6-姜酚對MC3T3-E1成骨細胞增殖及分化的影響

劉斌，張瓊

(安徽醫科大學附屬省立醫院 藥劑科，安徽 合肥 230001)

6-姜酚對MC3T3-E1成骨細胞增殖及分化的影響

劉斌Δ，張瓊

(安徽醫科大學附屬省立醫院 藥劑科，安徽 合肥 230001)

目的 研究6-姜酚對MC3T3-E1成骨細胞增殖及分化的影響。方法 取MC3T3-E1成骨細胞培養，培養基加入含有 1×10-9、1×10-8、1×10-7mol/L的6-姜酚及15 mmol/L的高濃度葡萄糖作為實驗組，僅加入15 mmol/L的高濃度葡萄糖作為對照組，MTT法檢測MC3T3-E1成骨細胞增殖情況，ELISA法檢測細胞中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨鈣素(bone gla protein ，BGP)活性。結果 1×10-9～1×10-7mol/L的6-姜酚均能夠顯著地增加15 mmol/L高糖作用下的MC3T3-E1細胞生長并提升ALP活性，并能夠明顯地增強細胞骨鈣素的分泌，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 6-姜酚能促進體外培養的MC3T3-E1成骨細胞增殖與骨向分化，這可能為其防治骨質疏松的機制之一。

6-姜酚；高濃度葡萄糖；MC3T3-E1成骨細胞；增殖；分化；堿性磷酸酶；骨鈣素

骨質疏松的發生與Ⅰ型糖尿病有關，是公認的糖尿病并發癥，在糖尿病患者的骨骼中，成熟的成骨細胞數量明顯減少[1]。這提示：高血糖能夠抑制成骨細胞的分化，導致骨礦化含量降低、骨質疏松、骨折增加、和骨折愈合周期增長[2-3]。因此，若能抑制或阻止高血糖的對成骨細胞作用，對于糖尿病所致骨質疾病具有重要的意義。

6-姜酚(1-4-羥基-3 -甲氧基苯基-5-羥基-3-癸酮)是生姜的一種重要有效成分，具有多種不同藥理作用如：抗癌、抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、抑制環氧合酶-2活性等[4]。高濃度葡萄糖是一種能夠與蛋白質發生高度活化反應的還原糖，故將細胞長期暴露在高濃度葡萄糖中，可以產生細胞毒性反應。而6-姜酚具有很強的抗氧化活性，因此，本研究運用6-姜酚培養成骨細胞，觀察其對成骨細胞增殖的影響，初步探討6-姜酚預防骨質疏松的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器：311型CO2培養箱(美國Forma公司)；XD-101倒置相差顯微鏡(江南光電股份有限公司)。Bio-Elx-800 酶標儀(Bio-Rad公司)。MIKRO12-24 型臺式離心機(HETT ICH公司)。

1.1.2 藥物與試劑：6-姜酚(供含量測定用，成都瑞芬思生物科技有限公司，產品批號：A0218，含量均> 98%)；MTT、DMEM 培養基、含10%胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美國Sigma公司)；堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)測試盒(上海高創化學科技有限公司)。

1.1.3 細胞：小鼠成骨細胞株MC3T3-E1，購于中科院上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：小鼠成骨細胞MC3T3-E1在37 ℃、5%的二氧化碳保溫箱及DMEM培養液中進行培養。培養液組分含有10%熱滅活胎牛血清(FBS)、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素。當細胞達到一定的分化程度時，采用0.02%～0.05%的胰蛋白酶消化液進行傳代培養。細胞被接種于6孔板中，并在細胞長至鋪滿瓶底約90%后，用含有10 mmol/L的β-磷酸甘油和50 μg/mL抗壞血酸進行處理以在體外成骨。分為實驗組(含1×10-9、1×10-8、1×10-7mol/L的6-姜酚和15 mmol/L的高濃度葡萄糖)、對照組(含15 mmol/L的高濃度葡萄糖)，培養液2～3 d更換1次，在24、48、96 h，分別檢測細胞活性及堿性磷酸酶活性，并在1、2、14 d檢測骨鈣素的分泌情況，在這期間細胞培育在2%胎牛血清培養液中。

