天然活性分子isatin經(jīng)p53介導(dǎo)的線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺癌細胞MCF-7凋亡

宋金蓮，馬中良，遲曉偉，陳艷萍，侯　琳

(1. 青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院檢驗科，山東 青島　266034；2. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科,山東 青島　266000；3. 即墨市婦幼保健院檢驗科,山東 即墨　266012；4. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,山東 青島　266000)

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天然活性分子isatin經(jīng)p53介導(dǎo)的線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺癌細胞MCF-7凋亡

宋金蓮1，馬中良2，遲曉偉3，陳艷萍1，侯琳4

(1. 青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院檢驗科，山東 青島266034；2. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科,山東 青島266000；3. 即墨市婦幼保健院檢驗科,山東 即墨266012；4. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,山東 青島266000)

摘要:目的探討吲哚醌(isatin)對乳腺癌細胞MCF-7的抗腫瘤作用及其具體的調(diào)控機制。方法不同濃度isatin(0、50、100、200 μmol·L-1)作用于乳腺癌細胞48 h后，利用細胞熒光染色、RT-PCR、Western blot及流式細胞術(shù)等方法檢測isatin的促凋亡作用。結(jié)果不同濃度isatin處理MCF-7細胞48 h，熒光顯微鏡觀察到細胞出現(xiàn)核染色質(zhì)聚集、細胞體積縮小及DNA斷裂等典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。RT-PCR和Western blot結(jié)果證實，隨著isatin濃度的不斷增加，p53、Bax mRNA和蛋白表達量也逐漸增加，而Bcl-2 mRNA及蛋白表達下降；流式細胞儀結(jié)果提示不同藥物濃度作用的細胞膜電位出現(xiàn)不同程度的下降，caspase-9被激活。Western blot結(jié)果顯示isatin處理組細胞胞質(zhì)細胞色素C含量明顯增加，相反線粒體中細胞色素C含量相應(yīng)降低。結(jié)論isatin具有明顯誘導(dǎo)乳腺癌細胞MCF-7凋亡的作用，其可能的作用機制是經(jīng)p53的線粒體凋亡通路被激活。

關(guān)鍵詞：吲哚醌; 乳腺癌細胞; 凋亡; p53; Bcl-2; Bax; 線粒體膜電位

隨著長春堿、長春新堿等新型抗腫瘤藥物在臨床上的應(yīng)用，天然吲哚類化合物的抗腫瘤作用日益引起人們的關(guān)注，因其毒性低而迅速成為抗癌藥物研究的熱點。isatin，又名靛紅，系天然存在于自然界的吲哚類化合物[1]，是我國獨創(chuàng)I類天然抗癌新藥靛玉紅的單體結(jié)構(gòu)，存在于人體及多種生物體中，也存在于大青葉及清熱解毒抗癌中藥青黛中，具有廣泛的生物學(xué)活性[2]和生物學(xué)效應(yīng)[3]。1999年，Yue等[4]首次報告了isatin有抗氧自由基作用，能夠保護正常神經(jīng)細胞，并可減輕H2O2導(dǎo)致的多巴胺能細胞損傷。在之后的研究中，Cane等[5]報道用isatin和5-羥基吲哚處理N1E-115神經(jīng)母瘤細胞系，可抑制ERK-2的磷酸化，從而抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。isatin的這種既能抗腫瘤，又可通過抗氧自由基保護正常細胞的特性是目前大多數(shù)抗腫瘤藥所不具有的重要特征。isatin分子量小(Mr147)，能口服給藥，具有靶向抑制腫瘤細胞增殖并避免損傷正常細胞的優(yōu)點，毒副作用低(已完成急性毒性實驗和6個月的長期毒性實驗，未發(fā)現(xiàn)isatin有明顯毒性)，故認為isatin是很有開發(fā)價值的天然的小分子化合物類藥物。

