牛蒡子苷元誘導人鼻咽癌CNE-1細胞凋亡及其作用機制*

黃棟棟，　孟易禹，　孫棟勛，　金巧智，　陳武兵，　蔡志毅, △

(1溫州醫科大學第一臨床醫學院，浙江 溫州 325000； 2臺州市市立醫院耳鼻咽喉頭頸外科，浙江 臺州 318000)

牛蒡子苷元誘導人鼻咽癌CNE-1細胞凋亡及其作用機制*

黃棟棟1，孟易禹1，孫棟勛1，金巧智2，陳武兵2，蔡志毅1, 2△

(1溫州醫科大學第一臨床醫學院，浙江 溫州 325000；2臺州市市立醫院耳鼻咽喉頭頸外科，浙江 臺州 318000)

[摘要]目的： 探討牛蒡子苷元(arctigenin，ARG)對人鼻咽癌CNE-1細胞凋亡的影響及其分子作用機制。方法: 經不同濃度的ARG處理CNE-1細胞后，采用CCK-8法檢測ARG對CNE-1細胞活力的影響；caspase-3及caspase-9活性檢測法檢測CNE-1細胞caspase-3及caspase-9活性的變化；流式細胞術分析CNE-1細胞凋亡率的變化； real-time PCR法檢測PI3K/AKT/XIAP信號通路相關分子mRNA表達水平的變化；Western blot法檢測PI3K/AKT/XIAP通路蛋白水平的變化。結果: 隨濃度和時間的增加，ARG可抑制鼻咽癌CNE-1細胞的活力(P<0.01)；caspase-3及caspase-9活性的增加及細胞凋亡率的升高表明ARG可顯著促進CNE-1細胞的凋亡；與對照組相比，PI3K/AKT/XIAP信號通路相關分子對mRNA表達均明顯下調(P<0.01)；ARG可明顯下調PI3K/AKT/XIAP各蛋白水平(P<0.05)。結論: ARG可誘導鼻咽癌細胞凋亡，降低PI3K/AKT/XIAP相關分子水平可能是其促進細胞凋亡的機制。

[關鍵詞]牛蒡子苷元； 細胞凋亡； 鼻咽癌

牛蒡子苷元(arctigenin，ARG)是從中國傳統中藥牛蒡子中提取出的木脂素類化合物[1]，是牛蒡子重要的藥理活性成分。近年來研究顯示，ARG具有顯著的抗炎[2]、調節免疫[3]、抗腫瘤[4]等作用。已有文獻報道，ARG可以抑制大腸癌SW480細胞的增殖[5]和介導人白血病細胞的凋亡[6]，并且能夠顯著增強肺癌H460細胞對順鉑等抗腫瘤藥物的化學敏感性[7]。但是關于ARG對鼻咽癌的抗腫瘤效果仍未見文獻報道，并且其具體的抗腫瘤分子機制也尚未闡明。本研究以鼻咽癌CNE-1細胞株為研究模型，檢測ARG對CNE-1細胞凋亡的調控作用，并且對其分子機制進行初步探討。

材料和方法

1材料

ARG購自Sigma；鼻咽癌細胞株CNE-1為高分化人鼻咽癌細胞株，購自中國科學院上海細胞庫；RPMI-1640培養基、PBS緩沖液、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液均購自Gibco；CCK-8試劑盒購自Dojindo；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自Thermo；caspase-3及caspase-9活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；TRIzol reagent、cDNA第一鏈合成試劑盒和Real Master Mix(SYBR Green)熒光定量PCR試劑盒購自Tiangen；兔抗人GAPDH、PI3K、AKT、p-AKT和XIAP單克隆 I 抗購自CST；ECL發光液購自Millipore；DMSO、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 II 抗購自北京索萊寶公司。

2主要方法

2.1細胞培養鼻咽癌CNE-1細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，于37 ℃、5% CO2、95%濕度培養箱中孵育。細胞貼壁生長，平均2 d換液1次，按1∶3傳代，取對數期生長的細胞進行實驗。

2.2藥物配制ARG溶于一定量DMSO，配制成濃度為1×105μmol/L的母液，避光，-20 ℃保存。實驗前用RPMI-1640培養液稀釋母液至所需藥物濃度(10 μmol/L、20 μmol/L 、40 μmol/L和80 μmol/L ，DMSO終濃度均低于0.1%)。