1.2.2 細胞增殖情況檢測：用MTT法測定6-姜酚對MC3T3-E1成骨細胞的增殖作用。細胞接種在24孔板中，細胞密度為2×104/孔。6-姜酚作用細胞24、48、96 h后，MTT比色法檢測細胞活性、增殖和正常生長。將MTT溶液(0.5 mg/mL)加至細胞中并在37 ℃條件下培養，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中。3 h后，除去殘余的MTT，結晶甲瓚在二甲基亞砜中孵化30 min后被溶解。搖動24孔板5 min并在570 nm處采用酶標儀測量其吸光度A值。

1.2.3 堿性磷酸酶活性檢測：6-姜酚作用細胞24、48、96 h后，棄去細胞培養液后用PBS輕輕地沖洗2次，用0.2%的Triton X-100裂解液處理后，在14000×g條件下離心5 min。測定上清液中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性。ALP用堿性磷酸酶活性檢測試劑盒進行測定。取新鮮配制的底物液100 μL，加40 μL細胞裂解液, 37 ℃溫箱內孵育30 min,加氫氧化鈉100 μL終止反應，波長為410 nm, 酶標儀檢測吸光度A值。

1.2.4 骨鈣素含量檢測：6-姜酚作用細胞24、48、96 h后按、骨鈣素(bone gla protein，BGP)含量檢測說明檢測性，簡要步驟如下：準備試劑、樣品和標準品，加入準備好的樣品和標準品，生物素標記的二抗，37 ℃反應60 min，洗板5次，加入顯色液 A、B，37 ℃顯色15 min，加入終止液，10 min內在450 nm波長處測定A值，計算。

2 結果

2.1 6-姜酚對MC3T3-E1成骨細胞增殖的影響 在24、48、96 h與對照組比較，不同濃度6-姜酚組對MC3T3-E1 成骨細胞增殖程度顯著升高(P<0.05)。對MC3T3-E1成骨細胞增殖的影響見表1。

表1 6-姜酚對MC3T3-E1成骨細胞增殖的影響

*P<0.05,與對照組比較,compared with the control group

2.2 6-姜酚對MC3T3-E1細胞ALP活性的影響 在24、48、96 h，與對照組比較，不同濃度6-姜酚組MC3T3-E1細胞ALP活性顯著增強(P<0.05)，這種促進作用隨時間增加而增強。6-姜酚對MC3T3-E1細胞ALP活性的影響見表2。

表2 6-姜酚對MC3T3-E1細胞ALP活性的影響

*P<0.05,與對照組比較,compared with the control group

2.3 6-姜酚對MC3T3-E1細胞BGP活性的影響 在24、48、96 h，與對照組比較，3個濃度在3個時間點的6-姜酚對MC3T3-E1細胞BGP活性顯著增強(P<0.05)。6-姜酚對MC3T3-E1細胞BGP活性的影響見表3。

表3 6-姜酚對MC3T3-E1細胞BGP活性的影響

*P<0.05,與對照組比較,compared with the control group

3 討論

骨質疏松發病的主要原因是雌激素缺乏引發的成骨細胞的骨形成不足和破骨細胞的骨吸收亢進導致的骨重建失衡; 成骨細胞不僅決定骨的形成，同時也調節破骨細胞對骨的吸收，是骨代謝的主要功能細胞，成骨細胞增殖和分化在很大程度上決定了最終形成的骨量[5]。細胞外葡萄糖水平升高能顯著地影響細胞功能，包括：細胞內、外蛋白質和DNA的非酶糖基化；調節細胞的氧化還原狀態；改變細胞的代謝途徑，如激活多元醇通路；蛋白激酶C的激活。這些改變及可能存在于信號轉導通路、轉錄因子活動中，還有一些難于識別的變化都可能直接影響細胞包括成骨細胞等的生長、分化和其他功能[6]。MC3T3-E1是前骨細胞在β-磷酸甘油和L-抗壞血酸共同作用條件下發生分化和礦化后的成骨細胞，是研究藥物對成骨細胞影響的有價值的體外細胞模型[7]。成骨細胞產生膠原、骨鈣素及堿性磷酸酶等的特性與骨基質的成熟和骨化有關。因此本實驗利用該體外實驗模型，探討6-姜酚對高濃度葡萄糖誘導下小鼠成骨細胞功能障礙和氧化應激反應的保護作用。