研究表明，isatin及其衍生物具有抗腫瘤活性，但這些研究大多限于現(xiàn)象描述，對抗腫瘤活性機制的研究報道較少，如isatin能明顯抑制人類急性骨髓性白血病(HL60)腫瘤細胞系的增殖。進一步對isatin進行研究評估，認為isatin既可以預(yù)防氧自由基誘發(fā)腫瘤，又可以直接誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[6]；在體外用isatin處理中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)和人宮頸癌細胞(HeLa)24 h后，能夠抑制細胞增殖、促進細胞凋亡[7]；課題組前期發(fā)表的文章也證實isatin對神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y有明顯的抑制作用[8]。迄今為止，有關(guān)isatin抗乳腺癌的研究較少，劉娜等[9]的研究認為isatin 對DMBA 誘發(fā)的大鼠乳腺癌有預(yù)防作用。我們前期實驗結(jié)果顯示：isatin能明顯誘導(dǎo)乳腺癌細胞MCF-7凋亡，并抑制其增殖；同時使Bcl-2蛋白表達下降，Bax蛋白表達增加[10]。因此，本實驗的目的是在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步證實isatin對MCF-7細胞的促凋亡作用，探究其可能的調(diào)控機制。

1材料與方法

1.1主要試劑

isatin購自上海元吉化工有限公司，使用少量DMSO將其溶解，母液濃度配制為5 mmol·L-1, 于4 ℃保存，備用。實驗時用無血清培養(yǎng)基稀釋至實驗濃度(0、50、100、200 μmol·L-1)(DMSO濃度控制在<1 %); p53、Bcl-2、Bax和β-actin的抗體購自New England Biolabs公司; TRIzol RNA isolation kit購自Life Technologies公司；ECL發(fā)光試劑購于Amersham Biosciences公司; Hoechst33258、碘化丙啶(PI)染料購自美國Sigma公司。

1.2細胞株及其培養(yǎng)

乳腺癌細胞系MCF-7來自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細胞中心。細胞用H-DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司產(chǎn)品)，含15%胎牛血清(杭州四季青生物公司)，5% CO2、37 ℃飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3Hoechst 33258熒光染色檢測細胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變

對數(shù)生長期的細胞，調(diào)節(jié)細胞密度為每毫升5×104，接種于6孔板，并放入包被了多聚賴氨酸的蓋玻片。37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h后更換新培養(yǎng)液，同時加入不同濃度isatin，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，用甲醇 ∶冰醋酸(3 ∶1)于4 ℃固定5 min, PBS漂洗2遍，終濃度為5 mg·L-1Hoechst 33258避光染色10 min，PBS清洗后封片，在熒光顯微鏡下觀察，實驗重復(fù)3次。

1.4RT-PCR測定p53 mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的相對表達水平

各實驗組的細胞收集于1.5 mL的Eppendorf管中，PBS洗滌3次后，利用TRIzol RNA isolation kit提取RNA，按試劑盒說明進行RT-PCR。p53的引物序列為：5′-CTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCC-3′，5′-CTCATTCAGCT CTCGGAACATCTCGAAGCG-3′，370 bp；內(nèi)參照GAPDH的引物序列為：5′-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3′，5′-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3′，512 bp。Bcl-2的引物序列為：5′-GGAGGATTGTGGCCTTCTTTG-3′，5′-GGTGCCGGTTCAGGTACTCA-3′，120 bp；Bax的引物序列為：5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′，5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′，257 bp；內(nèi)參照GAPDH的引物序列為：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′, 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，452 bp。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，對照標準分子量檢測擴增結(jié)果。上海培清凝膠紫外攝像分析系統(tǒng)照相后對條帶進行光密度(A)掃描，分別檢測各組PCR產(chǎn)物與其對應(yīng)的內(nèi)參A值，實驗重復(fù)3次。

1.5Western blot檢測Bcl-2、Bax、p53 蛋白表達

4 ℃條件下收集不同處理組細胞，PBS 洗滌2次后，每管加入150 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min后，收集上清液，考馬斯亮藍法確定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品與樣品Buffer按4 ∶1的比例混勻，煮沸3 min。每孔加樣40 μg，12% SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品。室溫恒流(40 mA)1.5 h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液(5%脫脂奶粉，溶于TBS)室溫封閉2 h后，將膜與含一抗稀釋液(1%脫脂奶粉，溶于TBS中)的一抗(兔抗人β-actin 抗體1 ∶1 000，兔抗人p53抗體1 ∶1 000，兔抗人Bcl-2 抗體1 ∶1 000，兔抗人Bax 抗體1 ∶1 000)封于塑膠袋中，4 ℃過夜，再室溫孵育2 h，TBS洗15 min×3次，將膜與含有第二抗體的稀釋液(1%脫脂奶粉，溶于TBS中) 室溫孵育3 h，TBST洗15 min×3次，將膜包在保鮮膜中，加入ECL發(fā)光試劑，在暗室曝光，顯影，定影。X光底片經(jīng)掃描后，永久保存并對結(jié)果進行光密度分析。實驗重復(fù)3次。

