PI3K/Nrf2通路在內毒素休克兔腎損傷中的作用*

陳牡林，　余劍波，　宮麗榮 ，　史　佳

(1天津醫科大學南開臨床學院，天津市南開醫院麻醉科，天津 300310； 2天津市西青醫院麻醉科，天津 300380 )

PI3K/Nrf2通路在內毒素休克兔腎損傷中的作用*

陳牡林1, 2，余劍波1△，宮麗榮1，史佳1

(1天津醫科大學南開臨床學院，天津市南開醫院麻醉科，天津 300310；2天津市西青醫院麻醉科，天津 300380 )

[摘要]目的： 探討磷脂酰肌醇3-激酶/核因子E2相關因子2(PI3K/Nrf2)信號通路在內毒素休克兔急性腎損傷中的作用。方法: 健康清潔級雄性新西蘭大白兔50只，隨機分為5組(每組10只)：對照組(C組)、內毒素休克模型組(L組)、渥曼青霉素+內毒素休克組(WL組)、渥曼青霉素組(W組)和二甲基亞砜組(D組)。W組、WL組經耳緣靜脈注射渥曼青霉素0.6 mg/kg，D組注射二甲基亞砜0.08 mL/kg，C組和L組注射等容量生理鹽水。30 min后，L組和WL組靜脈注射脂多糖5 mg/kg(溶于2 mL生理鹽水)，C組、W組和D組注射等容量生理鹽水。注射脂多糖或生理鹽水后6 h處死兔，取腎組織進行腎損傷評分(HSK)，測定血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和尿α1-微球蛋白(α1-MG)濃度，檢測腎組織MDA含量及SOD活性，檢測腎組織Nrf2和HO-1的mRNA總Akt蛋白、p-Akt蛋白、總Nrf2蛋白、p-Nrf2蛋白、核Nrf2蛋白和HO-1蛋白水平。結果: 與C組、W組及D組比較，L組和WL組HSK、BUN、Cr、α1-MG及MDA含量升高，SOD活性降低，腎組織Nrf2和HO-1的mRNA、p-Akt蛋白、Nrf2總蛋白、p-Nrf2蛋白、Nrf2核蛋白及HO-1蛋白的水平上調(P<0.05)。C組、W組和D組之間上述指標差異無統計學顯著性。與L組比較，WL組HSK、BUN、Cr、α1-MG及MDA含量升高，SOD活性降低，腎組織Nrf2和HO-1的mRNA、p-Akt蛋白、Nrf2總蛋白、p-Nrf2蛋白、Nrf2核蛋白及HO-1蛋白的水平降低(P<0.05)。結論: PI3K/Nrf2通路激活是內毒素休克誘發兔急性腎損傷時機體的適應性調節反應機制之一。

[關鍵詞]磷脂酰肌醇3-激酶；核因子E2相關因子2； 內毒素休克； 急性腎損傷

腎臟是內毒素休克最容易累及的器官之一，其機制不明，治療棘手。研究表明[1]，內毒素血癥并發急性腎衰竭的病死率可高達74.5%。因而，探明內毒素休克腎損傷的機制，對預防和減輕急性腎損傷以改善內毒素休克預后有著十分重要的臨床意義。核因子E2相關因子2/抗氧化反應元件(nuclear factor E2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE)是體內重要的防御性信號轉導通路。我們前期研究已經證實，ARE其中重要之一的血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)可以減輕內毒素休克腎臟損傷[2]。本研究旨在評價其上游信號通路磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Nrf2在內毒素休克兔急性腎損傷中的作用，為內毒素休克腎損傷的防治提供理論基礎和新思路。

