沉默TREM-2對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞遷移和侵襲的影響*

黃生輝，　李建華，　張瑋瓊，　劉貴旺，　許錦煌，　鄭沛中，　黃建榮 , △

(1中山大學孫逸仙紀念醫院骨科，廣東 廣州 510235； 2廣州醫科大學生理教研室 ，廣東 廣州 511436； 3增城市人民醫院骨科，廣東 廣州 511300)

沉默TREM-2對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞遷移和侵襲的影響*

黃生輝1，李建華2，張瑋瓊3，劉貴旺1，許錦煌3，鄭沛中3，黃建榮1, 3△

(1中山大學孫逸仙紀念醫院骨科，廣東 廣州 510235；2廣州醫科大學生理教研室 ，廣東 廣州 511436；3增城市人民醫院骨科，廣東 廣州 511300)

[摘要]目的： 應用RNA干擾(RNAi)技術沉默類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞(RA-FLS)髓樣細胞觸發受體2(TREM-2)的表達，探討TREM-2基因沉默對RA-FLS遷移和侵襲能力的影響及其相關機制。方法: 向RA-FLS轉染特異性的TREM-2 siRNA，利用RT-PCR法和Western blot法檢測沉默效果；CCK-8法檢測各組細胞生長情況；Transwell小室測定細胞的遷移和侵襲能力；ELISA法檢測細胞MMP-2和MMP-9的分泌水平；Western blot法分析沉默TREM-2基因對細胞PI3K/AKT通路的影響。結果: TREM-2 siRNA能顯著降低RA-FLS中TREM2 mRNA和蛋白的表達(P<0.05)。沉默TREM-2基因后，各時點各組細胞的活力未見明顯差異；特異性干擾組RA-FLS的遷移細胞數目與空白組和control siRNA組相比明顯增多(P<0.05)；TREM-2 siRNA組侵襲細胞數目相比空白組和control siRNA組明顯增多(P<0.05)；TREM-2 siRNA干擾后RA-FLS分泌的MMP-2顯著增加(P<0.05)而MMP-9未見明顯變化；特異性轉染后的RA-FLS相對于對照組PI3K/AKT的磷酸化水平顯著增強(P<0.05)。結論: TREM-2可能通過調節PI3K/AKT通路的活化對RA-FLS的遷移和侵襲能力發揮著重要作用。

[關鍵詞]髓樣細胞觸發受體2； 類風濕關節炎； 滑膜細胞； 細胞遷移； 細胞侵襲； PI3K/AKT通路

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種進展性自身免疫性疾病,主要累及關節，以滑膜增殖以及炎癥細胞浸潤為特征，最終導致組織破壞與殘疾。滑膜成纖維細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLSs)在RA的發生、發展中發揮著極為重要作用，關節滑膜襯里層增生的RA-FLS可直接黏附到軟骨表面，伴隨著新形成的血管共同形成有侵襲能力的血管翳侵襲周圍的軟骨和骨組織。造成細胞外基質和軟骨組織破壞的最重要因素是RA-FLS分泌大量的基質金屬蛋白酶(metalloproteinases，MMPs)到滑膜液中。

髓樣細胞觸發受體2(triggering receptor expressed on myeloid cells-2，TREM-2)是新近發現的免疫模式受體，主要高表達于巨噬細胞、樹突狀細胞、小膠質細胞、成纖維細胞、某些腫瘤細胞等細胞中，已有的研究表明TREM-2參與了細胞的免疫、吞噬、炎癥調節等過程，TREM-2的表達異常參與了多種疾病病理過程。Crotti等[1]證實在在急性類風濕關節炎的病人滑膜組織的RA-FLS中TREM2的表達明顯升高。本課題組前期的實驗結果顯示在類風濕關節炎模型大鼠滑膜組織FLS 中TREM-2表達明顯升高[2]。但TREM-2在RA-FLS遷移和侵襲中所起到作用以及其機制尚缺乏相關報道。本文通過RNA干擾技術對該問題進行了初步探討，以期進一步闡明RA病理機制。

材料和方法

1siRNA沉默RA-FLS細胞TREM-2基因

人RA-FLS購于Cell Applications，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基(Gibco)，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每2～3 d換液1次，細胞覆蓋率>80%時用胰酶消化傳代，取第3～7代細胞用于實驗。將RA-FLS 以5×107/L的密度接種于6 孔板，每孔2 mL完全培養基，當細胞融合度達到50%～70%時采用脂質體介導TREM-2 siRNA 轉染細胞。設置RA-FLS 轉染TREM-2 siRNA組(TREM-2 si-RNA)、RA-FLS空白對照組(unmanipulated control)和RA-FLS 轉染非特異性 siRNA 組(control siRNA)。其中特異性小分子TREM-2 siRNA 序列的正義鏈為5’-GCCUCUUGGAAGGAGAAAUTT-3’，反義鏈為5’-AUUUCUCCUUCCAAGAGGCTT-3’。陰性對照siRNA序列的正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCAGGUTT-3’，反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGG AGAATT-3’。在轉染6 h 后，先用PBS(Gibco)洗滌細胞3 次，洗脫殘留在培養基或細胞表面的FAM-siRNA，以減少背景干擾。熒光顯微鏡觀察，成功轉染的細胞可看到FAM 的淡綠色熒光散在分布于細胞質。

