野生型PTEN基因增強青蒿琥酯抑制K562細胞的作用

成志勇，　徐　倩，　趙亞玲，　付建珠，　谷　蕾，　李　密,　梁麗青，　劉　芳

(1保定市第一醫院血液內科， 河北 保定 071000； 2承德醫學院，河北 承德 067000)

野生型PTEN基因增強青蒿琥酯抑制K562細胞的作用

成志勇1△，徐倩1, 2，趙亞玲1, 2，付建珠1, 2，谷蕾1，李密1,梁麗青1，劉芳1

(1保定市第一醫院血液內科， 河北 保定 071000；2承德醫學院，河北 承德 067000)

[摘要]目的： 探討野生型PTEN轉染人白血病K562細胞系對青蒿琥酯敏感性的影響及其分子作用機制。方法: 將野生型PTEN以腺病毒為載體轉染(感染復數為200)人白血病K562細胞(Ad-WT-PTEN)，同時以轉染空載體腺病毒(Ad)及未轉染細胞為對照組，與青蒿琥酯(ART)聯合作用，觀察野生型PTEN增強青蒿琥酯抑制K562細胞的作用。根據IC50計算PTEN對青蒿琥酯的增敏倍數。以四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞凋亡率，real-time PCR檢測PTEN 的mRNA水平，Western blot檢測PTEN、蛋白激酶B(Akt)及磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白水平；caspase活性檢測試劑盒檢測caspase-3/7的活性。結果: Ad-WT-PTEN轉染K562細胞后，對青蒿琥酯敏感性明顯增加，依據IC50計算增敏倍數為2.25倍。至第3天，Ad-WT-PTEN +ART組較Ad+ART組細胞活力下降、凋亡率升高。Ad-WT-PTEN轉染K562細胞后PTEN 的mRNA及蛋白表達明顯增加，p-Akt水平及caspase-3/7活性下調，以PTEN及青蒿琥酯聯合作用組下調尤為明顯。結論: 野生型PTEN可能通過降低K562細胞Akt磷酸化的水平，并增加caspase-3/7活性，增強細胞對青蒿琥酯的敏感性。

[關鍵詞]PTEN基因； 青蒿琥酯； Akt； Caspase-3/7

青蒿琥酯(artesunate，ART)為青蒿素衍生物，對多種腫瘤細胞具有很好的靶向性，同時毒副作用小，對正常組織細胞毒性低[1]。研究顯示，青蒿琥酯能夠抑制多種造血系統腫瘤如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤細胞增殖，并誘導凋亡[2-3]。青蒿素衍生物與吡柔比星、多柔吡星、氟尿嘧啶等多種化療藥物具有協同作用[4-5]，但其作用機制尚不清楚。

PTEN作為抑癌基因，在調控腫瘤細胞或正常細胞生長、凋亡、黏附、浸潤、遷移等方面具有重要病理、生理作用。它通過抑制Akt介導的信號通路的磷酸化發揮抗腫瘤作用。在包括造血系統腫瘤在內的多種惡性腫瘤細胞中存在PTEN表達下調[5-7]，并與腫瘤預后不良密切相關[6]。PTEN基因能夠增強腫瘤細胞對多種化療藥物的敏感性[5]，但未見與中藥提取物之間的相互作用研究。

青蒿琥酯與抑癌基因PTEN均能夠抑制腫瘤細胞，而二者之間是否具有相互協同抗腫瘤作用目前尚未見相關報道。本研究將二者聯合作用于白血病K562細胞，探討了二者相互協同抗白血病作用及可能的作用機制。

材料和方法

1藥物與試劑

ART為桂林南藥股份有限公司產品。使用前溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中配成1 g/L，放置于-20 ℃保存。所選用的青蒿琥酯終濃度分別為0、12.5、25和50 mg/L。

碘化丙啶(propidium iodide，PI)、噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、引物(北京賽百盛)；PTEN抗體、Akt及 p-Akt(Ser473)抗體(Santa Cruz)；山羊抗鼠Ⅱ抗(北京鼎國生物)；caspase-3/7活性檢測試劑盒(Promega)。