材料和方法

1主要試劑與儀器

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自Sigma；渥曼青霉素(wortmannin)購自Selleck；總RNA提取試劑盒和real-time PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；核蛋白及總蛋白提取試劑盒(Thermo)；山羊抗兔lgG抗體(北京康為世紀生物科技有限公司)； 抗兔HO-1多克隆抗體(Abcam )；兔Nrf2多克隆抗體(Biorbyt)； p-Akt(Ser470)抗體(博奧森公司)；β-actin抗體(CST)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定試劑盒和超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase，SOD)活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。BX51光學顯微鏡和熒光顯微鏡(Olympus)；多功能酶標儀(BioTek)；Quantity One凝膠成像分析系統(Bio-Rad)；LineGene 9620實時定量PCR儀(杭州博日科技有限公司)。

2實驗動物與分組

健康清潔級雄性新西蘭大白兔50只，2月齡，體重1.5～2.0 kg。由天津市中國醫學科學院生物工程研究所提供[許可證號：SCXK(京)2011-0008]。室溫18～22 ℃，安靜環境常規飼養，適應環境1周，實驗前禁食24 h，自由飲水。采取隨機數字表法，將其分為5組(n=10)：對照(control,C)組、內毒素休克模型組(L組)、渥曼青霉素+內毒素休克組(WL組)、渥曼青霉素組(W組)和二甲基亞砜(dimthyl sulfoxide，DMSO)組(D組)。

3主要方法

3.1內毒素休克模型制備實驗兔經耳緣靜脈注射20%烏拉坦5 mL/kg麻醉后，仰臥固定于兔臺上。耳緣靜脈置管建立靜脈輸液通路。頸部備皮消毒，1%利多卡因局麻，剪開頸部正中皮膚，分離氣管和左側頸內動脈。行氣管插管及左側頸內動脈置管，保留自主呼吸，連續監測動脈血壓。血壓穩定后30 min，W組和WL組經耳緣靜脈注射wortmannin 0.6 mg/kg(溶劑為DMSO 0.08 mL/kg)，D組注射DMSO 0.08 mL/kg，C組和L組各注射等容量生理鹽水。30 min后，L組和WL組靜脈注射LPS 5 mg/kg(溶于2 mL生理鹽水)，C組、W組及D組注射等容量生理鹽水。排除給予LPS 后2 h 內平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)未下降到基礎值75%及以下或給予LPS 后6 h 內死亡的動物，并予補充。

3.2標本采集與貯存靜脈注射LPS或生理鹽水后6 h經心臟采血5 mL，3 000 r/min 4 ℃離心15 min。取膀胱尿液3 mL。采用全自動生化分析儀測定血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)濃度和尿α1-微球蛋白(α1-microglobulin，α1-MG)濃度。放血處死兔，留取雙腎，4 ℃磷酸鹽緩沖鹽水沖洗腎組織表面，右腎組織用4%甲醛溶液固定，左腎組織液氮罐速凍后保存于-80 ℃低溫冰箱。

3.3腎組織病理觀察與損傷評分取4%甲醛固定的右腎組織，石蠟包埋、切片(厚5 μm)、HE 染色。參照文獻[3-4]介紹的方法，每張切片隨機選取10個視野于光學顯微鏡下觀察(×200)，進行腎組織損傷評分。腎組織損傷評分標準：(1)近曲小管改變：小管上皮扇貝樣改變，伴有細胞刷狀緣著色斑片狀脫失為1分；上皮細胞腫脹或增厚，伴有刷狀緣著色部分脫失為2分；上皮細胞顯著腫脹或有空泡形成，刷狀緣著色脫失>50%為3分。(2)小管擴張和上皮增厚： <25%為1分；25%～50%為2分；>50%為3分。(3)小管壞死/細胞碎裂： <25%為1分； 25%～50%為2分；>50% 為3分。(4)小管上皮/基底膜剝離：偶發為1分；片狀(尤其在腎髓質)為2分； 腎髓質和皮質多發為3分。(5)小管上皮細胞凋亡： <10%為1分；10%～50%為2分；>50% 為3分。

