高血糖通過抑制線粒體自噬加重大鼠腦缺血/再灌注損傷

左　瑋,梅　丹

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院，北京　100730)

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高血糖通過抑制線粒體自噬加重大鼠腦缺血/再灌注損傷

左瑋,梅丹

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院，北京100730)

摘要：目的探討急性高血糖對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能損傷的作用及機制。方法按照隨機數(shù)字法，將80只♂ SD大鼠分為假手術(shù)組、腦缺血模型組(正常血糖NG)、腦缺血合并高血糖1組(HG1)、腦缺血合并高血糖2組(HG2)。線栓法建立大鼠局灶性大腦中動脈閉塞(MCAO)模型，缺血期間腹腔注射50%葡萄糖溶液誘導(dǎo)急性高血糖。MCAO 24 h后，采用Ludmila Belayev 12分法對大鼠的神經(jīng)功能進行評分；采用TTC法對大鼠腦梗死體積和水腫程度進行評估；采用免疫熒光雙標和電鏡的方法對線粒體自噬的現(xiàn)象進行觀察；進一步通過Western blot的方法對腦組織中自噬相關(guān)蛋白(LC3和Beclin-1)，以及線粒體介導(dǎo)的凋亡相關(guān)因子(Cyt-C，AIF，caspase-9和caspase-3)的表達情況進行檢測。結(jié)果正常血糖組、高血糖1組和高血糖2組的血糖分別控制在4、10和20 mmol·L-1的水平。與模型組相比，高血糖1組大鼠的神經(jīng)功能評分和腦梗死體積差異沒有顯著性(P>0.05)，而高血糖2組大鼠的神經(jīng)功能損傷、梗死體積和水腫程度都有明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。缺血/再灌注損傷3 d后取材進行檢測，較模型組相比，高血糖2組大鼠的線粒體自噬水平減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，受損線粒體增加，伴隨Cyt-C和AIF釋放以及caspase-8/caspase-3活化的增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論輕度急性期高血糖不加重腦梗死損傷。重度急性期高血糖則可能是通過抑制受損線粒體的自噬性清除，導(dǎo)致受損線粒體堆積，進而擴大線粒體介導(dǎo)的下游的凋亡損傷，加重了大鼠的腦梗死損傷程度。

關(guān)鍵詞：腦梗死；高血糖；線粒體自噬；TTC染色；凋亡；神經(jīng)功能；線粒體

腦血管疾病是危害人類健康的三大疾病之一，其中缺血性腦血管疾病占80%，并隨著人口老齡化的增加，發(fā)病率呈明顯上升的趨勢。流行病學(xué)及臨床的研究數(shù)據(jù)顯示，50%左右的急性型缺血性腦卒中患者發(fā)病后伴隨非糖尿病性的高血糖的現(xiàn)象，且高血糖可以加重缺血/再灌注后的腦損傷程度[1-2]。應(yīng)用胰島素糾正卒中伴隨的高血糖狀態(tài)是目前公認的最有前景的治療方案。大量的臨床和動物實驗數(shù)據(jù)都證實，胰島素對治療卒中合并高血糖具有十分積極的作用，可以降低高血糖帶來的危害，但作用機制仍不十分明確[3-4]。此外，血糖調(diào)控普遍存在的問題是，嚴格降糖治療的效果仍缺乏循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)，胰島素的治療會伴隨較大的低血糖風(fēng)險，最佳的血糖水平目前還存在爭議，卒中患者血糖實時監(jiān)控的實施存在困難。由此可見，進一步深入了解高血糖加重缺血損傷的機制，尋找潛在的治療靶點具有更為重要的意義。

因此，本實驗通過線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞模型，腹腔注射不同劑量的50%葡萄糖誘導(dǎo)MCAO大鼠的急性高血糖狀態(tài)(輕度高血糖和重度高血糖)，模擬臨床上非糖尿病患者的急性高血糖狀態(tài)。觀察不同血糖狀態(tài)對MCAO大鼠的影響，并對其作用機制進行探討，以期為臨床卒中合并急性高血糖的治療提供新的思路和依據(jù)。

1材料

1.1實驗動物

SPF級健康♂ SD大鼠，體質(zhì)量260～280 g。由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(合格證編號：SCXK京2009-0007)。