2細胞

人慢性粒細胞白血病K562細胞在RPMI-1640培養基(含10%新生牛血清)中培養，放置37 ℃、5% CO2培養箱孵育。293A 細胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM 中培養，培養條件同K562細胞。

3方法

3.1腺病毒轉染以感染復數(multiplicity of infection，MOI)為200，加入含有PTEN基因或空載體腺病毒轉染人白血病K562細胞，在37 ℃、5% CO2培養箱內培養2 h，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，繼續培養48 h，用流式細胞術檢測表達綠色熒光的K562細胞比例，計算腺病毒轉染效率。

3.2實驗分組 陰性對照(negative control，NC)組：未加用青蒿琥酯，同時未轉染腺病毒； ART組：青蒿琥酯作用K562細胞組； 空載體腺病毒(Ad)組：細胞轉染空載體腺病毒； Ad-WT-PTEN組：細胞轉染野生型PTEN基因組； Ad+ART組：細胞轉染空載體腺病毒同時聯合青蒿琥酯作用組； Ad-WT-PTEN+ART組：細胞轉染野生型PTEN基因同時聯合青蒿琥酯作用組。

3.3細胞形態學檢測將不同處理組細胞培養3 d后，離心細胞后，PBS清洗，涂片后Wright染色，于光學顯微鏡下觀察細胞形態。

3.4MTT法檢測K562細胞活力選取處于對數生長期的K562細胞 1×107/L，加入96孔板。不同處理組在不同時點加入MTT，繼續孵育4 h，然后離心去上清，加入DMSO振蕩，酶標儀檢測各處理組的490 nm處吸光度(A)值，繪制細胞生長曲線。細胞活力=1-(對照組A-實驗組A)/對照組A×100%。計算藥物的IC50(半數抑制濃度)。實驗每組重復3次，計算PTEN基因對青蒿琥酯增敏倍數=ART與Ad聯合作用的IC50/ART與Ad-WT-PTEN聯合作用的IC50。

3.5流式細胞術檢測凋亡收集處理不同處理組不同作用時間的細胞，每組1×106個，用70%乙醇固定，4 ℃過夜；加入RNA酶， 于37 ℃水浴15～30 min，加入碘化丙啶，流式細胞術檢測細胞凋亡率。

3.6定量RT-PCR收集不同組細胞，應用1×PBS清洗2次。TRIzol提取總RNA定量，然后逆轉錄合成cDNA。PCR反應體系總量為25.0 μL，其中 cDNA 模板 2 μL，上、下游引物各為0.5 μL， 20×SYBR染料 1.25 μL，RealMasterMix 10 μL。擴增條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 1 min， 30個循環。根據2-ΔΔCt計算所檢測基因相對表達量，每組數據重復3次，取平均值。PTEN的上游引物序列為5’-TTG TCA TTA TCC GCA CGC TC-3’，下游引物序列為5’-ATA CCA GGA CCA GAG GAA ACC-3’ (產物 101 bp)；β-actin的上游引物序列為5’-AAT GTC ACG CAC GAT TTC CCG C-3’，下游引物序列為5’-CTG GCA CCA CAC CTT CTA CAA T-3’(產物 382 bp)。

3.7Western blot檢測PTEN及p-Akt的蛋白水平收集每組107細胞，1×PBS洗滌2次。將沉淀溶于200 μL細胞裂解液中4 ℃裂解1 h。4 ℃、 12 000 r/min離心20 min。取上清溶解蛋白質，并測定蛋白含量。配制8%的分離膠和5%的濃縮膠取蛋白樣品，加入上樣緩沖液混勻，充分變性蛋白。120 V恒壓電泳。將凝膠、PVDF膜和濾紙浸入轉膜緩沖液中。4 ℃、100 V恒壓，轉膜約2 h。轉膜完畢，取出PVDF膜浸入封閉液，37 ℃封閉1 h。取出封閉好的膜，加入適量用1×TBS稀釋好的 I 抗，4 ℃過夜。用1×TBS漂洗膜5 min×3次，加入適量用1×TBS稀釋好的 II 抗(辣根酶標抗鼠IgG)，37 ℃孵育1 h。TBS漂洗膜5 min×3次。將膜置于培養皿中，加入發光劑，顯色。后進行顯影、定影及灰度掃描分析。

