一種改良的間歇性低氧細胞模型方法*

蔡曉紅，　洪芳芳，　陳利亞，　梅紅芳，　林　晶，　王紅霞，　李秀翠，　梁冬施，　溫正旺

(1溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院兒童呼吸科, 浙江 溫州 325027；2焦作市人民醫(yī)院， 河南 焦作 454150)

·實驗技術(shù)·

一種改良的間歇性低氧細胞模型方法*

蔡曉紅1△，洪芳芳1，陳利亞1，梅紅芳1，林晶1，王紅霞2，李秀翠1，梁冬施1，溫正旺1

(1溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院兒童呼吸科, 浙江 溫州 325027；2焦作市人民醫(yī)院， 河南 焦作 454150)

[摘要]目的： 研制細胞氧艙，建立間歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)細胞模型并進行驗證。方法: 定制細胞實驗艙和空氣模擬對照艙，根據(jù)氧分壓-時間曲線設(shè)計間歇低氧模式。將人肺腺癌細胞A549隨機分為正常對照(Con)組、間歇低氧6 h(6IH)組、間歇低氧9 h(9IH)組、空氣模擬對照6 h(6AC)組、空氣模擬對照9 h(9AC)組、持續(xù)低氧4 h(4SH)組、持續(xù)低氧6 h(6SH)組。暴露結(jié)束后光鏡下觀察細胞形態(tài)改變，real-time PCR、免疫組化法檢測缺氧誘導因子1α(HIF-1α)的mRNA和蛋白表達變化。結(jié)果: 該模型間歇低氧模式為5% O2 60 min-20% O2 30 min，6個循環(huán)。與Con組比較，6AC、9AC組為原本細胞形態(tài)，6IH、9IH和6SH組部分細胞出現(xiàn)突起、變圓，胞質(zhì)中出現(xiàn)較多黑色顆粒，細胞邊界模糊，而4SH組未見明顯異常。與6IH組比較，9IH組HIF-1α的mRNA和蛋白表達量明顯增加(P<0.05)；6IH和9IH組HIF-1α的mRNA 和蛋白分別高于4SH和6SH組(P<0.05)；6AC、9AC組與Con組比較差異不顯著。結(jié)論: 5% O2 60 min-20% O2 30 min的間歇性低氧-復氧細胞模式能模擬阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征病理生理過程，是研究該疾病較理想的細胞模型。

[關(guān)鍵詞]間歇性低氧； 人肺腺癌細胞； 缺氧誘導因子1α

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)是一種常見的睡眠障礙性疾病，主要發(fā)病機制為間歇性低氧(intermittent hypoxia, IH)，這種低氧模式為常氧和低氧交替出現(xiàn)，平均每2～5 min循環(huán)1次，每次低氧時間約10～40 s，比持續(xù)低氧對人體損害更嚴重。

OSAHS疾病研究中，大多學者利用手術(shù)或氧艙等建立間歇性低氧動物模型，從整體水平研究OSAHS發(fā)病機制[1-2]。與動物實驗相比，體外細胞實驗具有影響因素單一，人為可操控性大，個體間差異小等優(yōu)點，但由于氧氣彌散困難及細胞氧耗等問題，難以制備高效和符合OSAHS病理生理特點的細胞模型，因此，建立有效的OSAHS細胞模型，尚需進一步探索。本研究自主研發(fā)設(shè)計間歇性低氧細胞模型，并通過監(jiān)測培養(yǎng)基中溶解氧、A549細胞形態(tài)變化及缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)表達變化驗證此模型。

材料和方法

1細胞

人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞株購自上海中科院細胞生物研究所。

2主要試劑

RPMI-1640購自Gibco；胎牛血清購自HyClone；TRIzol Reagent購自lnvitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo；LightCyler480 SYBR Green I Master購自Roche；兔抗人HIF-1α單克隆抗體、HRP標記羊抗兔 II 抗、PV-9000、DAB顯色劑、山羊血清封閉液、PBS均購自北京中杉金橋試劑公司。