1.2藥品與試劑

葡萄糖和2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司)。Optium血糖儀和血糖試紙(雅培公司，美國)。山羊抗兔-LC3(1 ∶1 000)、山羊抗兔-Beclin-1(1 ∶1 000)和山羊抗小鼠-COX4(Sigma公司，美國)。山羊抗兔cyt-C(1 ∶1 000)、山羊抗兔AIF(1 ∶1 000)、山羊抗兔caspase-3和山羊抗兔capase-9(1 ∶1 000)(Santa cruz公司，美國)。辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗和BCA蛋白測定試劑盒(中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京)。PVDF膜(Millipore公司，美國)。

2方法

2.1動物及分組

將動物按照隨機數(shù)字法分為假手術(shù)組、模型組(N，4 mmol·L-1)、腦缺血合并高血糖1組(HG1，10 mmol·L-1)和腦缺血合并高血糖2組(HG2，20 mmol·L-1)，每組20只。手術(shù)前動物禁食15 h，自由進水，室溫保持25℃。

2.2MCAO模型及合并急性高血糖模型的建立

參照Longa法[5]略加改進，建立線栓法大鼠大腦中動脈閉塞模型(MCAO)。大鼠在5%恩氟烷、30%氧氣/70%氮氣下誘導(dǎo)麻醉，約5 min后將大鼠尾部提起無任何張力表示誘導(dǎo)成功。大鼠仰臥固定在手術(shù)臺，在2%恩氟烷、30%氧氣/70%氮氣下維持麻醉。碘伏對頸部皮膚進行消毒后，于頸部正中作2 cm左右的切口，暴露氣管和頸動脈三角區(qū)，用顯微鑷分離肌肉、筋膜、頸總動脈(common carotid artery, CCA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery, ICA)和頸外動脈(external carotid artery, ECA)。用動脈夾暫時夾閉CCA近心端和ICA，并在CCA遠心端備線勿扎緊。電凝結(jié)扎ECA，剪斷后將其拉下與ICA成一條直線。在距CCA分叉遠端約2 mm處用眼科剪作細小斜向切口，將肝素浸泡過的線栓(直徑0.26 mm)插入，收緊備線，松開ICA上的動脈夾，用鑷子將栓線延ICA緩緩?fù)七M顱內(nèi)大腦中動脈，有阻力時(CCA分叉處開始，插入深度約18 mm)停止(避免扎破血管造成蛛網(wǎng)膜下腔出血)，提示線栓到達大腦中動脈起始處，阻斷MCA供血相關(guān)區(qū)血流，將備線扎緊并記錄栓塞開始時間。縫合肌肉組織和皮膚切口，栓線尾部留于體外。栓塞90 min后，緩慢退出線栓至CCA切口處，恢復(fù)MCA區(qū)血流供應(yīng)。術(shù)中維持大鼠肛溫37℃左右，直至動物蘇醒。假手術(shù)組大鼠不插入栓線，其余操作與模型組相同。動物術(shù)畢清醒后進行行為學(xué)評分，未成模以及死亡大鼠不計入試驗。合并急性高血糖組大鼠采用腹腔注射方法給予50%的葡萄糖溶液，模型組(正常血糖組)于術(shù)前5 min、缺血后45 min和90 min給予0.9%的生理鹽水2 mL·kg-1。模型組合并高血糖1組和2組于術(shù)前5 min分別給予2.5 mL·kg-1和8 mL·kg-1的葡萄糖溶液；術(shù)后45 min和90 min均給予2 mL·kg-1的葡萄糖溶液。于第1次注射后以及術(shù)后的30 min和75 min尾尖采血并進行血糖測定，維持各組目標血糖值為4、10、20 mmol·L-1。

2.3神經(jīng)功能評分

參照Ludmila Belayev 12分評分法對動物神經(jīng)功能損傷情況進行評估[6-7]:① 提尾懸空(2分)0分：無明顯神經(jīng)功能缺失；1分：梗死對側(cè)肢體輕度屈曲；2分：梗死對側(cè)肢體屈曲明顯;② 肢體放置，分為視覺亞試驗(前方、側(cè)方)和觸覺亞試驗(前方、側(cè)方)(8分)0分：動物肢體放置反應(yīng)正常；1分：反應(yīng)延遲但不超過2s；2分：反應(yīng)延遲且>2s;③ 本體覺亞試驗(2分)0分：與對側(cè)比肢體同樣有力；1分：與對側(cè)比肢體稍有力；2分：與對側(cè)比肢體無力。