3.8流式細胞術檢測p-Akt取對不同處理組細胞作用48 h后，收集各組細胞，用1×PBS清洗2遍，在含2%甲醛中固定10 min，于90%甲醇中4 ℃孵育15 min，各取細胞懸液100 μL，分為實驗組與對照組，其中實驗組分別加入PE標記的p-Akt抗體各5 μL，對照組加入IgG 5 μL，各組輕輕混勻，室溫避光反應30 min，立即在流式細胞儀上檢測，計數10 000細胞，以對照組作為陰性對照，CellQuest軟件分析，表達水平以平均熒光強度表示。

3.9Caspase-3/7的活性檢測以MOI=100轉染1～3 d后，選取96孔板，每組設置3個復孔，取不同轉染組的K562細胞5 000個(100 μL)，同時將caspase-3/7底物與緩沖液相混合，取100 μL加入孔板，混合孵育4 h，選取波長405 nm處吸光度數值，數值愈高，caspase活化程度則愈高。

4統計學處理

所有數據用SPSS 11.0計算，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組均數比較進行單因素方差分析及q檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1不同處理組光鏡下細胞形態學變化

本研究觀察了對照組、Ad+12.5 mg/L ART組和Ad-WT-PTEN+12.5 mg/L ART組，上述3種處理方法作用K562細胞3 d后，觀察光鏡下不同處理組的細胞形態變化。結果顯示未應用任何藥物的對照組K562細胞呈圓形，體積大，核染色質疏松;Ad+ART處理組的部分細胞體積縮小，核染色質輕度濃縮、邊集;而Ad-WT-PTEN+ART組細胞大部分出現典型的凋亡變化，細胞體積明顯縮小，核染色質濃縮，部分出現核碎裂及核溶解，見圖1。

Figure 1.The morphologic changes of the K562 cells with different treatments for 3 d (Wright staining, ×400).

圖1不同處理組3 d后K562細胞形態的變化

2野生型PTEN對白血病K562細胞活力的影響

腺病毒感染K562細胞后，應用流式細胞術檢測K562細胞轉染效率為(81.2±5.4)%。以MOI=200轉染K562細胞后，MTT法檢測K562細胞對照組、Ad組及Ad-WT-PTEN組的細胞活力，結果顯示轉染PTEN基因后0～3 d，各組之間無明顯差異，4～7 d出現明顯差異，第5天時細胞活力下降最大，為61.33%，明顯低于Ad組的94.69%(P<0.05)，而Ad組與NC組比較差異均無統計學意義。

3K562細胞轉染野生型PTEN對青蒿琥酯敏感性的影響

PTEN對K562細胞生長曲線的實驗發現，在最初轉染野生型PTEN 3 d內，細胞活力與對照組無明顯差異，因此我們檢測了野生型PTEN聯合不同濃度青蒿琥酯作用3 d內對K562細胞活力的影響，結果顯示在干預后1～3 d，以NC組為對照，各組細胞活力為Ad組>Ad-WT-PTEN組>Ad+ART組> Ad-WT-PTEN+ART組，其中NC組、Ad組及Ad-WT-PTEN組比較差異無統計學意義，Ad-WT-PTEN+ART組的細胞活力明顯高于其它各組(P<0.05)。其中第3天，Ad-WT-PTEN+12.5 mg/L ART組的細胞活力為明顯低于Ad+12.5 mg/L ART組(P<0.01)，見圖2。

在干預3 d 后，MTT 檢測結果顯示ART與Ad聯合作用的IC50為31.89 mg/L，ART與Ad-WT-PTEN聯合作用的IC50為14.14 mg/L，因此PTEN基因對青蒿琥酯的增敏倍數為2.25。

4轉染野生型PTEN聯合青蒿琥酯對K562細胞凋亡率影響

Figure 2.The effects of Ad-WT-PTEN or Ad transfection on the viability of the K562 cells treated with different concentrations of ART. Mean±SD.n=3.