3主要方法

3.1細胞氧艙制備氧艙的建立參照Richard等[3]的方法加以改進。氧艙主要由以下部分組成：實驗艙、空氣模擬對照艙、PLC及電腦控制系統(tǒng)、氧氣管道、氮氣管道、二氧化碳管道、空氣輸注管道、氣體減壓閥、氣體流量控制閥和溶解氧電極。實驗艙側(cè)壁設(shè)有氧氣、氮氣和二氧化碳進氣單向閥門，空氣模擬對照艙設(shè)有空氣和二氧化碳單向閥門，均由程序控制電磁閥開關(guān)，艙內(nèi)壓力始終保持常壓。通過PLC及電腦控制系統(tǒng)編程不同程序，調(diào)控艙內(nèi)氧氣濃度，模擬不同的IH環(huán)境。利用氧氣和二氧化碳濃度檢測儀檢測實驗箱和對比箱中的氧氣和二氧化碳濃度。采用溶解氧電極監(jiān)測細胞層面上方1 mm處培養(yǎng)基中溶解氧濃度。細胞氧艙示意圖見圖1。

Figure 1.The schematic diagram of the cell oxygen chamber.

圖1細胞氧艙示意圖

3.2間歇性低氧模式設(shè)定維持實驗艙和對照艙溫度為37 ℃，CO2含量為5%。6孔板每孔添加3 mL培養(yǎng)基，將艙內(nèi)氧濃度從20%迅速降至5%，監(jiān)測培養(yǎng)基中氧分壓變化，繪制氧分壓-時間曲線。根據(jù)曲線特點，當培養(yǎng)基中氧分壓降至(56±4)mmHg時維持10～40 s，統(tǒng)計所需時間。再將艙內(nèi)氧濃度從5%升至20%，記錄培養(yǎng)基中氧分壓達到正常所需時間。根據(jù)記錄的低氧和復氧時間，結(jié)合人體OSAHS疾病特點，設(shè)定該模型間歇性低氧的循環(huán)頻率和時間。

3.3細胞培養(yǎng)A549細胞株復蘇后接種至底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶，加入含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)生長。每隔2 d傳代1次。

3.4分組及模型建立取傳代2～3代后穩(wěn)定對數(shù)期生長細胞，消化后吹打成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為3×109/L，按每孔2 mL接種于6孔板， 48 h后用于實驗，實驗前更換無血清培養(yǎng)基。將細胞隨機分為7組：正常對照(control, Con)組；間歇低氧6 h組(6IH)，即5% O2低氧60 min，20% O2復氧30 min，低氧和常氧交替進行，共暴露6 h；間歇低氧9 h組(9IH)；空氣模擬對照6 h(6 h simulated air control, 6AC)組；空氣模擬對照9 h(9AC)組；持續(xù)低氧4 h(4 h sustained hypoxia，4SH)組：即持續(xù)5% O2暴露4 h；持續(xù)低氧6 h(6SH)組。

3.5觀察細胞形態(tài)造模完成后迅速取出，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、密度變化及死亡情況。細胞圖像通過顯微鏡(×400)攝取。每組獨立的實驗均采集超過30個區(qū)域的細胞。

3.6Real-time PCR法按照TRIzol試劑說明書操作提取細胞總RNA，并測定RNA濃度及鑒定其純度。在20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系中加入總RNA 0.1 ng～5 μg，合成cDNA第一鏈，反應42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min后終止反應。取cDNA 1 μL，上、下游引物(引物序列見表1)各0.5 μL，LightCycle480 SYBR Green I Master 5 μL，dH2O 3 μL構(gòu)成PCR體系。95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，45個循環(huán)。擴增后凝膠電泳觀察β-actin、HIF-1α擴增引物特異性，每個樣本至少重復3次。記錄PCR產(chǎn)物熒光信號達到所設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，既Ct值，采用2-ΔΔCt進行統(tǒng)計處理，結(jié)果代表目的基因的相對表達量，以對照組為校正樣本。

表1　引物序列

3.7免疫組化實驗4%多聚甲醛固定20 min，0.3% Triton X-100孵育10 min，3% H2O210 min，山羊血清37 ℃封閉30 min，I 抗(1∶200)4 ℃過夜。PBS洗滌3×5 min， II 抗37 ℃ 30 min，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37 ℃ 10 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片，觀察。細胞圖像通過顯微鏡(×400)攝取。每組獨立的實驗均采集超過30個區(qū)域的細胞。

4統(tǒng)計學處理

正態(tài)性計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較方差齊時采用Bonferroni-t檢驗，不齊時采用Dunnett’s T3檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1間歇性低氧細胞模型的建立

1.1艙內(nèi)氣體實際濃度實驗艙和空氣模擬對照艙內(nèi)CO2實際濃度為(4.89±1.02)%、(5.29±0.48)%；實際O2濃度為(4.47±0.52)%、(20.03±1.08)%。