3.4腎組織MDA含量及SOD活性的測定取-80 ℃中保存的左腎組織制備腎組織勻漿，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

3.5實時熒光定量PCR法測定HO-1及Nrf2的mRNA表達水平按照總RNA提取試劑盒的操作步驟提取腎組織總RNA，用分光光度法測定其濃度及純度，逆轉錄合成cDNA，以其為模板進行實時熒光定量PCR。采用Primer Premier 5.0引物設計軟件，根據NCBI公布的兔基因序列設計引物，通過NCBI中的BLAST功能，檢測引物的特異性。HO-1的上游引物為5’-GTCTACGCCCCGCTCTACTTCCCG-3’，下游引物為5’-TAGCCTCTTCCACCACCCTCTGCC-3’，產物片段長度為394 bp；Nrf2上游引物為5’-TTAGTGCTTTTGAGGATTCTTTCGG-3’，下游引物為5’ -AATTCTGTGCTTTCAGGGTGGTTCT-3’，產物片段長度為262 bp；β-actin上游引物為5’-AAACGAGACGAGATTGGCATGGCTTTA-3’,下游引物為5’-GGGATGCTCGCTCCAACGACTGCT-3’，產物片段長度為143 bp。PCR反應體系為QuantiTectTMSYBR Green PCR Mix 10 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，RNase-free ddH2O 6.0 μL；反應條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。采用熒光定量PCR儀測定β-actin、HO-1及Nrf2的Ct值，采用SDS軟件以2-ΔΔCt法相對定量分析HO-1和Nrf2 的mRNA表達水平[5]。

3.6Western blot法測定腎組織HO-1蛋白、總Nrf2蛋白、p-Nrf2蛋白、核Nrf2蛋白、總Akt蛋白及p-Akt的蛋白水平取-80 ℃保存的左腎組織，按說明提取組織總蛋白及核蛋白，離心取上清液進行蛋白定量，取80 μg蛋白加入5×SDS上樣緩沖液，95 ℃變性10 min，經10% SDS-PAGE分離蛋白，轉膜30 min，封閉2 h后，加入兔HO-1多克隆抗體(1∶1 000)、Nrf2多克隆抗體(1∶1 000)和Akt多克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔lgG抗體(1∶3 000)，室溫避光搖床孵育1 h后漂洗。于暗室中用增強化學發光液進行顯色與曝光，采用Quantity One凝膠成像分析系統進行掃描，以目的蛋白與內參照β-actin條帶積分吸光度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

4統計學處理

采用SPSS 18.0統計學軟件進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1血BUN、Cr及尿α1-MG濃度

與C組比較，L組和WL組血Cr、BUN及尿α1-MG濃度升高(P<0.05)；W組和D組上述指標無統計學差異。與L組比較，WL組血Cr、BUN及尿α1-MG濃度升高(P<0.05)，見表1。

表1各組兔血肌酐、尿素氮及尿α1-MG濃度

Table 1.The concentrations of blood urea nitrogen (BUN), creatinine (Cr) and urinary α1-microglobulin (α1-MG) in each group (Mean±SD.n=10)

GroupBUN(mmol/L)Cr(μmmol/L)α1-MG(mg/L)C7.55±0.7378.82±8.294.93±0.87D7.65±1.0584.16±10.855.11±0.98W8.16±1.1781.39±10.135.19±0.89L16.16±1.34*#&138.45±12.76*#&15.52±1.02*#&WL18.48±1.88*#&△166.04±12.21*#&△26.87±1.14*#&△

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D;&P<0.05vsgroup W;△P<0.05vsgroup L.