2RT-PCR反應檢測TREM-2 mRNA 的表達水平

用Trizol 試劑(Invitrogen)提取總RNA，逆轉錄成cDNA，然后進行PCR擴增。TREM-2上游引物序列為 5’-GTCTTGCCCCTATGACTCCA-3’，下游引物序列為5’-CTGGTAGAGACCCGCATCAT-3’；內參照采用GAPDH， 上游引物序列為5’-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3’，下游引物序列為5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。取RT-PCR 產物5 μL與1 μL 6×loading buffer混合，在2%的瓊脂糖(BIOWEST)凝膠中電泳，然后用凝膠成像系統進行拍照，用ImageJ軟件進行分析。

3Western blot分析相關蛋白表達情況

轉染48 h 后收集各組細胞提取總蛋白，采用BCA 法對蛋白定量后，各組取25 μg蛋白加入上樣緩沖液后混勻，95 ℃水浴變性5 min。80 V濃縮膠，120 V 分離膠電泳分離蛋白質，280 mA 1 h 將蛋白質轉移至PVDF 膜(Millipore)上。5%脫脂奶粉封閉后加入Ⅰ抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜處理3次，于凝膠自動成像系統曝光，用ImageJ軟件進行分析。

4CCK-8 法檢測細胞生長情況

將處在對數生長期的RA-FLS以1.0×107/L 的密度接種于96 孔板，每孔100 μL，細胞融合度達到30%時按以上方法進行轉染。實驗分組同前，轉染24 h后換液， 并于轉染12、24、36、48、60和72 h后， 每孔加入CCK-8 液10 μL， 37 ℃繼續孵育4 h，用分光光度計490 nm 波長處檢測吸光度A值。

5Transwell 細胞遷移實驗

在24孔板中放入 8 μm 的Boyden 小室(Corning)，準備好無血清細胞懸液，計數板計數后在上室中準確加入1.0× 108/L 的細胞懸液100 μL，下室加入含10% 胎牛血清的培養基500 μL 后，置培養箱中遷移24 h。將上室取出，PBS清洗3 遍，加入甲醇(Sigma)200 μL 固定細胞30 min，0.1%結晶紫(Sigma)染色20 min。將結晶紫吸出，用棉簽輕輕擦拭膜內表面，用PBS清洗3遍，放在高倍鏡下(×100)觀察 ，每張膜隨機取8 個視野計數，每個標本重復3 次，取其平均值。

6Transwell 細胞侵襲實驗

在24孔板中放入 8 μm 的Boyden 小室(Corning)并鋪好Matrigel膠(Corning)，準備好細胞懸液，計數板計數后在上室中準確加入1.0× 108/L 的無血清細胞懸液100 μL，下室加入含10% 胎牛血清的培養基500 μL 后，置培養箱中遷移48 h。將上室取出，PBS清洗3 遍，加入甲醇 200 μL 固定細胞30 min，0.1%結晶紫染色20 min。將結晶紫吸出，用棉簽輕輕擦拭膜內表面，用PBS清洗3遍，放在高倍鏡下(×100)觀察 ，每張膜隨機取8 個視野計數，每個標本重復3 次，取其平均值。

7ELISA實驗

轉染24 h 后，取上述各組上清液，用ELISA試劑盒(欣博盛)檢測MMP-2和MMP-9 的濃度，每個標本重復3 次，取其平均值。

8統計學處理

所有數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較使用Bonferroni法。由SPSS 17.0 統計軟件完成，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結果

1轉染siRNAs對RA-FLS TREM-2 mRNA和蛋白表達的影響

RT-PCR結果顯示，TREM-2 siRNA對RA-FLS的mRNA干擾效率為空白對照組的(79.0±3.4)% (P<0.05)，為陰性對照組的(80.3±3.6)% (P<0.05)，空白對照組和陰性對照組之間的TREM-2的mRNA表達未見明顯差異。Western blot檢測結果顯示TREM-2 siRNA組的TREM-2蛋白表達水平明顯降低，沉默效率為空白對照組的(78.6±3.7)% (P<0.05)，為陰性對照組(79.7±7.6)% (P<0.05)，空白對照組和陰性對照組之間的TREM-2蛋白表達差異無統計學意義，見圖1。

Figure 1.TREM-2 expression at mRNA and protein levels in RA-FLS 24 h after transfection detected by RT-PCR and Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTREM-2 siRNA.