2.4梗死體積檢測

缺血/再灌注(I/R)24 h后處死大鼠，迅速斷頭取腦并將腦組織置于0.1 mmol·L-1的PBS冰水混合液中進行冰浴。1 min后取出放于腦槽中，每間隔2 mm連續(xù)冠狀方向切片，共切出6片。第1刀切在視交叉與腦前極的中點處，自第1刀起，向上連續(xù)切兩片，向后連續(xù)切4片。最后迅速將腦片放置于1.5% TTC的PBS緩沖液里，避光孵育10 min，期間翻轉(zhuǎn)腦片一次。顯色后，正常腦組織為紅色，梗死部位呈白色。將腦片移入4%多聚甲醛中固定24 h后拍照記錄。應(yīng)用Image J軟件進行圖像分析，計算梗死體積和水腫程度。梗死體積/%= [(梗死面積×2mm)/(2×健側(cè)腦面積×2mm)]×100%。水腫程度/%=(患側(cè)腦面積-健側(cè)腦面積)/2×健側(cè)腦面積×100%。

2.5免疫組織熒光雙標染色

對腦組織進行冰凍切片，正常血清封閉后，分別加入兔抗-LC3和小鼠抗-COX4，4℃孵育過夜。次日棄去一抗，PBST洗3次后，分別加入二抗：Alexa 488-conjugated donkey anti-rabbit 和Alexa 594-conjugated donkey anti-mouse IgG(1 ∶300; Invitrogen)，37℃避光孵育30 min。抗萃滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照，Image Pro Plus 6.0(IPP 6.0)進行圖像分析。

2.6Western blot檢測

于I/R 24 h處死動物，取缺血/再灌注側(cè)皮層的腦組織稱重，放入預(yù)冷的組織裂解液(1 ∶9)，冰浴中進行勻漿。破碎后的組織勻漿于4℃ 12 000 r·min-1離心20 min，取上清。用BCA試劑盒對蛋白含量進行測定。每組取50 μg蛋白樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳對樣品進行分離。分離后進行轉(zhuǎn)膜、封閉、最后加入一抗，4℃孵育過夜。d 2棄去一抗，TBST洗膜3次后加入二抗，室溫搖床孵育2 h。把ECL混合液均勻加在膜上，LAS3000 image reader系統(tǒng)讀取并拍照，保存圖像，Quantity one 軟件進行圖片分析。

2.7透射電鏡

各組動物分別于術(shù)后各時間點水合氯醛腹腔注射麻醉，立即斷頭取腦，分離右側(cè)半球大腦皮質(zhì)，大小約1 mm3，迅速置入預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液中，4℃保存固定2 h后，0.1 mol·L-1的PBS洗3次。隨后用1%鋨酸后固定2 h。乙醇逐級脫水，樹脂包埋。厚度為50 nm超薄切片。枸椽酸鉛染色。HITACHI H-7650型透射電鏡觀察自噬體、溶酶體的形態(tài)及數(shù)量，并攝片。

2.8統(tǒng)計學(xué)處理

3結(jié)果

3.1MCAO造模急性期大鼠血糖水平的測定

如Tab 1所示，各組大鼠的基礎(chǔ)血糖水平?jīng)]有顯著性的差異(P>0.05)。MCAO造模后不同時間點對血糖水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，正常血糖組動物血糖水平穩(wěn)定維持在4 mmol·L-1左右。高血糖1組動物和2組動物的血糖水平則明顯增加，分別穩(wěn)定維持在10和20 mmol·L-1左右，組內(nèi)比較差異不具有顯著性(P>0.05)，組間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Tab 1　Levels of blood glucose at different±s,n=5)

**P<0.01vsN

3.2急性高血糖對MCAO大鼠神經(jīng)功能的影響

I/R 24 h后，各組動物出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，如對側(cè)前肢屈曲、左側(cè)轉(zhuǎn)圈等。利用Ludmila Belayev 12分評分法進行評估發(fā)現(xiàn)，模型組(正常血糖)、高血糖1組和2組的神經(jīng)功能缺陷平分分別為4.8±0.99、5.2±1.17、9.6±1.05。高血糖2組動物神經(jīng)功能受損程度高于正常血糖組和高血糖1組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=32.509，P<0.05)；高血糖1組與模型組相比，對動物神經(jīng)功能的損傷程度差異沒有顯著性(P>0.05,見Fig 1)。