2腎組織HSK、MDA含量及SOD活性

與C組比較，L組和WL組腎組織的HSK和MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；W組和D組上述指標差異無統計學意義。與L組比較，WL組腎組織的HSK和MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)，見表2。

表2腎組織損傷評分、腎組織丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性的觀察

Table 2.The changes of histological scores, MDA content and SOD activity of the kidney (Mean±SD.n=10)

GroupHSKMDA(mol/g)SOD(μU/g)C1.56±0.475.81±0.70175.79±5.11D2.05±0.815.91±0.96177.36±8.30W1.75±0.806.44±0.91178.81±7.37L6.79±1.36*#&12.29±1.61*#&109.79±4.72*#&WL8.45±0.79*#&△14.20±1.40*#&△85.70±8.65*#&△

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D;&P<0.05vsgroup W;△P<0.05vsgroup L.

3Real-time PCR結果

與C組比較，L組和WL組腎組織Nrf2及HO-1的mRNA表達上調(P<0.05)；D組和W組上述指標間差異無統計學意義。與L組比較，WL組腎組織Nrf2及HO-1的mRNA表達下調(P<0.05)，見表3。

表3腎組織Nrf2及HO-1的mRNA表達水平

Table 3.The mRNA expression of HO-1 and Nrf2 in the renal tissues (Mean±SD.n=10)

GroupNrf2mRNAHO-1mRNAC1.00±0.041.00±0.05D0.98±0.070.96±0.05W1.02±0.090.99±0.09L3.04±0.14*#&3.10±0.12*#&WL2.08±0.90*#&△1.90±0.07*#&△

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D;&P<0.05vsgroup W;△P<0.05vsgroup L.

4Western blot結果

與C組比較，L組和WL組腎組織的p-Akt蛋白、總Nrf2蛋白、p-Nrf2蛋白、核Nrf2蛋白及HO-1蛋白水平上升(P<0.05)；D組和W組上述指標無統計學差異。與L組比較，WL組的p-Akt蛋白、總Nrf2蛋白、p-Nrf2蛋白、核Nrf2蛋白及HO-1蛋白水平下降(P<0.05)，見圖1，表4和表5。

Figure 1.The protein levels of HO-1, total Nrf2, p-Nrf2, nu-clear Nrf2, total Akt and p-Akt in the renal tissues determined by Western blot.

圖1腎組織HO-1、總Nrf2、p-Nrf2、核Nrf2、總Akt及p-Akt蛋白水平的檢測

表4腎組織總Akt、p-Akt及HO-1蛋白水平的觀察

Table 4.The protein levels of total Akt， p-Akt and HO-1 in the renal tissues (Mean±SD.n=10)

GroupTotalAktproteinp-AktproteinHO-1proteinC0.56±0.030.31±0.040.34±0.07D0.56±0.060.32±0.060.36±0.04W0.54±0.040.32±0.040.36±0.08L0.57±0.050.50±0.09*#&0.56±0.07*#&WL0.55±0.030.42±0.04*#&△0.45±0.10*#&△

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D;&P<0.05vsgroup W;△P<0.05vsgroup L.

表5腎組織總Nrf2、p-Nrf2及核Nrf2蛋白水平的觀察

Table 5.The protein levels of total Nrf2, p-Nrf2 and nuclear Nrf2 in the renal tissues (Mean±SD.n=10)

GroupTotalNrf2proteinp-Nrf2proteinNuclearNrf2proteinC0.43±0.030.36±0.050.34±0.04D0.46±0.040.36±0.040.35±0.08W0.47±0.040.38±0.040.36±0.06L0.71±0.07*#&0.62±0.06#&0.61±0.07*#&WL0.59±0.09*#&△0.53±0.04*#&0.51±0.08*#&△

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D;&P<0.05vsgroup W;△P<0.05vsgroup L.

