高羊茅FaSGR基因RNAi載體構建

文昭竹，尚 丹，龔梨霞，張志飛，2*（湖南農業大學農學院，長沙4028；2湖南農業大學草業科學研究所，長沙4028）

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高羊茅FaSGR基因RNAi載體構建

文昭竹1，尚 丹1，龔梨霞1，張志飛1，2*
（1湖南農業大學農學院，長沙410128；2湖南農業大學草業科學研究所，長沙410128）

摘 要：本實驗利用Gateway技術構建了Ubiquitin啟動子驅動的高羊茅FaSGR基因的RNAi載體pANDA - B -870，該載體具有潮霉素抗性，適合于單子葉植物遺傳轉化。通過電擊法將pANDA - B -870載體轉入到根癌農桿菌EHA105感受態細胞中，驗證轉化成功。FaSGR基因RNAi載體的構建為進一步探討FaSGR基因功能及SGR滯綠基因在高羊茅遺傳改良中的應用提供了技術支持。

關鍵詞：高羊茅；FaSGR基因；載體構建；RNA干擾；Gateway技術

RNAi（RNA interference）是指一些與靶基因序列同源的小片段干擾RNA，可高效和特異性地使mRNA降解，從而導致內源靶基因的沉默，最終產生相應功能的表型缺失現象［1］。由于RNAi具有特異性、穩定性、高效性和不改變基因組遺傳組成性等優點，RNAi技術在研究基因功能方面具有重要作用［2］。高羊茅（Festuca arundinacea）是禾本科羊茅屬多年生草本植物，在我國廣泛栽培，是目前使用量增長最快的草種，是南方地區綠期最長的冷季型草坪草。高羊茅適應性與抗逆性均較強，但在高溫季節有“休眠”甚至枯黃現象。因此，延長綠色期是高羊茅草種選育的主要目標之一。

滯綠（stay green）是指植物在衰老過程中葉綠素不降解或降解不明顯的現象，其最顯著的特征是植株生育末期葉片保持綠色的時間較長，甚至完全不黃化。滯綠基因SGR大多來源于非功能滯綠突變體，在葉綠素降解過程中調控Psll捕光-葉綠素（LHCⅡ- Chl）復合體的拆卸，是葉綠素分解的啟動因素或總開關。滯綠基因的缺失會使植物在衰老過程中葉綠素的降解受到抑制，且能夠保持較為完整的葉綠體類囊體膜和葉綠素蛋白復合體結構，但其光合能力隨著葉片的衰老而下降［3］。目前滯綠基因的具體作用機制尚不清楚。SGR基因在高等綠色植物中相繼被克隆出來，目前在Genebank上登記的有20個單子葉植物的SGR滯綠序列。

目前，盡管在不少植物種屬中鑒定了滯綠突變體，并對相關基因進行了克隆，研究充分證實滯綠基因SGR在葉綠素降解中發揮重要功能，但有關滯綠基因的分子特征和生物學功能仍有待進一步研究。本實驗利用Gateway技術構建適合于單子葉禾本科植物高羊茅遺傳改良的RNAi載體，為高羊茅遺傳改良提供技術支持，以期培育出高羊茅長綠期的新種質資源。

1　材料與方法

1.1材料

大腸桿菌（Escherichia coli）和農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105菌株，均為湖南農業大學草業科學研究所保存。BP Clonase Mix（Cat.No.11789 - 020）和LR Clonase Mix（Cat.No.11791 -020）購于Life Technology公司，2×SG PCR Master-Mix（#33 -10201）購于SinoGene Scientific，EasyPure Plant DNA Kit購于北京全式金生物技術有限公司（TransGen Biotech），質粒小提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，卡拉霉素（Kanamycin）購于美國Sigma公司，其他化學試劑為國產分析純。

1.2方法

1.2.1引物設計及目的片段的擴增

以高羊茅FaSGR基因CDS（coding region sequence）中心作為靶位點，設計引物Osgl869和Osgl870（表1）。引物由上海生工生物技術有限公司合成。

以高羊茅‘獵狗5號’（Festuca arundinacea cv.Huntdog 5）50 d苗齡離體葉片提取總DNA為模板進行目的基因KOD - PLUS PCR擴增。

