors by inner retinal neurons occurs from an early stage of retinal degeneration[J]. J Comp Neurol, 2009, 514(5):473-491.

[45]Varela C, Igartua I, De la Rosa EJ, et al. Functional modifications in rod bipolar cells in a mouse model of retinitis pigmentosa[J]. Vision Res, 2003, 43(8):879-885.

[46]Zhu Y, Misra S, Nivison-Smith L, et al. Mapping cation entry in photoreceptors and inner retinal neurons during early degeneration in the P23H-3 rat retina[J]. Vis Neurosci, 2013, 30(3):65-75.

[47]Margolis DJ, Newkirk G, Euler T, et al. Functional stability of retinal ganglion cells after degeneration-induced changes in synaptic input[J]. J Neurosci, 2008, 28(25):6526-6536.

[48]Sekirnjak C, Jepson LH, Hottowy P, et al. Changes in physiological properties of rat ganglion cells during retinal degeneration[J]. J Neurophysiol, 2011, 105(5):2560-2571.

[49]Margolis DJ, Detwiler PB. Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa[J]. J Ophthalmol,2011，2011：507037.

[50]Trenholm S, Borowska J, Zhang J, et al. Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+channels[J]. J Physiol, 2012, 590(Pt 10): 2501-2517.

[51]Borowska J, Trenholm S, Awatramani GB. An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina[J]. J Neurosci, 2011, 31(13):5000-5012.

[52]Stasheff SF. Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse [J]. J Neurophysiol, 2008, 99(3):1408-1421.

[53]Jensen RJ. Blocking GABA(C) receptors increases light responsiveness of retinal ganglion cells in a rat model of retinitis pigmentosa[J]. Exp Eye Res, 2012, 105:21-26.

[54]Pu M, Xu L, Zhang H. Visual response properties of retinal ganglion cells in the royal college of surgeons dystrophic rat[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006, 47(8):3579-3585.

[55]Jensen RJ. Effects of a metabotropic glutamate 1 receptor antagonist on light responses of retinal ganglion cells in a rat model of retinitis pigmentosa[J]. PLoS One, 2013, 8(10):e79126.

[56]Huang YM, Yin ZQ, Liu K, et al. Temporal and spatial characteristics of cone degeneration in RCS rats[J]. Jpn J Ophthalmol, 2011, 55(2):155-162.

[57]Hossain P, Seetho IW, Browning AC, et al. Artificial means for restoring vision[J]. BMJ, 2005, 330(7481):30-33.

[58]Lakhanpal RR, Yanai D, Weiland JD, et al. Advances in the development of visual prostheses [J]. Curr Opin Ophthalmol, 2003, 14(3):122-127.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

Functional and structural modifications in inner retinal neurons during photoreceptors degeneration

ZHANG Jia, XIANG Zong-qin, XU Ying

(Guangdong-Hongkong-MacauInstituteofCNSRegeneration,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:xuying@jnu.edu.cn)

[KEY WORDS]Photoreceptors degeneration; Bipolar cells; Ganglion cells

[ABSTRACT]Retinitis pigmentosa (RP) is a retina disease which leads to a progressive photoreceptors degeneration. Although the inner neurons that mainly include bipolar cells and ganglion cells of retina remain relative stable during the photoreceptors degeneration, studies show that their morphologies and functions are changed during this process. Stu-dies indicate that rod bipolar cells (RBCs) and cone bipolar cells (CBCs) undergo dendritic retraction and remodelling in retinal degenerated mice, and they show changes in expression of the glutamate receptors as well as responses to glutamate and light stimuli. In many animal models of RP, significant decreases in receptive field size, contrast sensitivity, and threshold sensitivity, as well as an increasing spontaneous spiking in retinal ganglion cells (RGCs) were detected. As these modifications may impact the choice and success of intervention strategies for treating retinal degeneration, it is important to understand the characteristics of any functional deficits resulting from photoreceptors degeneration.

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0179- 08

[收稿日期]2015- 08- 13[修回日期] 2015- 11- 05

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81470656)

通訊作者△Tel: 020-85227086; E-mail: xuying@jnu.edu.cn

[中圖分類號]R774； R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.031