圖2不同濃度ART對轉染Ad-WT-PTEN或Ad的K562細胞活力的影響

流式細胞凋亡檢測結果顯示干預后3 d，Ad+12.5 mg/L ART組及Ad-WT-PTEN+12.5 mg/L ART 組均出現典型的亞二倍體凋亡峰，后者細胞凋亡率高于前者(P<0.01)，二者均高于Ad組及Ad-WT-PTEN組(P<0.01)，結果見圖3、表1。

Figure 3.The apoptotic rate of the K562 cells with different treatmens for 3 d.

圖3流式細胞術檢測不同組處理K562細胞3 d后的細胞凋亡情況

5PTEN基因轉染對K562細胞PTEN mRNA/蛋白及p-Akt蛋白水平的影響

以MOI為200轉染K562細胞第3天，PTEN的mRNA和蛋白表達水平最高，3組mRNA水平分別為23.58±4.52、0.575±0.226和0.650±0.516。Ad-WT-PTEN組及Ad組mRNA及蛋白表達水平明顯高于未轉染對照組的mRNA及蛋白水平(P<0.01)。細胞內總Akt水平無明顯變化，而Ad-WT-pTEN組p-Akt水平顯著低于Ad組(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The protein levels of PTEN, p-Akt and total Akt in K562 cells transfected with or withoutPTENgene after 3 d. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsAd-WT-PTEN group.

圖4K562細胞轉染或未轉染PTEN第3 d 未轉染組、Ad組及Ad-WT-PTEN組PTEN、p-Akt及總Akt蛋白水平的變化

6Caspase-3/7活性的檢測

不同處理組干預K562細胞后，PTEN轉染聯合ART組的caspase-3/7活性均高于空載體腺病毒轉染聯合ART組(P<0.05)，并呈現時間依賴性及劑量依賴性，見表1。

表1不同濃度ART作用K562細胞3 d后細胞凋亡率以及作用12 h和24 h后凋亡蛋白caspase-3/7活性的變化

Table 1.The apoptotic rate of the K562 cells with different treatmens after 3 d and the caspase-3 and -7 activity in the K562 cells after treated with different concentrations of ART at 12 h or 24 h (Mean±SD.n=3)

GroupApoptoticrate(%)Caspase-3/7activity12h24hAd1.93±0.850.245±0.0220.256±0.027Ad-WT-PTEN3.12±1.510.252±0.0260.271±0.029Ad+12.5mg/LART19.60±2.10*0.295±0.023*0.321±0.035*Ad-WT-PTEN+12.5mg/LART30.20±3.10*0.368±0.032*0.441±0.046*Ad+25mg/LART26.58±2.80*0.312±0.030*0.384±0.039*Ad-WT-PTEN+25mg/LART43.15±4.50*0.392±0.036*0.531±0.042*

*P<0.05vsAd group and Ad-WT-PTEN group.

討論

青蒿琥酯具有抗腫瘤活性，能抑制多種實體腫瘤細胞如肝癌、胃癌、乳腺癌、結腸癌等細胞增殖，并誘導凋亡[1]。目前研究顯示，青蒿琥酯亦能夠抑制多種造血系統腫瘤，如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤等細胞增殖，并誘導凋亡[2-3]。

本研究表明青蒿琥酯能夠明顯抑制白血病K562細胞增殖，并誘導細胞凋亡。其作用機制可能包括降低白血病細胞內線粒體膜電位；激活caspase介導的凋亡通路，誘導凋亡基因如bcl-2、bax、p53等表達[8]。

PI3K/Akt是細胞內重要信號通路，其磷酸化后，激活下游NF-κB及Bcl-2表達，進一步滅活caspase，在細胞增殖、凋亡、多藥耐藥中發揮重要的生理、病理功能[1]，在包括惡性血液病在內的多種腫瘤中存在此信號通路的異常活化[5-6]。本研究亦表明在K562細胞中存在高強度p-Akt的活化。