2.3CCK-8法檢測細胞活力的變化將CNE-1細胞按每孔3×103接種于96孔板中，并將96孔板在培養箱預培養24 h后換液。實驗分3組：空白組(不含細胞)、對照組、實驗組。空白組和對照組各加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液100 μL；實驗組每孔各加入含不同濃度的ARG的培養液(10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L)100 μL。置于培養箱中繼續培養24 h、48 h和72 h后各孔分別加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1～2 h后用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度A值，觀察細胞增殖抑制情況。各組設置3個復孔。細胞活力抑制率(%)=(對照組A-實驗組A)/(對照組A-空白組A)×100%。

2.4流式細胞術檢測細胞凋亡率將CNE-1細胞按每孔5×105接種于6孔板中,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養,待細胞貼壁生長后換液。實驗分為對照組和實驗組。對照組加未做處理的培養液，實驗組加入含不同濃度的ARG培養液(10 μmol/L和20 μmol/L)，培養24 h。按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明收集細胞，用PBS洗滌2次，離心去上清，加入200 μL 1×binding buffer懸浮細胞，在細胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育15 min，再加入5 μL PI，混勻，室溫避光5 min，然后上流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡率。

2.5Caspase-3及caspase-9活性的檢測將CNE-1細胞按每孔4×105接種于6孔板中，細胞培養及處理同流式實驗所述。培養24 h后收集細胞，PBS洗滌1次， 4 ℃、600×g離心5 min，棄上清，加入適量裂解液(每2×106個細胞加入100 μL裂解液)，混勻，冰浴裂解15 min。4 ℃、20 000×g離心15 min后轉移上清至預冷的1.5 mL離心管中，按照caspase-3及caspase-9活性檢測試劑盒說明書順序加入檢測試劑進行活性檢測。實驗重復3次。37 ℃孵育2 h后酶標儀測定各個樣本在405 nm的A值，觀察caspase-3及caspase-9活性變化情況。

2.6Real-time PCR法檢測mRNA的表達將CNE-1細胞以每孔4×105接種于6孔板，加藥孵育24 h后收集細胞加1 mL TRIzol提細胞總RNA，紫外分光光度法測RNA純度。按cDNA第一鏈合成試劑盒說明將RNA逆轉錄合成cDNA后，按SYBR Green熒光染料試劑盒說明進行PCR反應。反應以GAPDH為內參照。GAPDH的上游引物序列為5’-CAT CAG CAA TGC CTC CTG CAC-3’，下游引物序列為為5’-TGA GTC CTT CCA CGA TAC CAA AGT T-3’；PI3K的上游引物序列為5’-CTG TGT GGG ACT TAT TGA GGT GGT-3’，下游引物序列為5’-ACT GAT GTA GTG TGT GGC TGT TGA-3’；AKT的上游引物序列為5’-TGT GAA GGA GGG TTG GCT GC-3’，下游引物序列為5’-ACT GCG CCA CAG AGA AGT TGT T-3’；XIAP的上游引物序列為5’-TGT TTC AGC ATC AAC ACT GGC ACG-3’，下游引物序列為5’-GCA TGA CAA CTA AAG CAC CGG AC-3’。各組設置3個復孔。記錄各孔Ct值，并采用2-ΔΔCt法對結果進行分析。

2.7Western blot法檢測蛋白表達將CNE-1細胞以每孔2×105接種于6孔板，加藥孵育48 h后每孔用預冷的PBS漂洗2次，加入胰蛋白酶消化收集細胞并離心，棄上清，加入適量細胞裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解30 min后，4 ℃、15 000×g離心15 min，取上清液，Bradford法測蛋白質濃度。各個樣本蛋白加入1×SDS上樣緩沖液100 ℃變性10 min后，等量上樣，采用SDS-PAGE法將蛋白通過電泳及轉膜后移至PVDF膜。然后將膜置于5%脫脂奶粉中封閉1 h，加 I 抗4 ℃孵育過夜，加入TBST搖床充分洗膜，加 II 抗室溫孵育1 h，TBST再次洗膜后加ECL發光液顯影曝光。 I 抗稀釋比例均為1∶1 000，II 抗稀釋比例為1∶10 000。每個樣本重復3次實驗，分析灰度值，計算各組與內參照GAPDH灰度的相對比值。

3統計學處理

數據經SPSS 19.0軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多樣本均數之間比較采用單因素方差分析，組間采用SNK-q檢驗法進行兩兩比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1ARG對CNE-1細胞活力的影響

CCK-8實驗結果顯示經ARG處理CNE-1細胞后，ARG(10 μmol/L)即可抑制細胞活力，ARG(80 μmol/L)的細胞抑制率顯著增加；且各濃度ARG處理CNE-1細胞的抑制率與作用時間呈正相關，經ARG處理24 h的IC50為23.51 μmol/L，見圖1。

Figure 1.Arctigenin inhibited the viability of the CNE-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs10 μmol/L.