討論

膿毒癥是由病原微生物入侵機體后引起的全身炎癥反應綜合征，可進展為膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征，其中腎臟是易受攻擊的靶器官之一。研究認為[6]，腎臟有效灌注不足，內毒素含量增高，凝血機制失調及細胞凋亡等機制參與了膿毒癥所致腎損傷，其中內毒素是引起膿毒癥急性腎損傷過程的重要介質。內毒素可通過TLR4激活NF-κB信號通路，啟動炎癥級聯放大反應，增加核內細胞因子和炎癥介質的基因表達，釋放大量炎癥因子(TNF-α、內皮素1等)，作用于腎臟的系膜細胞及免疫細胞系統，引起器官組織血流低灌注、強烈的炎癥反應以及氧自由基損傷等，造成腎臟功能損傷[7]。內毒素休克模型是實驗室常用模型，本實驗參照文獻[8]中介紹的方法經耳緣靜脈注射LPS 5 mg/kg制備兔內毒素休克模型，以給予LPS 2 h內MAP下降至基礎值的75%及以下為內毒素休克模型制備成功的標準。本實驗中，L組和WL 組給予LPS后2 h內，MAP均下降至基礎值的75%及以下，且腎組織損傷評分升高、血BUN、Cr、尿α1-MG濃度及腎組織MDA含量升高，提示內毒素休克誘發兔急性腎損傷模型制備成功。

Wortmannin是非ATP競爭型PI3K抑制劑，可與PI3K的110 kD催化亞基結合，特異性抑制PI3K，從而抑制PI3K/Akt信號通路[9]。文獻報道[10]使用wortmannin 0.6 mg/kg可成功阻斷兔心肌細胞PI3K/Akt信號通路，且無死亡及急性毒性反應，結合預實驗結果，本實驗采用wortmannin 0.6 mg/kg作為實驗劑量。結果顯示，與C組比較，W組及D組血清BUN、血清Cr、尿α1-MG濃度及腎組織MDA含量均無顯著差異，可以排除實驗劑量wortmannin及DMSO對腎損傷的影響。

PI3K是存在于體內多種細胞的一種脂激酶。Akt又稱蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是PI3K信號傳導途徑中一個重要的下游靶激酶。細胞內外刺激可通過酪氨酸蛋白激酶激活PI3K生成PIP3，與Akt結合并暴露其活性位點，在磷脂酰肌醇依賴型蛋白激酶催化和輔助下， Akt上Ser 473和(或)Thr 308位點磷酸化而被激活。活化的Akt可引起下游磷酸化級聯反應和靶蛋白之間的相互作用，調控細胞增殖與凋亡、生長與存活等一系列生物學效應[11-12]。Nrf2是CNC(cap′n′collar)家族中活力最強的轉錄調節因子。生理狀態下，Nrf2以Keap-1-Nrf2異二聚體的形式存在于細胞質中，以Keap-1介導的蛋白酶體泛素化反應的方式降解，處于低濃度非活性狀態；在氧化應激狀態下，Keap-1構象改變，或者Nrf2磷酸化，Nrf2從胞漿蛋白Keap-1中解離，易位至細胞核與抗氧化基因啟動子區域的ARE結合，激活下游的抗氧化蛋白如SOD、HO-1及過氧化氫酶(catalase，CAT)等的活性表達，維持機體氧化還原穩態[13]。Nrf2的活化受蛋白磷酸化的調控，目前認為，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、PI3K、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等信號通路分子廣泛參與了Nrf2的活化和核轉位過程， 誘導Nrf2核轉位的信號通路類型與誘導劑及細胞種類等因素相關[14]。PI3K可通過調整肌動蛋白微絲的排列，調節肌動蛋白解聚，導致Nrf2與Keap-1復合體解體，增加Nrf2核轉位[15]。