PTEN通過其脂質磷酸酶活性調控Akt去磷酸化發揮抗腫瘤作用[3, 5, 9]，將野生型PTEN轉染白血病K562細胞系后，能增加細胞對阿霉素[5]的敏感性。本研究顯示，野生型PTEN過表達的K562細胞p-Akt水平明顯減低，支持PTEN對PI3K/Akt通路的去磷酸化作用。

研究發現青蒿琥酯具有較強的抑制實體腫瘤中PI3K/Akt信號通路的作用，并能上調抑癌基因PTEN表達[8]。因此青蒿琥酯能增強多種化療藥物如多柔吡星、利妥昔單抗等抗腫瘤活性[4-5, 10]。

青蒿琥酯及PTEN均能夠抑制PI3K/Akt通路活性，提示二者在抗腫瘤作用機制中具有協同累加作用，本研究結果表明，野生型PTEN過表達的K562細胞對青蒿琥酯敏感性明顯增加，對其增敏倍數為2.25倍。二者聯合干預組細胞凋亡率亦明顯高于單獨干預組。而p-Akt水平及caspase-3/7活性在二者聯合作用組較單獨作用組有明顯下調，因此本研究提示青蒿琥酯與野生型PTEN可能通過相互協同作用，共同降低K562細胞Akt磷酸化水平，并增加caspase-3/7活性，進而抑制細胞增殖，最終達到誘導白血病K562細胞凋亡作用。

青蒿琥酯具有高效低毒的抗腫瘤活性，對腫瘤細胞具有較強靶向作用，與其它抗腫瘤藥物具有相互協同作用[4-5, 10]。其與PTEN基因聯合作用，通過降低p-Akt及抑制caspase活性促進白血病細胞凋亡，在抗白血病治療中具有廣泛的應用前景。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Wild-type PTEN gene enhances the inhibitory effect of artesunate on K562 cell growth

CHENG Zhi-yong1, XU Qian1, 2, ZHAO Ya-ling1, 2, FU Jian-zhu1, 2, GU Lei1, LI Mi1，LIANG Li-qing1,LIU Fang1

(1DepartmentofHematology,TheNo.1HospitalofBaoding,Baoding071000,China；2ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China.E-mail:dzczy@sohu.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of wild-type PTEN transfection on the sensitivity of human leukemia K562 cells to artesunate (ART) and its molecular mechanism. METHODS: The adenovirus containing wild-type PTEN (Ad-WT-PTEN) or empty vectors (Ad) were transfected into K562 cells [with multiplicity of infection (MOI)=200]. The untransfected cells served as normal control. The effect of wild-type PTEN on the inhibition of K562 cell growth by ART was observed. The sensitizing ratio of PTEN combined with ART based on IC50was calculated. The viability of K562 cells was detected by MTT assay. The apoptosis was analyzed by flow cytometry. The mRNA level of PTEN was assessed by real-time PCR. The protein expression of PTEN, p-Akt and Akt was detected by Western blot. The activity of caspase-3/7 was measured by caspase activity kits. RESULTS: The sensitivity of K562 cells to ART was significantly increased by 2.25 folds after transfected with PTEN based on the IC50. The cell viability in Ad-WT-PTEN+ART group was significantly lower than that in Ad+ART group after transfection for 3 d (P<0.01). The apoptotic rate in Ad-WT-PTEN+ART group was significantly higher than that in Ad+ART group (P<0.01). The expression of PTEN at mRNA and protein levels in the K562 cells after transfection with PTEN was significantly increased, and the protein level of p-Akt and caspase-3/7 activity were down-regulated, particularly in PTEN combined with ART group. CONCLUSION: The wild-type PTEN gene enhances the sensitivity of the K562 cells to ART by down-regulating the level of p-Akt and up-regulating the caspase-3/7 activity.

[KEY WORDS]PTEN gene; Artesunate; Akt; Caspase-3/7

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0112- 06

[收稿日期]2015- 05- 28[修回日期] 2015- 11- 05

通訊作者△Tel： 0312-2096685; E-mail: dzczy@sohu.com

[中圖分類號]R730.23; R733

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.019