1.6流式細胞儀檢測細胞膜電位

收集對照組及不同濃度isatin處理組細胞，PBS洗滌2次后，與含5 μmol·L-1Rhodamine 123的PBS室溫避光孵育30 min，PBS清洗2次，離心棄PBS，PBS 重懸, 用流式細胞儀進行檢測(CantoⅡ, Becton Dickinson, USA)。實驗重復(fù)3 次。

1.7Western blot分別檢測胞質(zhì)和線粒體Cyto-chrome C蛋白表達

收集對照組及不同濃度isatin處理組細胞，冰冷的PBS洗兩次，將細胞重懸于Buffer A(250 mmol·L-1sucrose, 1 mmol·L-1EDTA, 50 mmol·L-1Tris-HCl, 1 mmol·L-1DTT, 1 mmol·L-1PMSF, 1 mmol·L-1Benzamidine, 280 u·L-1apotinin, 50 mg·L-1leupeptin, and 7 mg·L-1pepstainA, pH 7.4)中，轉(zhuǎn)移至1 mL玻璃勻漿器，放至冰浴中，上下抽拉30次后離心(1 000g×10 min，4 ℃)，棄沉淀，將上清移至一新EP管中,再離心(10 000g×20 min，4 ℃)，所得上清和沉淀分別為胞質(zhì)、線粒體粗品。為排除溶酶體和過氧化物體污染，需做進一步處理，將胞質(zhì)部分轉(zhuǎn)移至超離管中，離心(100 000×g,1 h，4 ℃)，所得上清為純化的胞質(zhì)蛋白；將線粒體沉淀部分重懸于Buffer B(250 mmol·L-1sucrose, 1 mmol·L-1EGTA, 10 mmol·L-1Tris-HCl, 1 mmol·L-1DTT, 1 mmol·L-1PMSF, 1 mmol·L-1Benzamidine, 280 u·L-1apotinin, 50 mg·L-1leupeptin, and 7 mg·L-1pepstain A, pH 7.4)中，離心(10 000×g， 10 min，4℃)，重復(fù)3次，所得線粒體沉淀于細胞裂解液中裂解(10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.5；150 mmol·L-1NaCl；5 mmol·L-1EDTA；1% Triton X-100；1%去氧膽酸鈉；1% SDS；1 mmol·L-1PMSF；280 u·L-1Aprotinin；50 mg·L-1leupeptin；7 mg·L-1Pepstatin A),分裝以上蛋白溶液備用。Western blot步驟同“1.5”中所述。

1.8流式細胞儀檢測caspase-9的活化

收集對照組及不同濃度isatin處理組細胞，PBS清洗2次后，與FITC-LEHD-FMK(a specific inhibitor of caspase-9)(eBioscience, 1 ∶300)室溫避光孵育30 min，PBS清洗2次，離心棄PBS，再用PBS 重懸, 流式細胞儀進行檢測(CantoⅡ, Becton Dickinson, USA)。實驗重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理

2結(jié)果

2.1isatin處理后細胞形態(tài)學(xué)變化

如Fig 1所示，MCF-7細胞與不同濃度isatin共同孵育48 h后，在熒光顯微鏡下觀察到細胞胞體縮小、胞質(zhì)發(fā)生濃縮、核染色質(zhì)聚集，并有凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。而對照組細胞核呈現(xiàn)均勻的藍色熒光。

Fig 1　Apoptosis induction after 48h treatment with isatin in MCF-7 cells

Morphology of MCF-7 cells observed under fluorescence microscope(Hoechst33258×400). DNA fragment and chromatin condensation were observed in isatin-treated cells(B： 50 μmol·L-1isatin, C： 100 μmol·L-1isatin, D： 200 μmol·L-1isatin), but few in untreated cells(A： Control).