圖1牛蒡子苷元對鼻咽癌CNE-1細胞活性的抑制

2ARG對CNE-1細胞凋亡率的影響

如圖2所示， CNE-1細胞經0、10和20 μmol/L濃度的ARG處理后，凋亡率分別為1.46%、15.4%和25.7%，實驗組的細胞凋亡率分別與對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)。

Figure 2.The apoptosis of the CNE-1 cells after treated with ARG. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖2經不同濃度牛蒡子苷元處理后CNE-1細胞的凋亡率

3ARG對CNE-1細胞caspase-3及caspase-9活性的影響

應用caspase-3及caspase-9活性試劑盒檢測經ARG處理的CNE-1細胞，將對照組活性值設為1，經10 μmol/L和20 μmol/L ARG處理24 h后caspase-3活性分別為1.59±0.08和5.31±0.34,caspase-9活性分別為1.34±0.11和3.55±0.27，提示ARG可上調caspase-3及caspase-9的活性，且與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of ARG on the activity of caspase-3 and -9 in the CNE-1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖3牛蒡子苷元對CNE-1細胞caspase-3及caspase-9活性的影響

4ARG對PI3K/AKT/XIAP信號通路mRNA表達的影響

Real-time PCR結果顯示，以對照組結果作為參照標準，運用2-ΔΔCt法計算得出10 μmol/L ARG組PI3K、AKT及XIAP 對mRNA相對表達量分別為0.78±0.02、0.90±0.03和0.79±0.03；20 μmol/L ARG組分別為0.60±0.02、0.72±0.01和0.55±0.04。說明ARG可下調PI3K/AKT/XIAP信號通路mRNA的表達，見圖4。

Figure 4.The effects of ARG on the mRNA expression of PI3K/AKT/XIAP pathway-related molecules in the CNE-1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖4牛蒡子苷元對CNE-1細胞PI3K/AKT/XIAP 通路分子mRNA表達的影響

5ARG對PI3K/AKT/XIAP信號通路蛋白表達的影響

以GAPDH為內參照，計算各個蛋白與GAPDH灰度的相對比值，設置對照組各成員蛋白表達量為1，10 μmol/L ARG組PI3K、AKT、p-AKT和XIAP蛋白水平分別為0.85±0.04、0.81±0.01、0.45±0.02及0.78±0.03；20 μmol/L ARG組各成員的蛋白水平分別為0.38±0.02、0.66±0.01、0.19±0.02及0.23±0.02。如圖5所示，10 μmol/L和20 μmol/L ARG處理CNE-1細胞后PI3K/AKT/XIAP信號通路蛋白表達量相對于對照組均出現明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

討論

鼻咽癌是我國廣東、廣西、福建和浙江等南方地區常見的一種惡性腫瘤，發病率占當地頭頸外科腫瘤的首位。目前鼻咽癌的治療多采取以放療及化療為主的綜合療法，但放射抗拒和化療耐藥及其副作用是治療失敗的重要原因[8]。而傳統中藥具有可以增加化療療效，降低放療化療毒副作用，延長生存時間，提高生活質量和增加免疫力的效果。因此許多國內外學者試圖尋找天然藥物或其活性成分用于鼻咽癌治療，已有文獻報道姜黃素衍生物T83可促進同源不同輻射抗性鼻咽癌細胞的凋亡，并且有學者也發現漢防己甲素可對人鼻咽癌細胞株的放射起增敏作用[9-10]。

