淫羊藿素對骨肉瘤細胞增殖分化及侵襲力的影響

吳慶，馮瓊，劉星

(1.南昌大學第二附屬醫(yī)院 骨科，江西 南昌 330006；2.南昌大學護理學院，江西 南昌 330006)

淫羊藿素對骨肉瘤細胞增殖分化及侵襲力的影響

吳慶1Δ，馮瓊2，劉星1

(1.南昌大學第二附屬醫(yī)院 骨科，江西 南昌 330006；2.南昌大學護理學院，江西 南昌 330006)

目的 研究淫羊藿素對骨肉瘤細胞增殖分化及侵襲力作用機制。方法 以骨肉瘤細胞MG-63為研究對象，分別用4、8、16、32、64 μmol/L濃度的淫羊藿素與骨肉瘤細胞MG-63細胞作用24 h、48 h、72 h，同時設(shè)置空白對照組，經(jīng)MTT法檢測細胞抑制情況。通過Annexin V/PI雙染色淫羊藿素濃度為4、8、16、32 μmol/L作用48 h后的骨肉瘤細胞MG-63經(jīng)流式細胞儀觀察并計算細胞凋亡率。Transwell小室檢測經(jīng)淫羊藿素濃度為4、8、16、32 μmol/L作用48 h后的骨肉瘤細胞MG-63侵襲能力。Western blot檢測淫羊藿素對細胞中Bax、Bcl-2、MMP-9表達影響。結(jié)果 與對照組相比，淫羊藿素作用后的骨肉瘤細胞MG-63，抑制率有顯著差異(P<0.05)。骨肉瘤細胞經(jīng)0、4、8、16、32 μmol/L淫羊藿素作用后的細胞凋亡率依次為0.125 1±0.018 4，0.241 4±0.019 7，0.436 5±0.030 1，0.723 2±0.031 5，0.789 7±0.047，進一步說明了淫羊藿素是通過促進癌細胞凋亡抑制癌細胞增殖的。濃度為4、8、16、32 μmol/L淫羊藿素作用后的骨肉瘤MG-63細胞侵襲力與對照組相比差異顯著(P<0.01)。淫羊藿素可以減弱骨肉瘤MG-63細胞的侵襲能力，作用濃度越大，侵襲力抑制作用越明顯。淫羊藿素作用后的細胞中Bax蛋白表達隨著淫羊藿素作用濃度的增加而逐漸降低。淫羊藿素作用后的細胞中Bcl-2、MMP-9蛋白表達隨著淫羊藿素作用濃度的增加而逐漸降低。結(jié)論 淫羊藿素可以抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲，促進骨肉瘤細胞凋亡，抑制作用隨著淫羊藿素濃度的增加而增加，促細胞凋亡作用隨著作用時間和作用濃度的增加而增加，作用機制與Bax、Bcl-2、MMP-9有關(guān)。

骨肉瘤細胞；淫羊藿素；增殖抑制；凋亡

骨肉瘤(Osteosarcoma)是常見的惡性腫瘤，在原發(fā)性惡性骨腫瘤中，發(fā)病率排名第二，僅次于細胞骨髓瘤[1]。骨肉瘤致死率高，任何年齡階段的人都有發(fā)病可能。骨肉瘤不易根治，復發(fā)率高，轉(zhuǎn)移能力強，治療后恢復能力差。常用治療骨肉瘤的方法是手術(shù)、化療。但手術(shù)恢復速度慢，化療副作用較多，且價格昂貴[2]。因此，尋找新的治療方法是目前研究的熱點。

淫羊藿是一種中草藥，屬于小檗科淫羊藿屬的一種植物。在日本,中國江西、湖南、四川等地分布較為廣泛。具有補腎陽、強筋骨的功效[3]。在治療小兒麻痹、慢性氣管炎、神經(jīng)衰弱中得以廣泛應用，對免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、對內(nèi)分泌均有一定的藥理作用。淫羊藿素(Icaritin,ICT)是淫羊藿的一種衍生物，在疾病治療中具有很強的生物學活性[4]。研究表明[5]，淫羊藿素在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌等多種癌癥的體外細胞實驗中具有抑制癌細胞增殖分化的作用。為了明確淫羊藿素對骨肉瘤細胞的作用，本研究以骨肉瘤細胞MG-63為研究對象，探究淫羊藿素對骨肉瘤細胞的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人骨肉瘤細胞MG-63由中南大學湘雅醫(yī)院細胞中心提供。