2.2p53、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白的相對表達水平

與對照組細胞相比，經(jīng)50、 100、 200 μmol·L-1isatin處理的各組MCF-7細胞，隨著isatin濃度的不斷增加，p53 mRNA、蛋白表達量相應(yīng)增加，差異具有顯著性(P<0.05)；對照組細胞表達一定量的Bcl-2 mRNA、蛋白，不同濃度isatin處理組細胞Bcl-2 mRNA、蛋白表達量均出現(xiàn)不同程度下降(P<0.05)，而Bax mRNA、蛋白在各組之間的差異沒有明顯改變，Bcl-2/Bax 逐漸下降(P<0.05), 見Fig 2、3。

Fig 2　RT-PCR of p53(Ap53/AGAPDH),Bcl-2(ABcl-2/AGAPDH) and Bax(ABax/AGAPDH) mRNA relative expression in MCF-7 cells after 48 h of culture with isatin

2.3細胞膜電位的變化

細胞膜電位下降是細胞凋亡的早期形態(tài)學(xué)特征，利用特征性探針Rhodamine 123與各組細胞孵育，細胞結(jié)合熒光染料的強度與線粒體膜的極化狀態(tài)直接相關(guān)。流式細胞儀檢測的結(jié)果是不同濃度(50、100、200 μmol·L-1)isatin處理組細胞線粒體膜電位分別為(77.00±2.27)%、(71.47±2.12)%、 (63.67±4.40)%，明顯低于對照組細胞的電位(88.40±6.15)%(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 3　Expression of p53, Bcl-2 and Bax proteins in MCF-7 cells after 48 h of treatment with isatin detected by Western blot

2.4Cytochrome C的釋放情況

Cytochrome C的釋放是凋亡級聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵的一步，因為它可以激活下游的caspase，如Fig 5結(jié)果所示與對照組細胞相比，經(jīng)不同濃度(50、100、200 μmol·L-1)isatin處理的MCF-7細胞胞質(zhì)Cytochrome C含量明顯增加，相反線粒體Cytochrome C表達明顯下降(P<0.05)。

2.5caspase-9的活

眾所周知像Cytochrome C這類的促凋亡蛋白釋放后，會激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，本實驗用流式細胞儀檢測與不同濃度isatin(50、100、200 μmol·L-1) 孵育48 h后的MCF-7細胞中caspase-9的活化情況，如Fig 6所示，相比較對照組細胞的(13.07±2.81)%，isatin處理的各組細胞活化caspase-9蛋白水平均有不同程度的增加[(21.17±2.63)%、(31.77±3.56)%、(38.73±4.30%)]，差異具有顯著性(P<0.05)。

Fig 4　Isatin-induced Dym depolarization in MCF-7 cells(representative experiment).

Cells treated with isatin for 48 h were stained with rhodamine 123 for 30 min and then measured by flow cytometry (representative experiment).

Fig 5　Expression of cytochrome C proteins in MCF-7 cells after 48 h of treatment with isatin detected by western blot

Fig 6　Effect of isatin on caspase-9 activity in MCF-7 Cells(representative experiment)

Cells treated with isatin for 48 h were incubated with FITC-LEHD-FMK for 30 min and then measured by flow cytometry (representative experiment).

3討論

乳腺癌是目前女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，是導(dǎo)致女性死亡的主要原因之一[11]。到目前為止，盡管系統(tǒng)的化療方案已常規(guī)用于臨床治療，但化療耐藥及化療所帶來的副作用仍是困擾乳腺癌治療的嚴峻問題[12]。而天然化合物毒副作用小，具有靶向殺傷腫瘤細胞的特點，是目前抗腫瘤研究的熱點。isatin作為一種天然活性物質(zhì)，已經(jīng)被證實具有明顯的抗腫瘤作用。課題組前期的研究認為isatin能明顯誘導(dǎo)乳腺癌細胞MCF-7凋亡，同時明顯降低Bcl-2/Bax比值[10]，但對具體的調(diào)控機制未做進一步研究。isatin是如何調(diào)控Bcl-2/Bax的，Bcl-2/Bax又是通過什么樣的途徑誘發(fā)凋亡的？腫瘤的生成是細胞增殖和凋亡調(diào)控失衡的結(jié)果，通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡來殺死腫瘤細胞已成為一種有效的腫瘤治療途徑。因此抑制腫瘤細胞生長，可以通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡來完成。本研究通過細胞熒光染色進一步證實不同濃度的isatin能明顯誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡，熒光顯微鏡下觀察到isatin處理組細胞發(fā)生典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變：胞體縮小、胞質(zhì)濃縮、核染色質(zhì)聚集，并有DNA碎片。而對照組細胞無變化。