圖1RT-PCR和Western blot檢測轉染24 h后RA-FLS中TREM-2 mRNA和蛋白的表達

2沉默TREM-2后對RA-FLS的增殖的影響

轉染TREM-2 siRNA組、空白對照組和陰性對照組3組RA-FLS的細胞活力差異不顯著，見圖2。

Figure 2.CCK-8 analysis of cell growth curves in RA-FLS treated with siRNA. Mean±SD.n=3.

圖2CCK-8法檢測siRNA 轉染后RA-FLS的生長曲線

3沉默TREM-2后對RA-FLS遷移和侵襲的影響

100 倍顯微鏡下觀察，遷移實驗可見TREM-2 siRNA 組的穿膜細胞明顯多于對照，TREM-2 siRNA 組相對于空白對照組和NC-siRNA 組， 遷移細胞數目分別增加了95.68%和81.66%(P<0.05)。侵襲實驗結果顯示TREM-2 siRNA 組的穿膜細胞也明顯多于對照，TREM-2 siRNA 組相對于空白對照組和NC-siRNA 組，侵襲細胞數目分別增加了74.99%和63.05%(P<0.05)，見圖3。

4沉默TREM-2后對RA-FLS分泌MMP-2和MMP-9的影響

ELISA結果顯示,TREM-2 siRNA 組的MMP-2分泌水平相對于空白對照組和NC-siRNA 組，分別增高了70.97%和74.06%(P<0.05)。而TREM-2 siRNA 組MMP-9的分泌水平相對于空白對照組和NC-siRNA 組，差異無統計學意義，見圖4。

Figure 3.Transwell analysis of the migration and invasion of RA-FLS treated with siRNA (crystal violet staining, ×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTREM-2 si RNA.

圖3Transwell檢測siRNA 轉染后RA-FLS的 遷移和侵襲情況

5沉默TREM-2后對RA-FLS中 PI3K/AKT通路的影響

Western blot結果顯示，TREM-2 siRNA 組AKT相對磷酸化水平與空白對照組和NC-siRNA 組比較分別增高了1.33倍和1.22倍(P<0.05)，見圖5。

討論

最新的研究表明，RA的主要病理機制是滑膜增生、炎細胞浸潤、大量血管翳形成最終導致軟骨和骨組織破壞，其中滑膜細胞在RA的發生發展中起到了重要的作用[3]。有研究報道表明FLS 侵襲能力強的RA患者Sharp評分更高且更容易形成影像學可見的骨關節破壞[4]；Lefevre 等[5]研究發現RA-FLS除了在關節腔內發生遷移和侵蝕外，還可以進行長距離遷移以及侵蝕，對正常的關節組織起到了破壞作用。因此，調節RA-FLS遷移和侵襲的激活可能成為一種重要的RA治療策略。MMPs作為一類鋅依賴性肽鏈內切酶，在降解基膜和細胞外基質中發揮著重要作用，其中RA-FLS遷移和侵襲功能與MMP-2和MMP-9的高表達有密切的關系[6], MMP-2和MMP-9 可以作為骨侵蝕的重要指標。此外RA患者血清和滑液中MMP-2和MMP-9顯著增高，其水平和C反應蛋白等病情活動指標有明顯相關性。

Figure 4.ELISA analysis of MMP-2 and MMP-9 released by RA-FLS treated with siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTREM-2 siRNA.

圖4ELISA檢測siRNA 轉染后RA-FLS分泌MMP-2和MMP-9情況

Figure 5.Western blot analysis of PI3K/AKT pathway activation in RA-FLS treated with siRNA for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTREM-2 siRNA.

圖5Western blot檢測轉染48 h后RA-FLS中PI3K/AKT通路活化水平

作為免疫受體超家族中的一員，TREM-2是一種重要的受體膜蛋白，近年的研究表明當受到配體刺激時TREM-2可以與DNA活化蛋白12(DNA activating protein-12，DAP12)偶聯，進一步激活免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)等下游傳遞信號發揮生理學效應[7]。TREM-2在不同細胞中表現出不同的生理功能： TREM-2能夠增強巨噬細胞分化、吞噬病原體以及負性調控炎癥反應[8]；TREM-2能促進樹突狀細胞的成熟、負性調控Toll樣受體介導的生理功能[9]； TREM-2能夠促進破骨細胞的分化、參與骨組織吸收和塑性；最近Ito等[10]研究表明TREM-2能夠促進脂肪細胞肥大從而誘導肥胖。但由于發現較晚且尚未得到公認的天然配體， TREM-2的研究尚處于初步階段。雖然已經證實TREM-2在急性活動期RA-FLS中高表達，但TREM-2是否介導FLS的功能異常尚缺乏相關研究。