1.1.2 儀器：Wallace 1420酶標儀購自南京德鐵實驗設(shè)備有限公司；TC2323 CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO；SW-CJ-IF超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD；CSX41倒置顯微鏡購自日本尼康。

1.1.3 試劑：Matrigel、RPMI1640、青鏈霉素、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma；PBS、Annexin V和PI購自鼎國生物試劑有限公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青有限公司；MTT購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：-80 ℃保存的骨肉瘤細胞MG-63放置于37 ℃水浴鍋中輕微搖動。觀察細胞溶解后，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入含雙抗和10%FBS的PRMI1640培養(yǎng)基，1 000 rpm，離心5 min，加入細胞生長液懸浮細胞，種植于細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞貼壁大約為90%時，用0.25%胰蛋白酶消化液消化細胞，1 000 rpm，5 min離心。加入PBS溶液洗滌細胞兩次，棄上清，加入細胞生長液，接種于新的細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖：取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的骨肉瘤細胞MG-63，胰蛋白酶消化細胞，離心收集細胞，加入細胞生長液，調(diào)整每毫升細胞生長液中含細胞5×104個，取100 μl接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，放置于CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃，培養(yǎng)24 h，觀察細胞完全貼壁后，加入同濃度的淫羊藿素藥物刺激細胞。淫羊藿素設(shè)置5個濃度梯度，分別為4、8、16、32、64 μmol/L，培養(yǎng)時間分別為24、48、72 h。每組設(shè)置5個復孔提高實驗的準確性，設(shè)置陰性對照組和空白組，陰性對照組中不加藥物淫羊藿素只加入等量的生長液，而空白組中不加細胞加入等量的淫羊藿素藥物。待藥物作用時間結(jié)束后，加入體積為20 μl的MTT溶液，MTT溶液濃度為5 mg/ml，置于37 ℃，CO2培養(yǎng)箱中反應4 h，棄上清液，在細胞中加入DMSO溶液150 μl，避光條件下緩慢震蕩10 min，觀察結(jié)晶物完全溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔的吸光度(OD值)，實驗重復3次，取平均值計算細胞抑制率。抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡：培養(yǎng)MG-63細胞至對數(shù)生長期，胰蛋白酶消化細胞，PBS反復洗滌離心后加入細胞生長液，調(diào)整細胞濃度為2×105個/孔，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入細胞生長液2 ml，37 ℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞24 h后，觀察細胞完全貼壁，倒掉細胞生長液，分別在MG-63細胞中加淫羊藿素濃度為4、8、16、32 μmol/L的含藥培養(yǎng)基，每孔中加入細胞生長液體積為2 ml。同時設(shè)對照組，對照組MG-63細胞中不加淫羊藿素，加入等量的DMSO溶液，置于37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h，棄去含藥培養(yǎng)基，加入PBS洗滌后，胰蛋白酶消化細胞，2 000 rpm，5 min，離心，加入PBS重懸，調(diào)整每孔中細胞數(shù)量大約為1×106個，2 000 rpm，5 min，收集細胞，在每組細胞中加入500 μl的結(jié)合緩沖液，混合均勻，重懸細胞。加入5 μl Annexin V，再加入5 μl PI混合，室溫下孵育反應10 min后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。凋亡率=凋亡細胞數(shù)/(凋亡細胞數(shù)+正常細胞數(shù))。實驗重復3次。

1.2.4 淫羊藿素對骨肉瘤細胞侵襲力：骨肉瘤MG-63細胞經(jīng)終濃度為4、8、16、32 μmol/L的淫羊藿素作用48 h后，胰蛋白酶消化細胞，加入不含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)基懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為3×103個/ml，加入到提前5 h用Matrigel包被過的Transwell小室內(nèi)，每孔加入100 μl細胞懸浮液。在Transwell小室下部加入600 μl的含有FBS的完全培養(yǎng)基，放置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用棉簽小心擦掉Matrigel，用濃度為4%的多聚甲醛固定15 min，蘇木素染色后，用水洗滌。顯微鏡下觀察，計算細胞的侵襲力。