Fig 1　Effect of hyperglycemia on neurological

**P<0.01vsHG1;##P<0.01vsN.

3.3急性高血糖對MCAO模型大鼠腦梗死和水腫程度的影響

I/R 24 h后對腦組織進行TTC染色，評估腦梗死的情況。與假手術(shù)組(0%)相比，缺血損傷各組均有明顯的梗死出現(xiàn)。模型組(N)、高血糖1組和2組的腦梗死體積百分比分別為28.6±0.99、29.2±1.17、33.2±1.05。與模型(N)組相比，高血糖2組(HG2)動物的腦梗死程度明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=58.9，P<0.05)。高血糖1組(HG1)組與模型組(N)組相比，腦梗死程度差異沒有顯著性(P>0.05)。(Fig 2A、B)。同樣，與健側(cè)腦組織相比，患側(cè)腦組織出現(xiàn)明顯水腫。模型組(N)、高血糖1組和2組的腦水腫體積百分比分別為14.8±0.89、15.1±1.47、19.6±1.07。與模型(N)組相比，高血糖2(HG2)組動物的腦水腫程度顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52.7，P<0.01)。高血糖1組(HG1)與模型(N)組相比，腦水腫程度差異沒有顯著性(P>0.05)(Fig 2A、C)。

3.4急性高血糖對MCAO模型大鼠皮層線粒體自噬清除的影響

我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，缺血后會短暫誘導(dǎo)受損線粒體的自噬性清除，是機體內(nèi)源性的保護作用機制之一[8]。在此我們感興趣的是高血糖是否對缺血誘導(dǎo)的線粒體自噬性清除有影響。我們通過熒光雙標的方法，在I/R 24 h后對線粒體特異性標記物COX4和自噬小體的特異性標記物L(fēng)C3Ⅱ進行共定位，觀察線粒體自噬的情況。被LC3Ⅱ陽性信號包圍的線粒體被認為是線粒體自噬[9]。從Fig 3中可以看到，較假手術(shù)組相比，模型組中被自噬小體包裹的線粒體數(shù)目明顯增加(P<0.01)。高血糖1組與模型組相比，差異沒有顯著性(P>0.05)。而高血糖2組較模型組相比，則顯著降低了線粒體自噬的水平(P<0.05)。我們進一步通過電鏡的方法觀察各組線粒體自噬水平的變化。從Fig 4中我們可以看到，正常的線粒體具有清晰完整的嵴結(jié)構(gòu)和雙層膜結(jié)構(gòu)。與正常對照相比，模型組(N)在I/R 24 h后觀察到大量的被雙層膜自噬小體包裹的線粒體。而在高血糖2組中，鏡下幾乎觀察不到線粒體自噬的現(xiàn)象，伴隨高電子云密度和腫脹的受損線粒體[10]數(shù)目增加(P<0.01)。為了進一步確定高血糖誘導(dǎo)的缺血后線粒體自噬水平的降低是否是通過抑制大自噬流實現(xiàn)的，我們通過Western blot進一步對自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達水平進行檢測。從Fig 5實驗結(jié)果中可以看到，模型組較假手術(shù)組相比，明顯上調(diào)大自噬水平，差異具有顯著性(P<0.01)。而高血糖組較模型組組相比，對大自噬流的影響差異沒有顯著性(P>0.05)。

Fig 2　Effect of hyperglycemia on infarct volume

#P<0.05,##P<0.01vsN. A: TTC staining of brain sections; B: quantitative analysis of brain infarct volume;C: quantitative analysis of brain edema volume

3.5高血糖對MCAO模型大鼠腦內(nèi)凋亡的影響

線粒體受損后會促進cyt-C的釋放增加，促進凋亡的發(fā)生。從實驗結(jié)果中可以看到，與模型組相比，高血糖1組中cyt-C的釋放并沒有增加(P>0.01)，而高血糖2組cyt-C的釋放明顯增加，差異具有顯著性(P<0.01)(Fig 6)。caspase-9和caspase-3是線粒體介導(dǎo)的凋亡信號通路的特異標記物，從實驗結(jié)果中可以看到，與模型組和高血糖1組相比，高血糖2組caspase-9和caspase-3的活化明顯增加，差異具有顯著性(P<0.001)。

Fig 3　Effect of hyperglycemia on mitophagy in MCAO rats by immunoflurences±s,n=4)

##P<0.01vssham group;*P<0.05vsN. A: Representative double-staining images with COX4 and LC3 in ischemic penumbra;B: quantification of colocalization of LC3 and COX4.