1.2培養(yǎng)基中氧分壓變化將艙內(nèi)氧濃度從20%降至5%，待培養(yǎng)基中氧分壓達到(56±4)mmHg所需時間為(59.48±0.32)min。當培養(yǎng)基中氧分壓達到(56±4)mmHg時，維持10～40 s，迅速將艙內(nèi)氧濃度從5%升至 20%，待培養(yǎng)基中氧分壓升至(155±4)mmHg 時所需時間為(28.00±0.48)min。根據(jù)OSAHS睡眠模式間歇低氧病理生理的特點，設(shè)置該模型間歇低氧/復氧條件為5% O260 min-20% O230 min。氧艙及培養(yǎng)基中實際氧分壓見圖2。

Figure 2.The actual level of oxygen partial pressure in the oxygen chamber and culture medium.

圖2氧艙及培養(yǎng)基中實際氧分壓水平

2間歇性低氧細胞模型的驗證

2.1A549細胞形態(tài)的變化光鏡下，部分6IH、9IH和6SH組的細胞正常形態(tài)破壞，細胞出現(xiàn)突起、變圓，胞質(zhì)中較多顆粒聚集，細胞邊界不清，融合成片，部分死細胞懸浮在培養(yǎng)基中，其中9IH組的變化最明顯。Con、6AC、9AC及4SH組的細胞形態(tài)基本正常。各組細胞形態(tài)見圖3。

2.2Real-time PCR法檢測HIF-1α的mRNA表達與相應對照組相比，IH組HIF-1α的mRNA表達增加(P<0.05)；9IH組HIF-1α的mRNA表達量明顯高于6IH組(P<0.05)；6IH、9IH組HIF-1α的mRNA 表達量分別高于4SH、6SH組(P<0.05)；6AC、9AC組與Con組相比差異無統(tǒng)計學意義，各組HIF-1α的mRNA表達情況見圖4。

Figure 3.The changes of cell morphology in the A549 cells under different conditions.

圖3A549細胞形態(tài)學變化的觀察

Figure 4.The mRNA expression of HIF-1α in the A549 cells under different conditions. Mean±SD.n=3.◆P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs6IH;★P<0.05vs4SH group;※P<0.05vs6SH group.

圖4各組A549細胞HIF-1α的mRNA相對表達量

2.3免疫組化法檢測HIF-1α的蛋白表達 HIF-1α主要在細胞核中表達，陽性細胞細胞核呈現(xiàn)棕色或棕褐色。IH組HIF-1α的蛋白表達上調(diào)，9IH組更明顯(P<0.05)。6IH和9IH組高于相應的4SH和6SH組(P<0.05)。與Con組相比，6AC、9AC組HIF-1α的蛋白表達無顯著差異，各組HIF-1α蛋白表達情況見圖5。

討論

OSAHS是睡眠過程中上氣道出現(xiàn)反復塌陷或阻塞引起呼吸暫停、通氣不足和睡眠片段化的一種綜合征，其發(fā)病率較高，可導致機體多器官功能障礙。成人重度OSAHS與高血壓、心血管并發(fā)癥密切相關(guān)。兒童OSAHS主要表現(xiàn)為學習記憶力、行為執(zhí)行力等的下降，出現(xiàn)行為和認知功能損害，導致患兒學習和社會適應能力下降。OSAHS的主要病理生理機制為間歇性低氧。

Figure 5.The protein expression of HIF-1α in the A549 cells under different conditions(×400).

圖5A549細胞HIF-1α蛋白的表達情況

隨著對OSAHS研究的逐漸深入，自1992年Fetcher首次報道慢性間歇性低氧大鼠模型以來，陸續(xù)有建立間歇性低氧/復氧的動物模型的報道。目前應用最多的是常壓低氧氧艙模型[4]。本課題組前期自主設(shè)計的間歇低氧氧艙模型，模型中大鼠動脈最低氧分壓和氧飽和度分別為(44±3)mmHg、(76±3)%，60 s-10% O2、90 s-10% O2和60 s-5% O2分別模擬了輕、中、重度OSAHS[5]。