PCR反應體系（50 μL）：1.0 μL KOD - PLUS、5.0 μL 10×KOD - PLUS buffer、5.0 μL 2 mM dNTPs、2.0 μL 25 mM MgSO4、1.0 μL gDNA、1.5 μL Osgl869 Piemr（10 M）、1.5 μL Osgl870 Piemr（10 M）、23.0 μL ddH2O。

PCR反應程序：94℃預變性5 min、94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸40 s，35個循環后，于72℃延伸10 min。

PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，確定有特異擴增后，再擴增2個50 μL體系的PCR，并進行PCR產物回收，測序驗證后待用。

PCR產物回收：1）加入4倍體積的Buffer CP到1.5 mL離心管；2）劇烈震蕩，短暫離心；3）把吸附柱放在收集管里；4）把步驟3的混合物轉入吸附柱（每次750 μL，一次轉不完，等離心后，倒掉廢液，再把剩余混合物轉入吸附柱離心）；5）13 000 g離心1 min，棄濾液；6）加入700 μL洗脫液，13 000 g離心1 min，棄濾液；7）加入500 μL洗脫液，13 000 g離心1 min，棄濾液；8）13 000 g離心2 min，甩吸附柱上的乙醇；9）把吸附柱轉到一個新的1.5 mL離心管，在吸附柱中心加入30 μL dd H2O，室溫放置1 min；13 000 g離心2 min，濾液即是回收的DNA。

表1　引物及其基本特征Table 1 Primer sequences and its characters

1.2.2入門克隆的構建

利用Gateway技術構建RNAi表達載體，將PCR克隆得到驗證的目的片段用于BP Clonase Reaction。

BP反應采用10 μL體系：在0.5 mL eppendorf管中，加入回收的目的片段4 μL，pDONR221 2 μL，TE Buffer（pH8）0.2 μL，BP Clonase 2 μL。輕輕搖勻，短暫離心。25℃放置1 h后，4℃過夜。加入1 μL Proteinase K，混勻，37℃連接10 min。此反應產物為含有目的基因的入門載體pENTR -870 -1，用于轉化。

將載體pENTR -870 - 1用凍融法轉化至大腸桿菌感受態細胞中。將轉化細胞均勻涂在含卡那霉素的LB固體培養基上，37℃培養12～16 h長出菌落，挑取單克隆到含有相同卡那霉素的LB液體培養基，再振蕩培養。

以入門載體pENTR - 870 - 1上的引物M13FW/ M13RV進行PCR菌落鑒定，并測序。用試劑盒提取入門載體質粒，測定質粒濃度，用于后續LR反應。

1.2.3pANDA - B -870載體構建

利用LR重組反應將pENTR - 870 - 1入門載體里的目的片段轉移到終載體中。

LR反應采用10 μL體系：在0.5 mL eppendorf管中加入pENTR -870 -1 4 μL，pANDA - B 2 μL，TE Buffer pH8 0.2 μL，LR Clonase 2 μL，25℃放置1 h后，4℃過夜。加入1 μL Proteinase K，混勻，37℃連接10 min。此反應產物為終載體pANDA - B -870 -3。將載體pANDA -B -870 -3用凍融法轉化至大腸桿菌感受態細胞中。將轉化細胞均勻涂在含卡那霉素的LB固體培養基上，37℃培養12～16 h長出菌落，挑取單克隆到含有相同卡那霉素的LB液體培養基，再振蕩培養。進行PCR菌落鑒定和測序。

1.2.4根癌農桿菌表達克隆載體

將測序驗證正確的陽性克隆載體pANDA - B -870 -3，用電擊法轉至農桿菌EHA105，以特異性引物Osgl869和Osgl870進行PCR擴增驗證陽性菌落，同時以未轉化的農桿菌EHA105做陰性對照，以含有pANDA -B -870 -3質粒的大腸桿菌菌液作為陽性對照。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

2　結果與分析

2.1目的片段的獲得與驗證

以FaSGR基因CDS中心作為靶位點，設計引物Osgl869和Osgl870，克隆得到該目的片段，1.0%的瓊脂糖電泳檢測和預期結果一致（圖1），測序長度512 bp。利用CLUSTALW進行FaSGR基因與Gen-Bank下載SGR參考序列（non - yellowing protein，GenBank登錄號319430080），序列比對顯示FaSGR基因與該序列同源性為97%（圖2）。

