血根堿抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖的機制研究

路玉盼,董憲喆,馮　霞,胡　園,鄭小麗,葛曉悅,汪進良,劉　屏

(1.山西中醫學院中藥學院,山西 晉中　030600；2.中國人民解放軍總醫院臨床藥理研究室,北京　100853；3.總參第六十一研究所門診部,北京　100041； 4.中國人民解放軍總醫院腫瘤內一科,北京　100853)

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血根堿抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖的機制研究

路玉盼1,2,董憲喆2,馮霞3,胡園2,鄭小麗2,葛曉悅2,汪進良4,劉屏2

(1.山西中醫學院中藥學院,山西 晉中030600；2.中國人民解放軍總醫院臨床藥理研究室,北京100853；3.總參第六十一研究所門診部,北京100041； 4.中國人民解放軍總醫院腫瘤內一科,北京100853)

摘要：目的研究血根堿(Sanguinaria canadensis，SAN)誘導人乳腺癌細胞MCF-7凋亡可能的作用機制。方法MTT法檢測SAN對MCF-7細胞存活率的影響；激光掃描共聚焦顯微鏡觀察SAN對MCF-7細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量的影響；化學發光法檢測SAN對MCF-7細胞內caspase-3、caspase-8、caspase-9活性的影響。結果SAN能降低MCF-7細胞存活率；SAN可明顯升高MCF-7細胞內ROS含量，升高細胞內caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性，而這種作用能被抗氧化劑NAC抑制。結論以上結果證明SAN能夠抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖，其機制可能是通過升高細胞內ROS水平，激活caspase級聯反應，進而誘導細胞凋亡發揮作用。

關鍵詞：血根堿；MCF-7；活性氧；caspase；凋亡；乳腺癌；增殖

血根堿(Sanguinaria canadensis，SAN)是一種苯并菲啶類生物堿，主要來源于血根草的根或者罌粟紫堇植物，分布于我國的長江流域、華南、華東地區。天然的SAN是罌粟科植物受到外界環境的有害刺激時產生的用于對抗真菌和細菌病原體等的抗毒素類物質，其本身可以被煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸還原為低毒的二氫還原體，使植物本身不受影響。由于其具有抗菌消炎的作用，最初作為牙膏添加劑來降低牙菌斑和牙齦炎的發生，或者用于空腔消毒清洗，它的獨特作用已受到國內外的高度重視。

近年來，國內外的很多研究表明SAN具有抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用，如結腸癌、口腔鱗狀細胞癌、前列腺癌、人骨肉瘤以及胃癌等[1-6]。本課題組前期的研究也證明，SAN能夠抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖，并誘導其凋亡[7]。本研究以氧化應激和caspase家族為切入點，探索其抑制MCF-7增殖的機制。

1材料

1.1細胞株

人乳腺癌細胞MCF-7購自中國醫學科學院腫瘤醫院細胞庫，由本實驗室傳代凍存。

1.2主要試劑

RPMI 1640培養基、胎牛血清(FBS)，美國Gibco公司；MTT(四氮甲基四唑藍)，美國Sigma公司產品；活性氧檢測試劑盒，碧云天生物技術研究所；caspase-Glo 3檢測試劑盒、caspase- Glo 8檢測試劑盒、caspase-Glo 9檢測試劑盒，美國Promega公司；NAC，美國Sigma公司； caspase-3抑制劑(Ac-DEVD-CHO)，美國Promega公司；caspase-8抑制劑(Z-IETD-FMK)，美國BioVision公司；caspase-9 抑制劑(Z-LEHD-FMK·TFA)，美國Sigma公司。