1.2.5 Western blot檢測細胞中Bcl-2、Bax、MMP-9蛋白表達情況：骨肉瘤MG-63細胞經(jīng)終濃度為4、8、16、32 μmol/L的淫羊藿素作用48 h后，胰蛋白酶消化細胞，收集細胞沉淀。細胞蛋白提取按照蛋白提取試劑盒說明書提取細胞中的蛋白。蛋白濃度檢測用BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書檢測提取的蛋白濃度。將蛋白樣品100 ℃煮沸5 min變性后。加入上樣孔中，每孔中加入50 μl變性蛋白，電泳初始電壓為80 V，電泳30 min后，調(diào)整電壓為120 V直至電泳結(jié)束。轉(zhuǎn)膜電流為30 mA，4 ℃轉(zhuǎn)膜過夜。5%脫脂奶粉封閉后，依次與一抗和二抗孵育后，在暗室中曝光，分析蛋白表達含量。同時設(shè)置對照組，實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測細胞增殖抑制情況 骨肉瘤細胞MG-63經(jīng)4、8、16、32、64 μmol/L的淫羊藿素作用時間為24、48、72 h后，與對照組相比，淫羊藿素作用組的抑制作用明顯，抑制率有顯著差異(P<0.05)。作用濃度為4 μmol/L的細胞抑制率與作用濃度為8 μmol/L的細胞抑制率差異顯著(P<0.05)，作用濃度為8 μmol/L的細胞抑制率與作用濃度為16 μmol/L的細胞抑制率差異顯著(P<0.05)，作用濃度為16 μmol/L的細胞抑制率與作用濃度為32 μmol/L的細胞抑制率差異顯著(P<0.05)，作用濃度為32 μmol/L的細胞抑制率與作用濃度為64 μmol/L的細胞抑制率無顯著差異。藥物作用時間為48 h與藥物作用時間為24 h的細胞抑制率差異顯著(P<0.05)，藥物作用時間為72 h的細胞抑制率與作用時間為48 h的抑制率差異不顯著。后期選用作用濃度為4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L的淫羊藿素，作用時間為48 h繼續(xù)研究。淫羊藿素可以抑制骨肉瘤細胞的增殖，并且呈現(xiàn)濃度依賴和時間依賴。見表1、圖1。

表1 MTT檢測藥物作用后的骨肉瘤細胞MG-63抑制情況

*P<0.05，與同濃度作用時間24 h比較，compared with same concentration treated for 24 h；#P<0.05，與同作用時間作用濃度分別為4、8、16 μmol/L比較，compared with same time and treated concentrations was 4,8,16 μmol/L

圖1 MTT檢測藥物作用后的骨肉瘤細胞MG-63抑制情況Fig.1 Inhibitory of osteosarcoma cells MG-63 after drug action by MTT

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 淫羊藿素濃度為4、8、16、32 μmol/L與骨肉瘤細胞MG-63作用時間為48 h后，經(jīng)過Annexin V/PI雙染色后，骨肉瘤細胞MG-63經(jīng)淫羊藿素作用后，凋亡率隨著藥物濃度的增加而增加。計算骨肉瘤細胞經(jīng)0、4、8、16、32 μmol/L淫羊藿素作用后的細胞凋亡率依次為0.125 1±0.018 4、0.241 4±0.019 7、0.436 5±0.030 1、0.723 2±0.031 5、0.789 7±0.047。32 μmol/L淫羊藿素與16 μmol/L淫羊藿素作用后的骨肉瘤細胞凋亡率差異顯著(P<0.01)，16 μmol/L淫羊藿素與8 μmol/L淫羊藿素作用后的骨肉瘤細胞凋亡率差異顯著(P<0.01)，8 μmol/L淫羊藿素與4 μmol/L淫羊藿素作用后的骨肉瘤細胞凋亡率差異顯著(P<0.01)。結(jié)果與MTT法檢測結(jié)果一致。見圖2。

圖2 淫羊藿素對MG-63細胞凋亡率影響 A：流式細胞儀檢測結(jié)果；B：細胞凋亡率**P<0.01，與對照組比較Fig.2 Effect of MG-63 on the apoptosis rate of the MG-63 cells A:flow cytometry results;B:cells apoptosis rate**P<0.01，compared with control group

2.3 淫羊藿素對MG-63細胞侵襲力影響 淫羊藿素濃度為0、4、8、16、32 μmol/L作用48 h的骨肉瘤細胞MG-63，利用Transwell小室測定細胞侵襲力。結(jié)果顯示，0、4、8、16、32 μmol/L的淫羊藿素作用后的骨肉瘤細胞MG-63侵襲力分別為571.47±5.14、385.26±3.45、290.31±3.04、210.78±4.25、189.25±1.86。濃度為4、8、16、32 μmol/L淫羊藿素作用后的骨肉瘤MG-63細胞侵襲力與對照組相比差異顯著(P<0.01)。淫羊藿素可以減弱骨肉瘤MG-63細胞的侵襲能力，作用濃度越大，侵襲力抑制越明顯。見圖3。