本研究主要以成骨細胞的增殖來考察6-姜酚對成骨細胞代謝的影響。MTT法是檢測細胞增殖活力的一種簡便、準確的方法。MTT實驗結果表明：1×10-9～1×10-7mol/L濃度下的6-姜酚單獨作用于成骨細胞并沒有顯示出細胞毒性反應。當細胞在1×10-9～1×10-7mol/L的6-姜酚作用下同時加入了15 mmol/L高濃度葡萄糖時，與僅使用高濃度葡萄糖作用下的對照組相比，3種不同濃度的6-姜酚均顯著地增加了MC3T3-E1細胞的生長作用(P<0.05)，提示：6-姜酚能夠抑制高糖誘導下的細胞毒性，并且促進成骨細胞的增殖，這為6-姜酚治療糖尿病引起的骨質疏松癥提供了依據。

堿性磷酸酶(ALP)是主要分布于細胞的鈣結合轉運蛋白，可促進細胞成熟、鈣化，是成熟成骨細胞的重要表面標志，代表成骨細胞的活性，也是骨形成的標志，能較準確地反映機體成骨細胞的狀況。本實驗結果表明：與對照組比較，在1×10-9～1×10-7mol/L 6-姜酚均使MC3T3-E1細胞ALP活性顯著增強(P<0.05)，說明6-姜酚促進成骨細胞活動增強時，ALP活性升高。

骨鈣素在調節細胞的分化、骨基質形成與骨化的過程中起著關鍵的作用，是成骨細胞成熟的標志，被認為是成骨細胞功能的特異性標志，成骨細胞活性增強，骨鈣素水平升高，反之下降。本實驗結果表明：在14 d內，與對照組比較，1×10-9～1×10-7mol/L的6-姜酚使MC3T3-E1細胞BGP活性顯著增強(P<0.05)。

上述結果提示，6-姜酚具有促進成骨細胞MC3T3-E1各時期分化的作用，說明6-姜酚在糖尿病引起的骨質疾病的治療中有廣泛的應用價值。

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[4]王維皓,王智民.姜的化學、藥理研究進展.中國中藥雜志[J].2005，30(20)：1569-1573.

[5]蒿長英，任艷玲.趙金茹左歸丸含藥血清通過ERK/Smads信號通路干預MC3T3-E1細胞的功能基因表達[J].中國藥理學通報，2012,28(6):872-876.

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(編校：王儼儼)

Effects of 6-gingerol on the proliferation and differentiation of osteoblastic cellsinvitro

LIU BinΔ, ZHANG Qiong

(Department of Pharmacy, Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University, Hefei 230001, China)

Objective To explore the efficacy of 6-gingerol on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 osteoblastic cells culturedinvitro.MethodsMC3T3-E1 osteoblastic cells were collected and cultured by 6-gingerol of 1×10-9mol/L,1×10-8mol/L,1×10-7mol/L with 15 mmol/L high glucose as the experimental group,cultured in 15 mmol/L high glucose as the control group.The proliferation of MC3T3-E1 osteoblastic cells was determined by MTT,and the activities of alkaline phosphatase(alkaline phosphatase，ALP),bone gla protein(bone gla protein，BGP) were determined by ELISA.ResultsThe ratio of MC3T3-E1 osteoblastic cells proliferation was increased in 15 mmol/L high glucose containing 1×10-9-1×10-7mol/L 6-gingerol significantly increased the growth of MC3T3 E1 - cell which containing the action of high glucose of 15 mmol/L,increased the activity of ALP, and it caused a significant elevation of the activity of alkaline phosphatase (ALP) and the osteocalcin secretion of the cells, with statistical significant differences (P<0.05).Conclusion6-gingerol could promote the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 osteoblastic cells which is culturedinvitro,it may be one of its mechanism of preventment and the treatment of osteoporosis.

6-gingerol; high glucose; MC3T3-E1 osteoblastic cells; proliferation; differentiation; alkaline phosphatase; osteocalcin

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.08

劉斌，通信作者，男，碩士，副主任藥師，研究方向：臨床藥學,E-mail：liubinhf@sina.com。

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