牛蒡子是我國傳統中藥，其味苦、性寒，具有消炎、降糖、消腫等功效[11]。牛蒡子苷元是牛蒡子重要的木脂素提取物，現代藥理學表明其具有一定的抗腫瘤作用。其發揮作用主要是通過阻滯細胞周期、抑制腫瘤血管生成及介導瘤細胞凋亡從而抑制腫瘤細胞生長[12-14]。但是關于ARG對鼻咽癌細胞的基礎研究報道尚少。本實驗通過CCK-8實驗發現ARG可顯著抑制鼻咽癌CNE-1的細胞活力，并且ARG對細胞的抑制作用隨著藥物濃度和作用時間的增加而提升，表明ARG對CEN-1細胞的抑制作用呈濃度和時間依賴性。進一步通過caspase-3和caspase-9活性檢測發現ARG可上調caspase-3及caspase-9的活性，說明ARG可能是通過上調caspase-3及caspase-9的活性從而參與誘導細胞凋亡。

Figure 5.The effects of ARG on the protein levels of PI3K/AKT/XIAP pathway-related molecules in the CNE-1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖5牛蒡子苷元對CNE-1細胞PI3K/AKT/XIAP 通路分子蛋白水平的影響

細胞凋亡是細胞主動性死亡的過程，涉及多種凋亡相關因子的相互作用。Caspase-3及caspase-9屬于細胞凋亡內源性途徑中caspase家族的重要成員，caspase-9活化后激活caspase-3，caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，直接參與啟動細胞凋亡[15]。而XIAP是屬于凋亡抑制蛋白家族的主要成員，是IAP家族中最強的凋亡抑制因子，它可直接抑制caspases調節細胞凋亡。其機制主要可能是通過與caspase-3及caspase-9結合后保留caspase-3與caspase-9作用區域之間的突變位點，提高了caspase-3與caspase-9的位點突變率，當發生結合位點突變時則可發揮抑制細胞凋亡的作用[16]。Real-time PCR結果表明經ARG處理CNE-1細胞后，PI3K/AKT/XIAP信號通路mRNA表達降低。進一步在蛋白水平運用Western blot法檢測得出，經ARG作用后 PI3K/AKT/XIAP蛋白表達下調。這表明ARG可能是通過下調XIAP的表達，激活caspaes-3和caspase-9，從而可降低XIAP對caspaes-3和caspase-9的拮抗作用，因此促進二者的活化，直接參與誘導細胞凋亡。

綜上所述，本研究證實ARG可誘導鼻咽癌CNE-1細胞凋亡，其作用機制可能與下調PI3K/AKT/XIAP信號通路有關。本研究通過體外實驗證實了ARG誘導鼻咽癌細胞的凋亡作用，仍需進行體內實驗為進一步探討ARG的抗腫瘤作用。本研究可為ARG用于鼻咽癌的治療提供實驗依據，為ARG應用于臨床奠定實驗基礎。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effect of arctigenin on apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1

HUANG Dong-dong1, MENG Yi-yu1, SUN Dong-xun1, JIN Qiao-zhi2, CHEN Wu-bing2, CAI Zhi-yi1, 2

(1TheFirstClinicalMedicalInstitute,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China;2DepartmentofOtolaryngology,TaizhouMunicipalHospital,Taizhou318000,China.E-mail:caizy008@tom.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of arctigenin on the apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1 and its potential mechanism. METHODS: The inhibition of cell viability was analyzed by CCK-8 assay. The activity of caspase-3 and caspase-9 was analyzed by caspase-3 and caspase-9 activity kit. Apoptotic cell percentage was evaluated by Annexin V-PI staining. The expression of PI3K/AKT/XIAP signal pathway-related molecules at mRNA and protein levels was analyzed by real-time PCR and Western blot. RESULTS: Arctigenin inhibited the cell activity in a dose- and time-dependent manner after treatment with arctigenin at concentrations of 10, 20, 40 and 80 μmol/L for 24 h, 48 h and 72 h (P<0.01). Arctigenin also increased the activity of caspase-3 and caspase-9 and the apoptotic rate (P<0.05), and down-regulated the mRNA and protein expression of PI3K/AKT/XIAP signal pathway-related molecules (P<0.05).CONCLUSION: Arctigenin induces the apoptosis of CNE-1 cells through PI3K/AKT/XIAP signal pathway.

[KEY WORDS]Arctigenin; Apoptosis; Nasopharyngeal carcinoma

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0101- 05

[收稿日期]2015- 06- 17[修回日期] 2015- 09- 28

*[基金項目]浙江省中醫藥科學研究基金項目(No. 2015ZB132)

通訊作者△Tel： 0576-88858023； E-mail： caizy008@tom.com

[中圖分類號]R965; R730.23

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.017