圖1　FaSGR目的基因的擴增Fig.1 Amplification of FaSGR gene

圖2　FaSGR基因的序列同源性比較分析Fig.2 Comparative analysis of sequence homology of FaSGR gene

2.2入門載體陽性克隆檢測

以FaSGR基因CDS中心作為靶位點，設計引物Osgl869和Osgl870，克隆得到該目的片段后，將目的片段經BP反應后，轉入到pENTR -870 -1入門載體。pENTR - 870 - 1載體轉入大腸桿菌后經培養獲得單克隆，隨機挑選6個單克隆，以入門載體pENTR - 870 - 1上的引物M13FW/ M13RV進行PCR菌落鑒定，所得片段大小接近768 bp（圖3）。選擇第1泳道PCR產物進行測序，測序結果和目的片段比對，同源性為100%，證明入門克隆構建成功。

圖3　入門載體陽性克隆檢測Fig.3 Detection of positive clones’pENTR vector

2.3表達載體的陽性克隆檢測

經LR反應，將pENTR -870 -1入門載體上的SGR目的片段轉移到目的載體上，進而構建Ubiquitin啟動子驅動的pANDA - B -870 -3表達載體，該載體攜帶Hyg抗性（圖4）。

為了驗證目的片段（RNA干涉片段）是否同時正確插入到表達載體的位點上，隨機挑選4個pANDA - B -870克隆進行質粒提取，以Osgl869和Osgl870這對引物對其進行PCR驗證。電泳結果表明，挑取的4個克隆均為陽性（圖5）。進一步測序，與目的片段比對，同源性為100%，證明表達克隆構建成功。

圖4　構建的植物表達載體結構簡圖Fig.4 The structural diagram of constructed plant expression vector

圖5　質粒PCR鑒定Fig.5 Identification of recombinant plasmids with PCR

2.4轉化農桿菌及其驗證

本實驗通過電擊法將含有Ubiquitin啟動子驅動的pANDA - B - 870 - 3載體轉入農桿菌，并以Osgl869和Osgl870這對引物對已轉化的EHA105菌液進行PCR擴增，檢測其是否含有表達載體。以未轉化EHA105菌液做陰性對照，以含有pANDA -B -870 -3質粒的大腸桿菌菌液作為陽性對照。電泳結果表明，大腸桿菌菌液和轉化的EHA105菌液均為陽性克隆，而未轉化EHA105菌液無條帶出現（圖6）。

圖6　大腸桿菌轉化菌株的PCR鑒定Fig.6 Identification of transmitted Agrobacterium tumefacien strains with PCR

3　討論和結論

3.1RNAi載體構建方式

目前，大部分RNAi載體構建采用的是以酶切鏈接為基礎的傳統構建方法［4，5］，需要經過多步克隆和酶切連接才能完成目的基因反向重復插入表達載體，這種構建方法復雜，實驗周期長，不利于大規模基因功能研究，效率較低。Gateway技術是由Invitrogen公司開發的一種通用型克隆方法。Gateway技術利用位點特異性重組，只需將目的基因亞克隆到入門載體上，就可以利用重組技術將目的基因連接到目的載體上［6］。本實驗采用高通量Gateway克隆技術進行高羊茅SGR基因的RNAi載體構建，這種方法只需要采用特定的重組試劑盒，不需要傳統酶切連接過程中限制酶和連接酶的使用，在其他單子葉植物中有成功利用，技術成熟。