4討論

大量的臨床研究和觀察數(shù)據(jù)顯示，急性血糖升高是腦卒中患者病情嚴重程度和預(yù)后不良的獨立風(fēng)險因素，缺血第1個24 h內(nèi)血糖水平>7 mmol·L-1的患者與正常血糖患者相比，死亡率、致殘率增高，神經(jīng)功能預(yù)后更差[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，住院的缺血性卒中發(fā)病后血糖水平>6.1 mmol·L-1的非糖尿病患者，住院4周的死亡率是糖尿病患者的1.7倍[12]。美國糖尿病學(xué)會提出，包括缺血性腦卒中在內(nèi)的所有住院高血糖非重癥患者，都應(yīng)積極控制空腹血糖小于7.8 mmol·L-1，而重癥患者應(yīng)通過胰島素治療，控制血糖在7.8～10 mmol·L-1之內(nèi)[13]。但同時存在不同的觀點認為，一定程度的血糖升高無需治療，且是對卒中患者有益[14]。

Fig 4　Effect of hyperglycemia on mitophagy

##P<0.01vssham group;**P<0.01vsN group. Bar=500 nm.A:Representative EM images of mitochondrial autophagy in ischemic penumbra;B:Quantification of damaged mitochondria. Arrows indicate autophagosomes.

比如，在一項實驗中，采用靜脈輸注葡萄糖-鉀-胰島素的方式對血糖進行嚴格的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)降糖并不能減少患者的腦梗死體積[15]，這也可能與入組患者血糖水平集中在7～12 mmol·L-1(輕度高血糖)有關(guān)。有關(guān)缺血性卒中后最佳的血糖水平目前仍無統(tǒng)一的定論，加之降糖所伴隨的低血糖同時也是加重缺血性腦損傷的風(fēng)險因素之一，因此為積極嚴格的血糖調(diào)控都帶來困難。

動物實驗數(shù)據(jù)顯示，高血糖通過抗纖溶和促凝來影響溶栓療效，破壞內(nèi)皮功能，加重再灌注損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，后適應(yīng)可以對抗高血糖對缺血的損傷作用[16]但對于高血糖對缺血損傷的影響及作用機制尚未完全明確。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，缺血損傷可以短暫地誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生，這是機體內(nèi)源性的保護作用機制之一，可以通過及時地清除受損線粒體，避免線粒體下游介導(dǎo)的凋亡級聯(lián)損傷反應(yīng)來發(fā)揮一定的保護作用[8]。高血糖是否對該過程具有一定的影響目前還不清楚。為了深入進行機制研究，本實驗通過腹腔注射葡萄糖溶液誘導(dǎo)卒中發(fā)病后的高血糖狀態(tài)，該方法可以很好的區(qū)別糖尿病性高血糖的狀態(tài)，不涉及糖尿病伴隨的復(fù)雜的病生機制，更好的模擬卒中后應(yīng)激性的高血糖特征。從實驗結(jié)果中可以看到，本研究中建立的輕度高血糖組(高血糖1組)的血糖水平能很好的模擬臨床上輕度的血糖波動范圍，其對MCAO大鼠的神經(jīng)功能和梗死體積的影響與正常血糖組相比差異無顯著性。而高血糖2組(重度高血糖)與模型組和高血糖1組相比，腦梗死體積和神經(jīng)功能缺陷程度都有明顯加重，并具有統(tǒng)計學(xué)意義。提示我們作為腦組織中重要的功能性物質(zhì)之一，葡萄糖水平的輕度升高的可能不會加重急性缺血性腦損傷，但當(dāng)其水平超出一定的限度，則會加重缺血缺氧性腦損傷。

Fig 5　Effect of hyperglycemia on bulk autophagic flux in MCAO±s,n=3)

##P<0.01vssham group.AB:Western blot and quantitative analysis of LC3 expression;CD: Western blot and quantitative analysis of p62 expression.