然而，間歇低氧細胞模型的研究進展緩慢，目前已建立的兩種間歇性低氧細胞模型都有一定的局限性，導致推廣困難。低氧培養(yǎng)基交替暴露細胞模型[6]通過直接改變培養(yǎng)基中氧濃度水平，細胞交替暴露在低氧和正常氧濃度培養(yǎng)基中，通過蠕動泵控制時間，建立間歇低氧模型，該模型設(shè)計復雜且氣源大多采用混合氣體，不易獲得。低氧氣體直接暴露細胞模型[3]通過改變艙內(nèi)氧氣濃度和頻率，模擬不同間歇低氧/復氧模式，該培養(yǎng)箱密閉性強，艙內(nèi)氣體變化緩慢，氣體流量大，明顯增加了實驗的干擾。

與動物模型不同，氧艙內(nèi)的氣相條件并非細胞的直接暴露條件，細胞生長在幾毫米厚的培養(yǎng)基中，溶解在培養(yǎng)基中的氧氣受氣體擴散和自由對流等的影響。氧氣為惰性氣體，貼壁細胞生長在培養(yǎng)皿底端，細胞層面氧氣濃度改變緩慢，氣體擴散和對流效應是影響培養(yǎng)基底部氧濃度的主要因素。氣體在液體培養(yǎng)基中的傳送效率與培養(yǎng)基頂部氧分壓和擴散時間呈正比，與培養(yǎng)基厚度呈反比[7]。培養(yǎng)基中PO2計算見下式：

公式中Pb(t) 是培養(yǎng)基中 PO2，P0是初始化PO2，P1為0時點后PO2，D為擴散率，δ為培養(yǎng)基厚度。

Baumgardner等[8]通過減少細胞培養(yǎng)基厚度和增加培養(yǎng)基流動性提高氧氣彌散效率，成功模擬了OSAHS快速低氧-復氧循環(huán)模式。但該模型中培養(yǎng)基不斷流動，液體剪切力可能影響細胞功能。且該模型承載細胞量少，難完成細胞轉(zhuǎn)錄和翻譯等多方面研究。

理論上培養(yǎng)基底部氧分壓即細胞暴露實際水平，但由于代謝等需要，細胞實際暴露氧分壓要低于培養(yǎng)基底部。Therade-Matharan等[9]指出多能干細胞在正常大氣環(huán)境中生長24 h，培養(yǎng)基中溶解氧濃度降低約5%。本研究充分考慮細胞耗氧因素，造模開始前，更換新的無血清培養(yǎng)基，減少了細胞代謝產(chǎn)物對實驗的影響。

本研究在Li等[3]模型基礎(chǔ)上，設(shè)計單通道氣源，各氣體單獨控制，保證氧艙內(nèi)氣體條件穩(wěn)定，且艙內(nèi)設(shè)有風扇等裝置，克服了前期模型中裝置密閉性強、氣體濃度變化緩慢的缺陷，且操作簡單。

OSAHS睡眠過程中因反復上氣道塌陷或阻塞而出現(xiàn)通氣不足或通氣障礙，患者動脈血氧飽和度下降≥4%，常導致嚴重低氧血癥。斯坦福一項研究顯示重度OSAHS患者最低動脈氧飽和度約為60.10%[10]。本模型在5% O260 min-20% O230 min低氧循環(huán)模式時，培養(yǎng)基中最低氧分壓維持在(56±4)mmHg，符合人類OSAHS低氧的特點，與Yuan等[11]IH模型低氧水平相似。

OSAHS對機體的影響是多方面的。OSAHS患者血管內(nèi)皮細胞修復功能降低，細胞凋亡增加。Hayashi等[12]的研究指出，1周間歇低氧處理后，大鼠心肌細胞出現(xiàn)明顯改變。光鏡下，心肌明顯肥厚，心肌細胞直徑增加，細胞周圍纖維組織增生；電鏡下，細胞核出現(xiàn)塌陷，線粒體腫脹、棘突消失。本研究IH組A549細胞形態(tài)破壞，細胞出現(xiàn)突起、變圓，且隨造模時間延長破壞更加明顯，從細胞形態(tài)改變上驗證了該模型的有效性。

HIF-1是人體重要的缺氧適應性因子，主要由HIF-1α和HIF-1β兩個亞單位組成。其中HIF-1α是缺氧調(diào)節(jié)活性基團，對缺氧異常敏感，是OSAHS中的重要因子，在OSAHS的疾病模型腦組織中和人嗜鉻細胞瘤細胞中表達明顯增加[13-14]。IH能上調(diào)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平，通過激活 mTOR信號通路增加HIF-1α蛋白表達，且顯著高于SH組[14]。本模型6IH和9IH組HIF-1α表達明顯升高，9IH組高于6IH組，且高于相應的4SH、6SH組，間接證明該模型有效，能模擬間歇性低氧的特點。