2方法

2.1MTT法檢測SAN對MCF-7的增殖抑制作用

取對數生長期MCF-7細胞，以7×107·L-1的密度接種于96孔培養板中，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h，然后加入不同濃度的SAN，使其終濃度分別為2.5、5、10、20、40 μmol·L-1，正常對照組加入不完全RPMI 1640。考察NAC及caspase抑制劑對細胞存活率的影響時，在加入5、10 μmol·L-1SAN的同時再分別加入5或10 μmol·L-1的NAC，caspase-3抑制劑 (Ac-DEVD-CHO)、caspase-8抑制劑(Z-IETD-FMK)和caspase-9 抑制劑(Z-LEHD-FMK·TFA)組在加入10 μmol·L-1的SAN的同時分別加入上述抑制劑，終濃度分別為1、2、20 μmol·L-1[8]。細胞繼續培養48 h，然后加入終濃度為0.5 mg·L-1的MTT，4 h后棄去培養液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩溶解10 min后，在570 nm處檢測OD值[9]。

2.2SAN對MCF-7細胞內ROS的影響

取對數生長期MCF-7細胞，以2×108·L-1的密度接種于Petri皿，每個皿200 μL。CO2孵箱中培養24 h。然后分別加入終濃度為5、10 μmol·L-1的SAN，正常對照組加入不完全RPMI 1640，NAC組及Ac-DEVD-CHO、Z-IETD-FMK和Z-LEHD-FMK·TFA組的處理方法同前。繼續培養48 h后吸去培養液，PBS洗3次。各組分別加入200 μL終濃度為10 μmol·L-1的ROS特異性熒光探針DCFH-DA。37℃避光孵育35 min。其間每隔3～5 min輕搖混勻一下，使探針和細胞充分接觸。孵育結束后用無血清培養基洗滌細胞3次，以除去未進入細胞內的DCFH-DA。將Petri皿置于活細胞激光掃描共聚焦顯微鏡(UltraView-Vox，美國 PinkerElmer公司)物鏡下方的細胞培養小室內，設置溫度為37 ℃，CO2濃度為5%。在明場光源下調整焦距，在汞燈下觀察細胞內熒光探針標記情況，并進一步調整焦距。然后將光路轉換至左光路，關閉明場光源，打開激光，設置激發波長為488 nm。每組選擇10個視野，檢測細胞內熒光強度，由Volocity軟件計算各組熒光強度。

2.3SAN對MCF-7細胞內caspase-3、caspase-8、caspase-9活性的影響

取對數生長期細胞，調整細胞密度至7×107·L-1，接種于96孔板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養24 h。然后分別加入終濃度為5、10 μmol·L-1的SAN，正常對照組加入不完全RPMI 1640，NAC組同時加入5、10 μmol·L-1的NAC， NAC組及Ac-DEVD-CHO、Z-IETD-FMK和Z-LEHD-FMK·TFA組的處理方法同前，繼續培養48 h。按照caspase-3、-8、-9說明書，先將caspase-Glo底物溶于caspase-Glo緩沖液中，并加入蛋白酶體抑制劑，配制成caspase-Glo試劑，將caspase-Glo試劑加入93孔板中，室溫避光孵育相應時間，然后將上清液轉移至不透光的96孔白板中，多標記微孔板檢測儀(Victor 1420，美國 PinkerElmer公司)選擇luminescence模式，檢測各孔化學發光強度，讀數即代表各組細胞內caspase-3、-8、-9的相對活性。

2.4統計學分析

3結果

3.1SAN對MCF-7細胞的增殖抑制作用

MTT法檢測不同濃度的SAN作用48 h對MCF-7細胞增殖情況的影響。如Fig 1所示，SAN在2.5～40 μmol·L-1濃度范圍內對MCF-7細胞的增殖有明顯的抑制作用，并且呈現濃度依賴性。10 μmol·L-1的SAN作用48 h對MCF-7細胞的抑制率即接近50%。

Fig 1　Antiproliferation effects of various concentrations of SAN on MCF-7 cells(n=5)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.2SAN及NAC對MCF-7細胞內ROS的影響

如Fig 2所示，以終濃度為5、10 μmol·L-1的SAN作用于MCF-7細胞48 h后，活細胞激光掃描共聚焦顯微鏡下采集圖片并分析熒光強度(FI)，SAN干預組細胞內熒光強度較正常對照組明顯升高；而在10 μmol·L-1SAN干預的同時，給予5、10 μmol·L-1的NAC，細胞內的熒光強度明顯降低，低于10 μmol·L-1SAN單獨干預組(P<0.01)。