圖3 淫羊藿素對骨肉瘤MG-63細胞侵襲力影響 A：Transwell 小室結(jié)果圖；B：侵襲細胞數(shù)**P<0.01，與對照組相比Fig.3 Effect of the osteosarcoma MG-63 cells invasive power after Icaritin treated. A:Transwell result；B:the invasion cell number**P<0.01，compared with control group

2.4 Western blot檢測細胞中Bcl-2、Bax、MMP-9蛋白表達結(jié)果 骨肉瘤MG-63細胞經(jīng)終濃度為4、8、16、32 μmol/L的淫羊藿素作用48 h后，提取細胞蛋白，Western blot檢測細胞中Bcl-2、Bax、MMP-9表達水平。結(jié)果顯示，淫羊藿素作用后的細胞中Bax蛋白表達隨著淫羊藿素作用濃度的增加而逐漸降低。淫羊藿素作用后的細胞中Bcl-2、MMP-9蛋白表達隨著淫羊藿素作用濃度的增加而逐漸降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 淫羊藿素對MG-63細胞Bcl-2、Bax、MMP-9蛋白表達影響 A：Western blot結(jié)果圖；B：蛋白表達率**P<0.01，與對照組比較Fig.4 Effect of the expression of Bcl-2, Bax and MMP-9 protein in MG-63 cells after Icaritin treated A:Western blot results ;B:protein expression rate**P<0.01，compared with control group

3 討論

骨肉瘤是一種原發(fā)的惡性腫瘤，是一種始發(fā)于骨間葉細胞的腫瘤。在世界范圍內(nèi)，骨肉瘤的發(fā)病率位居第二，發(fā)病率在原發(fā)性骨腫瘤中僅次于骨髓瘤[6]。骨肉瘤的發(fā)病率占所有腫瘤發(fā)病率的0.3%。任何年齡階段的人均可發(fā)病，青少年中的發(fā)病率最高，主要在膝關(guān)節(jié)部位發(fā)病，轉(zhuǎn)移快，惡化快，治療后易復發(fā)，早期診斷效果差。當患者出現(xiàn)典型的癥狀時，多數(shù)已經(jīng)處于骨肉瘤晚期，耽誤治療時機[7]。上世紀七十年代，骨肉瘤的治療方法主要為截肢，預后效果差，3～5年的生存率只有14%。隨著骨肉瘤治療技術(shù)手段的成熟，保肢治療成為大多數(shù)骨肉瘤患者的首選[8]。現(xiàn)在治療骨肉瘤的方法主要有手術(shù)治療、放射治療、化療，化療目前為止治療效果較為顯著，但是化療出現(xiàn)的多藥耐藥成為目前治療中的關(guān)鍵難題，迫切需要研究和開發(fā)新的治療手段。

淫羊藿素是中草藥淫羊藿的生物活性很強的一種衍生物，其分子結(jié)構(gòu)與淫羊藿極為相似，是淫羊藿經(jīng)過一系列復雜的過程而提取出來的[9]。淫羊藿具有抗腫瘤作用，成為近些年來研究的重點。淫羊藿素對腫瘤細胞的增殖抑制和誘導癌細胞凋亡作用已經(jīng)在多種癌細胞中得以證實[10]。研究表明，淫羊藿素通過作用于ERK信號通路抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的生長。淫羊藿素對乳腺癌細胞具有明顯的增殖抑制作用。Li[1]驗證了淫羊藿素可以通過誘導細胞凋亡抑制肝癌細胞增殖分化作用。

MTT法是實驗室常用的檢測活細胞的實驗技術(shù)手段。在活細胞的線粒體中含有琥珀酸脫氫酶，外源性的MTT在琥珀酸脫氫酶的作用下可以生成不溶于水的結(jié)晶甲瓚，死細胞中由于沒有琥珀酸脫氫酶不能形成結(jié)晶，實驗過程中加入DMSO后可以溶解甲瓚，用酶標儀檢測細胞吸光度可以間接反應活細胞的數(shù)量。本研究選取了骨肉瘤細胞MG-63為研究對象，分別與不同濃度的淫羊藿素作用不同時間后，結(jié)果表明，與對照組相比，藥物作用后的骨肉瘤細胞MG-63生長增殖明顯受到抑制，并且抑制作用隨著藥物濃度的增加而增加，隨著藥物作用時間的增加而增加。