本模型低氧方式為5% O260 min-20% O230 min，細胞低氧時間和頻率與人類OSAHS均不同，然而，本研究中6IH組和9IH組A549細胞HIF-1α的mRNA表達顯著高于正常組，且高于相應的SH組。Ryan等[15]的細胞間歇性低氧頻率和時間也與人類OSAHS完全不同，Ryan指出，IH組人宮頸癌細胞NF-κB表達明顯增加，且高于同等時間持續(xù)低氧組，該模型短時間的間歇性低氧即可通過HIF-1α選擇性激活NF-κB信號通路引起細胞炎癥反應，為驗證人類OSAHS炎癥信號通路提供了有力證據(jù)。因此，從間接方面我們認為該模型成功模擬了低氧-復氧這種人類OSAHS疾病損害方式。

目前尚無關(guān)于人類OSAHS細胞氧分壓改變情況的研究，很難模擬出完全符合人類OSAHS低氧特點的細胞模型。本研究與其它細胞模型相似，均成功模擬出了間歇低氧狀態(tài)，且與持續(xù)低氧組存在明顯差別，本模型同時具有控制精確、操作簡單等特點，且設(shè)有空氣模擬對照組，排除了實驗過程中氣體沖擊對實驗造成的影響，是研究間歇性低氧病理生理機制較為可靠的基礎(chǔ)保障。另外，該氧艙可通過電腦及PLC系統(tǒng)設(shè)置不同氣體暴露特點，為研究人體多種疾病病理生理特點提供細胞模型。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

An improved method to develop cell culture model of intermittent hypoxia

CAI Xiao-hong1, HONG Fang-fang1, CHEN Li-ya1, MEI Hong-fang1, LIN Jing1, WANG Hong-xia2, LI Xiu-cui1, LIANG Dong-shi1, WEN Zheng-wang1

(1DepartmentofPulmonology,TheSecondAffiliatedHospital&YuyingChildren’sHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China;2ThePeople’sHospitalofJiaozuoCity,Jiaozuo454150,China.E-mail:caixh839@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To establish and validate a novel model of cultured cells for imitating intermittent hypoxia. METHODS: In a chamber with experiment cabin and simulated air control cabin, the frequency and duration of the intermittent hypoxia model according to the time of hypoxia and reoxygenation were evaluated. The A549 cells were randomly divided into 7 groups, named as control (Con) group, 6 h intermittent hypoxia (6IH) group, 9 h intermittent hypoxia (9IH) group, 6 h simulated air control (6AC) group, 9 h simulated air control (9AC) group, 4 h sustained hypoxia (4SH) group, 6 h sustained hypoxia (6SH) group, respectively. When the model was established, the cellular morphology was observed under inverted microscope. The mRNA expression of hypoxia-inducible factor (HIF)-1α was detected by real-time PCR. The protein expression of HIF-1α was analyzed by immunohistochemistry. RESULTS: The intermittent hypoxia cycle (5% O2 60 min-20% O2 30 min for 6 cycles) was established. The damaged A549 cells were observed in 6IH group, 9IH group and 6SH group. Compared with 6IH group, the expression of HIF-1α at mRNA and protein levels was significantly increased in 9IH group (P<0.05). The expression of HIF-1α at mRNA and protein levels in 6IH group and 9IH group was higher than that in 4SH group and 6SH group, respectively (P<0.05). No significant difference among the control group, 6AC group and 9AC group was found. CONCLUSION: The model (5% O2 60 min-20% O2 30 min for 6 cycles) can simulate the pathological process of obstructive sleep apnea hypopnea syndrome. This model is suitable for studying intermittent hypoxia in adherent cells.

[KEY WORDS]Intermittent hypoxia; Human lung adenocarcinoma cells; Hypoxia-inducible factor-1α

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0187- 06

[收稿日期]2015- 06- 01[修回日期] 2015- 09- 17

*[基金項目]浙江省科技廳項目(No. 2013C33174)；浙江省自然科學基金資助項目(No. Y2110277)；溫州市科技合作項目(No. H20130001)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃(No. 2014ZDA014)；國家衛(wèi)計委國家重點臨床專科開放課題(No. 20130201)

通訊作者△Tel: 0577-88002027; E-mail： caixh839@sina.com

[中圖分類號]R363; R563

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.032