3.3SAN及NAC對MCF-7細胞存活率的影響

如Fig 3所示，終濃度為5、10 μmol·L-1的SAN可明顯降低細胞存活率(P<0.01)，5、10 μmol·L-1的NAC單獨使用對細胞增殖沒有影響；5、10 μmol·L-1的NAC可逆轉10 μmol·L-1的SAN對MCF-7細胞增殖的抑制作用(P<0.05，P<0.01)。

3.4SAN對MCF-7細胞內caspase-3、caspase-8、caspase-9活性的影響

化學發光法檢測發現，終濃度為5、10 μmol·L-1的SAN作用于MCF-7細胞后，MCF-7細胞內caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性與正常對照組相比都有明顯升高(P<0.01)，呈明顯的濃度依賴關系；5、10 μmol·L-1的NAC可抑制SAN對caspase-3和caspase-9活性的升高作用(P<0.01)，對caspase-8活性未見明顯影響(Fig 4)。

3.5caspase-3、caspase-8、caspase-9抑制劑對MCF-7細胞內ROS含量及細胞活力的影響

鑒于NAC對caspase-3和caspase-9活性的抑制作用，觀察了caspase-3、caspase-8和caspase-9的抑制劑對細胞內ROS及細胞增殖的影響。由Fig 5A可見，單用10 μmol·L-1的SAN作用后，MCF-7細胞內ROS含量較正常對照組明顯升高，細胞活力明顯下降；caspase-3、caspase-8、caspase-9抑制劑與10 μmol·L-1的SAN同時使用后，MCF-7細胞內ROS含量較單用SAN沒有明顯的變化；然而，caspase-3和caspase-9的抑制劑雖不能降低細胞內ROS水平，卻能明顯逆轉SAN導致的MCF-7細胞存活率的下降(Fig 5B)。

Fig 2Effects of SAN and NAC on ROS content in MCF-7 cells(n=3)

A: Control; B:SAN 5 μmol·L-1; C: SAN 10 μmol·L-1; D: SAN 10 μmol·L-1+NAC 5 μmol·L-1; E: SAN 10 μmol·L-1+NAC 10 μmol·L-1; F: A semiquantitative assay of fluorescence intensity.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsSAN 10 μmol·L-1

Fig 3　Effects of SAN and NAC on cell proliferation in MCF-7 cells(n=5)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsSAN 10 μmol·L-1

4討論

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是呼吸鏈底物端和氧端漏出的電子，沒有參加ATP合成，而在體內被氧化產生的一類氧的單電子還原產物[10]，包括氧的一電子還原產物超氧陰離子、二電子還原產物過氧化氫、三電子還原產物羥基自由基以及一氧化氮等[11]。在生物體內，氧化與抗氧化處于一種動態平衡狀態。ROS是細胞代謝不可避免的產物，正常情況下，細胞代謝并釋放低濃度的ROS以促進細胞增殖，同時生物體內有多種清除ROS的酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等。它們可以清除代謝過程中不斷產生的ROS，使得細胞內ROS處于一個相對穩定的水平[12]。當這種平衡一旦被某些因素打破，使細胞內ROS產生增多，就可以通過激活相關的細胞凋亡信號轉導途徑，誘導細胞凋亡，甚至死亡[13]。

caspases是近年來發現的一組存在于胞質溶膠中的結構上相關的半胱氨酸蛋白酶，它們是細胞凋亡信號轉導通路中最重要的一類酶。由于caspase可自我活化并能相互激活，因此凋亡過程一旦觸發，即呈級聯放大效應[14]。caspases依賴的細胞凋亡信號轉導途徑包括線粒體途徑和死亡受體途徑。線粒體途徑中caspase-9最為重要，又稱為caspase-9途徑；死亡受體途徑中caspase-8尤其關鍵，所以又稱為caspase-8途徑[15]，這兩條途徑最終都激活caspase-3。caspase-3是效應型半胱天冬蛋白酶 ，可以進一步裂解與凋亡相關的靶蛋白和酶類，進而導致細胞凋亡。