3.2植物RNAi載體系列

廣泛應用于植物轉基因實驗的RNAi載體有pHANNIBAL，pHellsgate系列，pEARLYGATE系列和pANDA系列等［7］。張卓等利用pHANNIBAL構建了抗病蟲及除草劑四價植物表達載體［8］；王聰穎等利用pHellsgate - 8構建了黃瓜HPL基因的RNAi表達載體［9］；易金鑫等利用pEARLYGATE103構建了CHS8、IFS2和CHS8 + IFS2表達載體［10］；朱麗等利用pANDA -35HK構建了水稻卷窄葉突變相關基因OsCSLD4的表達載體［11］。其中，pANDA系列載體在單子葉植物中應用較多，可以快速高效構建RNAi載體，直接轉入到葉細胞和原生質體中，還可用于水稻功能基因的瞬態抑制。該載體有助于識別水稻基因的突變體標記，在實驗中干擾效率高達90%［12］。本實驗應用pANDA系列載體構建了高羊茅FaSGR基因的RNAi載體，將FaSGR基因插入pANDA - B中，并成功將其導入農桿菌中。

3.3構建SGR基因載體的啟動子

植物基因的表達受到上游啟動子特征的調控。在利用基因工程技術進行轉基因植物的研究時，高效率地表達目的基因最為關鍵的是啟動子的選擇。花椰菜花葉病毒35S啟動子（CaMV35S）是目前研究較清楚、且在轉基因研究和應用中使用最多的啟動子［13］。目前運用35S啟動子構建SGR基因RNAi載體的物種包括雪里蕻［14］、紫花苜蓿［15］和大豆［16］等，并獲得了轉基因植株。同時，在對擬南芥滯綠基因AtNYE1研究時發現，AtNYE1全長啟動子（1882 bp）驅動Gus的表達呈組成型特征，且具有與35S啟動子類似或更強的驅動下游基因表達的功能［16］，該啟動子在今后轉基因的研究和應用中可能具有潛在的價值。

本實驗采用的啟動子是Ubiquitin（Maize ubiquitin promoter）啟動子。Ubiquitin啟動子來自于玉米多聚泛素蛋白基因（maize polyubi gene），是一個在單子葉植物中有較強表達的啟動子。Ubiquitin啟動子與CAT編碼區的融合基因（Ubipro CAT）在玉米原生質體中的表達強度是35S啟動子與CAT編碼區的融合基因（35Spro CAT）表達強度的10倍［17］。雙子葉植物中一般采用35S啟動子，而在單子葉植物中，Ubiquitin是一個具有較強表達活性的啟動子［18］。目前還沒有發現這類啟動子在SGR基因上有所應用。本實驗結果表明，高羊茅內源SGR基因的RNAi載體在農桿菌中可正常表達。后續實驗將利用農桿菌介導技術將pANDA - B - 870 - 3載體轉入至高羊茅體內表達，產生的dsRNA在DICER酶作用下形成siRNA，引起具有SGR相同序列的mRNA發生降解，從而沉默SGR基因的表達，引導植物個體發生形態學或生理變異。

本實驗成功構建了FaSGR內源基因的RNAi植物表達載體pANDA - B -870 -3，為高羊茅下一步的遺傳轉化，選育長綠期的新高羊茅種質資源奠定了技術基礎。

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Construction of RNAi Expression Vector for FaSGR Gene of Tall Fescue

WEN Zhaozhu1，SHANG Dan1，GONG Lixia1，ZHANG Zhifei1，2*
（1 College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Grassland Science Department，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

Abstract：In this study，RNAi vector pANDA-B-870 with hygromycin resistance for tall fescue FaSGR gene drove by Ubiquitin promoter was constructed using the Gateway technology，which was suitable for genetic transformation of monocots.The pANDA-B-870 vector was transformed into Agrobacterium tumefaciens EHA105 competent cells by electroporation method，the transformation was confirmed by PCR.The construction of RNAi vector for FaSGR gene provided technical support for further study of FaSGR gene’s function and the application of SGR of tall fescue in genetic improvement.

Keywords：tall fescue；FaSGR gene；vector construction；RNA interference；Gateway technology

中圖分類號：Q782

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5280（2016）03-0241-06

DOI：10.16848/ j.cnki.issn.1001-5280.2016.03.02

收稿日期：2016- 01- 13

作者簡介：文昭竹（1990 -），女，碩士研究生，Email：ningjiuzhubeibei@163.com。*通信作者：張志飛，副教授，Email：zzf0917@ aliyun.com。

基金項目：中國博士后科學基金項目（2014M560643）；湖南省教育廳優秀青年基金（14B083）；湖南農業大學研究生創新項目。