作為腫瘤抑制基因，p53主要通過激活其下游靶基因進一步控制細胞的生長與死亡[13]，其次是在細胞周期的G期監(jiān)視DNA的完整性。在依賴p53蛋白的凋亡中，p53蛋白能特異地抑制Bcl-2蛋白的表達，但對Bax蛋白的表達有明顯促進作用，在這類細胞中p53蛋白的積累和活化引起了線粒體膜的去極化，進而引發(fā)細胞凋亡。有研究表明，人乳腺癌細胞MCF-7表達wild-p53蛋白，且通過一些抗腫瘤藥物的誘導(dǎo)，能明顯增強其表達量，進而誘導(dǎo)細胞凋亡[14,15]。課題組前期的研究認為，Bcl-2家族蛋白中Bcl-2、Bax蛋白在isatin的抗腫瘤作用中不可或缺。isatin作用后可以導(dǎo)致Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達增加。因此推測p53可能是isatin作用Bcl-2的上游靶分子之一。實驗結(jié)果表明isatin作用后，p53mRNA及蛋白表達均明顯增加。

眾所周知，Bcl-2家族蛋白存在于線粒體膜上，與細胞凋亡密切相關(guān)。該家族蛋白的表達情況可能會影響到細胞膜電位的變化。本研究利用流式細胞儀檢測不同濃度isatin處理組細胞膜電位，結(jié)果顯示除對照組細胞外，其他各組細胞膜電位均出現(xiàn)不同程度下降。線粒體膜電位改變是細胞凋亡發(fā)生的早期特征，在膜電位發(fā)生改變后通常會釋放一些促凋亡蛋白，像Cytochrome C，smac等。Western blot的結(jié)果顯示isatin作用后線粒體Cytochrome C表達下降，而胞質(zhì)中濃度增加。Cytochrome C等促凋亡蛋白會進一步作用，激活下游的caspase家族，引發(fā)凋亡。依照上述的結(jié)果，我們推測caspase家族中的caspase-9會被順序激活，因此我們利用流式細胞儀檢測了不同組別細胞caspase-9的活化情況，結(jié)果與預(yù)想的一致，經(jīng)isatin作用后，活化的caspase-9表達增加。綜上所述，有充分的理由認為isatin誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞凋亡可能是通過p53介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑。

(致謝:本實驗是在青島市婦女兒童醫(yī)院檢驗科及青島大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室完成。感謝馬中良、遲曉偉及陳艷萍在實驗過程中的協(xié)助)。

參考文獻:

[1]Ray D, Paul B K, Guchhait N. Differential binding modes of anti-cancer, anti-HIV drugs belonging to isatin family with a model transport protein: a joint refinement from spectroscopic and molecular modeling approaches[J].JPhotochemPhotobiolB, 2013, 127:18-27.

[2]Pakravan P, Kashanian S, Khodaei M M, Harding F J. Biochemical and pharmacological characterization of isatin and its derivatives: from structure to activity[J].PharmacolRep, 2013,65(2): 313-35.

[3]洪銳, 孫圓圓, 金景, 等. 2,3-吲哚醌對大鼠離體胸主動脈舒縮功能的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2014, 30(8): 1179-80.

[3]Hong R, Sun Y Y, Jin J, et al. Effect of isatin on contraction and relaxation function of isolated rat thoracic aorta[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(8): 1179-80.

[4]Yue W, Abe Y. Isatin, an endogenous MAO-B inhibitor, antagonizes the neurotoxic action of MPTP on central dopaminergic system in C57BL/6J mice[J].JpnJPharmacol,1999,79: 252.

[5]Cane A, Tournaire M C, Barritault D, Crumeyrolle-Arias M. The endogenous oxindoles 5-hydroxyoxindole and isatin are antiproliferative and proapoptotic[J].BiochemBiophysResCommun,2000,276(1): 379-84.

[6]Premanathan M, Radhakrishnan S, Kulangiappar K, et al. Antioxidant and anticancer activities of isatin(1H-indole-2,3-dione), isolated from the flowers of Couroupita guianensis Aubl[J].IndianJMedRes,2012,136(5): 822-6.

[7]C?ndido-Bacani Pde M, Mori M P, Calvo T R, et al.Invitroassessment of the cytotoxic, apoptotic, and mutagenic potentials of isatin[J].JToxicolEnvironHealthA, 2013, 76(6): 354-62.

[8]Song J, Hou L, Ju C, et al. Isatin inhibits proliferation and induces apoptosis of SH-SY5Y neuroblastoma cellsinvitroandinvivo[J].EurJPharmacol, 2013, 702(1-3): 235-41.