Fig 6　Effect of hyperglycemia on mitochondrial mediated apoptosis in MCAO±s,n=3)

##P<0.01vssham group;**P<0.01vsN group.A:Western blot of Cyt-C, Active-C3 and Active-C9.BCD: quantitative analysis of expression of Cyt-C, Active-C3 and Active-C9.

進一步對機制進行研究發(fā)現(xiàn)，重度高血糖抑制了急性缺血早期內(nèi)源性的線粒體自噬清除，導(dǎo)致了大量的受損線粒體的堆積。線粒體受損如缺血缺氧損傷后，誘發(fā)下游一系列的級聯(lián)反應(yīng)[17-19]，活化內(nèi)源性凋亡，這也是造成缺血性中風(fēng)后腦神經(jīng)元損傷的重要原因之一。如促使線粒體釋放細胞色素C(Cyt-C)的釋放，Cyt-C在細胞質(zhì)內(nèi)與凋亡誘導(dǎo)因子1(AIF-1)、ATP，胱天蛋白酶原-9(pro-caspase-9)相互作用，形成凋亡小體，使得pro-caspase-9被激活為caspase-9，從而進一步激活胱天蛋白酶原-3(pro-caspase-3)，使其被裂解為活性狀態(tài)的caspase-3，引起細胞凋亡[19-20]。從我們的實驗結(jié)果中可以看到，重度高血糖促進了Cyt-C的釋放，擴大了線粒體介導(dǎo)的凋亡通路的激活。提示我們重度高血糖可能是通過抑制受損線粒體的自噬性清除，導(dǎo)致受損線粒體堆積，進一步擴大了受損線粒體下游的級聯(lián)損傷反應(yīng)，最終加重了缺血性腦損傷。

(致謝:感謝實驗過程中中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥理實驗室老師和同學(xué)的幫助。)

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Hyperglycemia aggravated cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting mitophagy

ZUO Wei，MEI Dan

(PekingUnionMedicalCollegeHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100032,China)

Abstract:AimTo investigate the role of hyperglycemia in cerebral ischemia/reperfusion(I/R) injury with a middle cerebral artery occlusion(MCAO) rat model and its mechanism.MethodsEighty healthy male SD rats were randomly assigned into sham group, I/R group (normoglycemia), hyperglycemic I/R groupⅠ(HG1) and hyperglycemic I/R groupⅡ(HG2). The cerebral I/R model was established by occluding the middle cerebral artery(MCA) in rats. Hyperglycemia was induced by intraperitoneal injection of 50% glucose solution. Neurological deficit was determined by Ludmila Belayev test; infarct size and brain edema were measured by TTC staining; mitophagy was observed by double immunofluorescent staining and electron microscope. The expressions of autophagy-related proteins(LC3 and Beclin-1)and apoptosis-related proteins(Cyt-C，AIF，caspase-9 and caspase-3)were examined by Western blot furtherly.ResultsBlood glucose level was controlled at 4 mmol·L-1(normoglycemia), 10 mmol·L-1(HG1) and 20 mmol·L-1(HG2) respectively. There were no significant differences between model group and HG1 group in neurological deficit scores, infarct volume and edema size(P>0.05). However, these indications in HG2 group were significantly increased compared with model group(P<0.05). After 3 days of reperfusion, the level of mitophagy was significantly reduced accompanied with increased mitochondria damages in HG2 group(P< 0.05)，and the expressions of mitochondrial related apoptotic proteins(Cyt-C，AIF，caspase-9 and caspase-3) were significantly increased accordingly compared to model group.ConclusionsMild hyperglycemia can not intensify the cerebal ischemic injury. In contrast, severe hyperglycemia significantly aggravates the brain ischemic injury by inhibiting the removal of injured mitochondria in a manner of mitophagy, thus amplifying the mitochondrial mediated cascade damage responses.

Key words:brain ischemia; hyperglycemia；mitophagy；TTC staining；apoptosis; neurological function；mitochondrian

收稿日期:2016-02-28,修回日期:2016-03-30

作者簡介：左瑋(1986-)，女，博士，助理藥師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail：eileenzuo@163.com；

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.021

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0846-08

中國圖書分類號：R-332；R322.81；R329.24；R587.1；R743.31

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.042.html

梅丹(1962-)，女，博士，主任醫(yī)師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)，通訊作者，E-mail：meidanpumch@163.com