短鏈干擾RNA能夠高度特異性降解同源相應的mRNA靶序列，成功阻斷相關基因的表達。以siRNA為基礎的基因沉默技術廣泛應用于功能基因組學研究、基因治療、藥物篩選等領域。本研究首先利用該技術干擾RA-FLS中TREM-2 mRNA及蛋白的表達，RA-FLS的增殖水平并未受到影響。隨后的Transwell遷移和侵襲實驗表明，干擾TREM-2能夠增強RA-FLS的遷移和侵襲能力。之后的ELISA實驗結果證實，沉默TREM-2后RA-FLS分泌MMP-2水平顯著提高，而MMP-9的分泌水平變化不大，說明TREM-2介導的RA-FLS遷移與侵襲能力的改變可能與MMP-2有關，而與MMP-9關系不大，其機制尚不清楚。由于PI3K/AKT通路在包括RA-FLS在內的多種細胞的遷移和侵襲中發揮著重要的作用[11]，且已有的研究表明TREM-2的功能與PI3K/AKT通路有密切關系[12-13]，因此我們推測TREM-2在RA-FLS中很可能也是通過PI3K/AKT通路起作用，我們進一步驗證沉默TREM-2后是否影響RA-FLS中PI3K/AKT通路的活化水平，Western blot實驗結果顯示，與對照組相比特異性干擾組RA-FLS的磷酸化水平顯著提高，表明TREM-2調節了RA-FLS中PI3K/AKT的活化水平，但究竟是否通過經典的TREM-2/DAP12偶聯受體進一步激活下游的ITAM等下游受體，影響了PI3K/AKT通路的活化水平，以及PI3K/AKT是否對TREM-2的轉錄和表達有反饋性的影響，仍需要進一步研究。

總之，TREM-2能夠負性調節RA-FLS的MMP-2分泌水平以及其遷移和侵襲的能力，但并沒有改變其增殖能力，這說明TREM-2在RA的關節局部病變中可能起到了一定的保護作用。這些調控很可能和PI3K/AKT通路有密切的關系。本實驗研究對進一步認識RA關節破壞的機制以及發現RA治療中可能的新靶點具有重要意義。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effects of TREM-2 silencing on migration and invasion abilities of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes

HUANG Sheng-hui1, LI Jian-hua2, ZHANG Wei-qiong3, LIU Gui-wang1, XU Jin-huang3, ZHENG Pei-zhong3, HUANG Jian-rong1, 3

(1DepartmentofOrthopaedics,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510235,China;2DepartmentofPhysiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China;3DepartmentofOrthopaedics,ZengchengPeople’sHospital,Guangzhou511300,China.E-mail:guke16@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of triggering receptor expressed on myeloid cells-2 (TREM-2) silencing on migration and invasion abilities of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (RA-FLS). METHODS: Small interference RNA (siRNA) specifically targeting TREM-2 gene was transfected into RA-FLS. The interference efficiency of TREM-2 siRNA on the production of TREM-2 mRNA and protein was determined by RT-PCR and Western blot. The cell activity was assessed by CCK-8 assay. The migration and invasion abilities of RA-FLS were determined by Transwell assay. The releases of MMP-2 and MMP-9 in RA-FLS were analyzed by ELISA. The influence of TREM-2 on PI3K/AKT signal pathway was measured by Western blot. RESULTS: TREM-2 siRNA significantly decreased the mRNA and protein expression of TREM-2. No difference of cell activity between TREM-2 siRNA group and control group was observed. Transwell migration assay showed that RA-FLS through the Transwell membrane in TREM-2 siRNA group were more than the blank control group and the NC-siRNA group. In Transwell invasion assay, RA-FLS through the Transwell membrane in TREM-2 siRNA group were more than the blank control group and the NC-siRNA group. After transfected with TREM-2 siRNA, the MMP-2 secretion and phosphorylation of AKT increased significantly, while the MMP-9 secretion was not changed. CONCLUSION: TREM-2 may play an important role in the migration and invasion of RA-FLS through regulating the activation of PI3K/AKT signal pathway.

[KEY WORDS]Triggering receptor expressed on myeloid cells-2; Rheumatoid arthritis; Synoviocytes; Cell migration; Cell invasion; PI3K/AKT pathway

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0134- 06

[收稿日期]2015- 07- 24[修回日期] 2015- 09- 10

*[基金項目]廣東省科技基金資助項目(No. 2010B031600184)；廣州市科技和信息化局重點項目(No. 11C31120789)；廣東省自然科學基金資助項目(No. S2012010010629; No. S2013010013768)

通訊作者△Tel： 020-82725271； E-mail： guke16@163.com

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.023