本研究發現，SAN能夠明顯抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖。采用活細胞激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發現，SAN可以升高細胞內ROS的水平；化學發光實驗結果顯示，SAN能升高MCF-7細胞內caspase-3、capase-8、caspase-9活性。由此提示SAN抑制MCF-7細胞增殖與升高細胞內ROS、激活caspases級聯反應密切相關，但二者何為因果尚不明確。因此，本文又進一步分別研究了ROS抑制劑對caspase-3、capase-8、caspase-9活性和細胞增殖的影響，以及caspase-3、capase-8、caspase-9的抑制劑對細胞內ROS含量和細胞增殖情況的影響。結果顯示，ROS抑制劑NAC能明顯抑制caspase-3和caspase-9的活性，升高細胞存活率；caspase-3、caspase-9的抑制劑也能明顯升高細胞的存活率，卻不能降低SAN作用后MCF-7細胞內ROS水平。由此可初步確定，SAN通過升高細胞內ROS的水平，進而激活caspase級聯反應，升高caspase-3活性，抑制MCF-7細胞增殖。

Fig 4　Effects of SAN on caspase-3 (A)，caspase-8 (B) and caspase-9 (C) activities in MCF-7 cell(n=5)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsSAN 10 μmol·L-1

Fig 5　Effects of inhibitors of caspase-3，caspase-8 and caspase-9 on ROS content (A) and cell proliferation (B) in MCF-7 cells(n=5)

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsSAN 10 μmol·L-1

(致謝:本實驗在中國人民解放軍總醫院臨床藥理研究室腫瘤實驗室完成，感謝劉屏老師、董憲喆老師對本實驗整體設計的把握和指導，感謝胡園老師在數據統計分析方面給予的幫助；感謝汪進良教授對本研究的資助，感謝鄭小麗、葛曉悅在細胞培養、激光共聚焦檢測等實驗技術上給予的幫助。)

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Sanguinarine inhibits cell proliferation in MCF-7 human mammary adenocarcinoma cells

LU Yu-pan1,2, DONG Xian-zhe2, FENG Xia3, HU Yuan2,ZHENG Xiao-li2, GE Xiao-yue2, WANG Jin-liang4,LIU Ping2

(1.DeptofChineseMedicine,ShanxiUniversityofTCM,JinzhongShanxi030600,China;2,DeptofClinicalPharmacology,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853,China;3,OutpatientDepartmentofthe61stResearchInstituteofthePLAGeneralStaffHeadquarters,Beijing100041;4,DeptofMedicalOncology,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853)

Abstract:AimTo investigate whether exposure to Sanguinarine(SAN) can inhibit cell proliferation in human mammary adenocarcinoma cells(MCF-7) and the possible mechanism.MethodsWe exposed MCF-7 to anticancer compound SAN, cell viability was assessed by using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) reduction assay. ROS was measured using confocal microscopy, expression of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 were calculated using chemiluminescence method.ResultsSAN remarkably inhibited growth of human mammary adenocarcinoma MCF-7 cells by decreasing cell proliferation. ROS release and caspase-3, caspase-8, caspase-9 expression were stimulated by SAN in MCF-7, and these changes were abolished by the antioxidant, N-acetylcysteine(NAC).ConclusionRegulation of caspases expression and release from MCF-7 cells are possibly evoked by SAN through reactive oxygen species.

Key words:SAN；MCF-7；ROS；caspase；apoptosis；mammary adenocarcinoma；proliferation

收稿日期:2016-02-10,修回日期:2016-03-22

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81202965)

作者簡介：路玉盼(1990-)，女，碩士生，研究方向:腫瘤藥理學,E-mail：dongxianzhe@163.com；

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.023

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0858-05

中國圖書分類號：R284.1；R329.24；R329.25；R737.9

網絡出版時間：2016-5-25 15:39網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.046.html

劉屏(1956-)，女，博士，研究員，研究方向：腫瘤和神經藥理學，通訊作者，E-mail：liuping301@126.com