[9]劉娜, 鞠傳霞, 岳旺. 2, 3-吲哚醌對二甲基苯蒽誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌的預(yù)防作用[J]. 中國藥理學(xué)通報,2010,26(10): 1353-6.

[9]Liu N, JU C X, Yue W. Chemopreventive effect of isatin against DMBA-induced mammary carcinoma in rats[J].ChinPharmacolBull, 2010, 26(10): 1353-6.

[10]王艷麗, 侯琳, 宋金蓮, 等. 2,3-吲哚醌對MCF-7和HT-29細胞株的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展, 2009, 9(5): 824-8.

[10]Wang Y L, Hou L, Song J L, et al. Effects of 2, 3-dioxoindolineon anti-proliferation and apoptosis on MCF-7 and HT-29 cell lines[J].ProgModBiomed, 2009, 9(5): 824-8.

[11]Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics[J].CACancerJClin,2012,62(1): 10-29.

[12]Smith N Z. Treating metastatic breast cancer with systemic chemotherapies: current trends and future perspectives[J].ClinJOncolNurs,2012,16(E33-43): 1-22.

[13]Vousden K H, Lane D P. p53 in health and disease[J].NatRevMolCellBiol,2007,8(4): 275-83.

[14]Suganyadevi P, Saravanakumar K M, Mohandas S. The antiproliferative activity of 3-deoxyanthocyanins extracted from red sorghum 53(Sorghum bicolor) bran through P-dependent and Bcl-2 gene expression in breast cancer cell line[J].LifeSci,2013,92(6-7): 379-82.

[15]Cui Q, Yu J H, Wu J N, et al. P53-mediated cell cycle arrest and apoptosis through a caspase-3-independent, but caspase-9-dependent pathway in oridonin-treated MCF-7 human breast cancer cells[J].ActaPharmacolSin,2007, 28(7): 1057-66.

The endogenous oxindole isatin induces apoptosis of MCF-7 breast cancer cells through a p53-mediated mitochondrial pathway

SONG Jin-lian1, MA Zhong-liang2, CHI Xiao-wei3, CHEN Yan-ping1, HOU Lin4

(1.DeptofLaboratory,theAffiliatedWomenandChildren’sHospitalofQingdaoUniversity,QingdaoShandong266034,China;2.DeptofBreastSurgery,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,QingdaoShandong266000,China;3.DeptofLaboratory,WomenandChildren′sCareCenterofJimo,JimoShandong266012,China;4.DeptofBiochemistry,MedicalCollege,QingdaoUniversity,QingdaoShandong266021,China)

Abstract:AimTo investigate the inducement effect of isatin on apoptosis of breast cancer cell line MCF-7, and explore its detailed mechanism. MethodsMCF-7 cell lines were exposed to isatin at different concentrations(0, 50, 100, 200 μmol·L-1) for 48 h. Apoptotic features were demonstrated by nuclei staining with Hoechst 33258. Bcl-2, Bax and p53 mRNA were analyzed by RT-PCR. Caspase-9 activation and mitochondrial depolarization were assayed by flow cytometry. Bcl-2, Bax, p53 and cytochrome c proteins were analyzed by Western blot.ResultsIsatin induces apoptosis of MCF-7 cells. Furthermore, Bcl-2 expression was decreased and the ratio of Bcl-2 to Bax was significantly decreased by isatin. While, p53 expression relatively decreased. The mitochondrial transmembrane potential was markedly reduced and the release of cytochrome c into the cytosol was increased after treatment with isatin. Simultaneously, caspase-9 was activated.ConclusionsIsatin significantly induced the apoptosis of MCF-7 cellsinvitro. These results strongly suggest that the p53 dependent mitochondrial pathway is involved in apoptosis.

Key words:isatin; human breast cancer cell; apoptosis; p53; Bcl-2; Bax; mitochondrial membrane potential

收稿日期:2016-01-02,修回日期:2016-03-03

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(No 81472542)；青島市衛(wèi)生局項目(No 2014WJZD135 )；青島市科技局項目(No 13-1-3-67-nsh)

作者簡介：宋金蓮(1981-)，女，博士生，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)，E-mail:songjinlian@126.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.008

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0773-06

中國圖書分類號：R329.25；R737.9；R979.1

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.016.html

◇論著◇

侯琳(1962-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)，通訊作者，E-mail:qdhoulin@ yahoo. com