本研究結果顯示，給予內毒素后腎組織Nrf2和HO-1的mRNA表達上調， p-Akt、總Nrf2蛋白、p-Nrf2、核Nrf2蛋白及HO-1蛋白水平增加，SOD活性增強，表明內毒素作用下，PI3K/Akt-Nrf2通路激活，抗氧化蛋白表達增加，機體抗氧化損傷能力增強。內毒素休克兔給予PI3K特異性阻斷劑wrotmannin后，腎組織Nrf2及HO-1的mRNA表達下調，p-Akt、總Nrf2蛋白、核Nrf2蛋白及HO-1蛋白水平減少，SOD活性減弱，表明抑制PI3K/Akt后，Nrf2及其下游蛋白表達減少，機體抗氧化損傷能力下降，內毒素休克所致腎損傷加重。但抑制PI3K/Akt后，腎組織Nrf2/ARE通路相關蛋白表達并未完全阻斷，表明腎組織Nrf2/ARE通路的激活可能存在除PI3K以外的其它調控因素。關于PI3K以外相關信號通路調控腎組織Nrf2/ARE通路的具體機制有待進一步研究。

綜上所述，PI3K/Nrf2通路激活是兔內毒素休克誘發急性腎損傷時機體的適應性調節反應機制之一。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Role of PI3K/Nrf2 signaling pathway in endotoxin-induced acute kidney injury in rabbits

CHEN Mu-lin1, 2, YU Jian-bo1, GONG Li-rong1, SHI Jia1

(1DepartmentofAnesthesiology,TianjinNankaiHospital,NankaiClinicalCollegeofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300310,China;2DepartmentofAnesthesiology,TianjinXiqingHospital,Tianjin300380,China.E-mail:jianboyu99@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To evaluate the role of phosphatidylinositol 3-kinase/nuclear factor E2-related factor 2 (PI3K/Nrf2) signaling pathway in endotoxin-induced acute kidney injury in rabbits. METHODS: Healthy male New Zealand white rabbits were randomly divided into 5 groups: control group (group C), LPS group (group L), wortmannin+LPS group (group WL), wortmannin group (group W) and dimthyl sulfoxide (DMSO) group (group D). Wortmannin at dose of 0.6 mg/kg was injected via the auricular vein in groups W and WL, DMSO at concentration of 0.08 mL/kg was injected in group D, while normal saline (0.08 mL/kg) was injected in groups C and L. LPS at dose of 5 mg/kg was injected via the auricular vein in groups L and WL 30 min later, and equal volume of normal saline was injected in group C, D and W for control. The rabbits were sacrificed 6 h after LPS or normal saline administration. The kidneys were removed for microscopic examination and the determination of histological scores of kidney (HSK). The concentrations of blood urea nitrogen (BUN) and creatinine (Cr), urinary α1-microglobulin (α1-MG), MDA content, SOD activity, the mRNA expression of Nrf2 and HO-1, and the protein levels of total Akt, p-Akt, total Nrf2, p-Nrf2, nuclear Nrf2 and HO-1 in the renal tissues were also detected. RESULTS: Compared with groups C, D and W, the concentrations of BUN and Cr, urinary α1-MG concentration, MDA content and HSK were significantly increased, while SOD activity was significantly decreased (P<0.05). The mRNA expression of Nrf2 and HO-1, and the protein levels of p-Akt, total Nrf2, p-Nrf2, nuclear Nrf2 and HO-1 in the renal tissues were significantly increased in groups L and WL. No significant change among groups C, D and W was observed. Compared with group L, the concentrations of BUN and Cr, urinary α1-MG concentration, MDA content and HSK were significantly increased, while SOD activity, the mRNA expression of Nrf2 and HO-1, and the protein levels of p-Akt, total Nrf2, p-Nrf2, nuclear Nrf2 and HO-1 in the renal tissues were significantly decreased in group WL. CONCLUSION: Activation of PI3K/Nrf2 signaling pathway may be one of the regulatory mechanisms of the body adapting to the endotoxin-induced acute kidney injury in rabbits.

[KEY WORDS]Phosphatidylinositol 3-kinase; Nuclear factor E2-related factor 2; Endotoxic shock; Acute kidney injury

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0129- 05

[收稿日期]2015- 03- 11[修回日期] 2015- 10- 22

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81372096)

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[中圖分類號]R363.2; R515.3

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.022