細胞凋亡是一種正常情況下的細胞死亡，在生命機體生長過程中具有重要作用。細胞凋亡是細胞為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而受基因調(diào)控的程序性死亡。細胞凋亡是一個復雜的過程，受多種因素調(diào)控[11-12]。細胞凋亡涉及到DNA內(nèi)核小體斷裂，細胞膜通透性改變，細胞質(zhì)流失、染色質(zhì)聚集等一系列過程。細胞凋亡有多種途徑。在細胞凋亡早期，線粒體膜的通透性發(fā)生改變，位于線粒體內(nèi)的質(zhì)子泵將質(zhì)子轉(zhuǎn)運到外室，這樣就在線粒體的內(nèi)膜上形成了跨膜電位差。細胞為了消除這種跨膜電位，依賴電位的離子通道、己糖激酶和親環(huán)蛋白等一系列化合物可以形成允許質(zhì)子通過的PT孔，從而引起細胞凋亡，當細胞中PT孔受到抑制時，細胞凋亡就受到抑制[13-14]。本研究中通過流式細胞儀檢測淫羊藿素濃度為4、8、16、32 μmol/L與骨肉瘤細胞MG-63作用48h后細胞凋亡情況，淫羊藿素可以促進骨肉瘤MG-63的凋亡。Transwell小室檢測細胞侵襲力，淫羊藿素作用后的骨肉瘤MG-63細胞侵襲能力降低，隨著作用濃度升高，侵襲力降低越明顯。Western blot檢測與細胞凋亡和侵襲相關(guān)蛋白結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淫羊藿素作用后的細胞中Bax蛋白表達隨著淫羊藿素作用濃度的增加而逐漸降低。淫羊藿素作用后的細胞中Bcl-2、MMP-9蛋白表達隨著淫羊藿素作用濃度的增加而逐漸降低，這說明淫羊藿素對骨肉瘤細胞的作用與Bax、Bcl-2、MMP-9的表達有關(guān)。

綜上所述，淫羊藿素可以有效抑制骨肉瘤細胞MG-63的增殖分化和促進細胞凋亡，減弱細胞的侵襲力，增殖抑制作用隨著作用時間和作用濃度的增加而增加，淫羊藿素對骨肉瘤細胞的作用與Bax、Bcl-2、MMP-9有關(guān)。本研究為進一步探討淫羊藿素對骨肉瘤細胞的增殖抑制和誘導細胞凋亡作用機制提供了基礎(chǔ)，為治療骨肉瘤提供新的思路。

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(編校：苗加會)

Effect of Icaritin on the proliferation and differentiation and invasion of Osteosarcoma cells

WU Qing1Δ, FENG Qiong2, LIU Xing1

(1.Department of orthopedics, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China; 2.College of nursing, Nanchang University, Nanchang 330006, China)

ObjectiveTo study the effect and mechanism of Icaritin on the proliferation and differentiation of osteosarcoma cells.MethodsIn human osteosarcoma MG-63 cells as the research object, respectively, with 4,8,16,32,64 μmol/L concentration of Icaritin for 24 h,48 h,72 h,respectivelydivided control group.Cell proliferation was detected with MTT.The cell apoptosis rate was observed and calculated by flow cytometry after Annexin V/PI double staining of MG-63 for 4,8,16,32 μmol/L of 48 h.The Transwell assay by icaritin concentration of 4,8,16,32 μmol/L role after 48 h of human osteosarcoma MG-63 cells invasion ability.Western blot assay the expression of Bax, Bcl-2 and MMP-9 in cells.Resultscompared with the control group, the inhibitory rate of MG-63 was significantly different from that in the control group (P<0.05).Osteosarcoma cells were treated with 0,4,8,16,32 μmol/L,apoptosis rate were 0.125 1±0.018 4，0.241 4±0.019 7，0.436 5±0.030 1，0.723 2±0.031 5，0.789 7±0.047,further illustrates the icaritin is by promoting apoptosis of cancer cells and inhibit the proliferation of the cancer cells.The concentration of 4,8,16,32 μmol/L, after the role of osteosarcoma MG-63 cells invasion force compared with the control group significantly(P<0.01).The effect of MG-63 on the invasion of osteosarcoma cells was decreased, and the effect of the inhibition of the invasion was more obvious.The expression of Bax protein in the cells after the action of the Icaritin was decreased with the increase of the concentration .The expression of Bcl-2 and MMP-9 protein in the cells after the action of Icaritin was gradually decreased with the increase of the concentration.ConclusionIcaritin can inhibit the proliferation and invasion of osteosarcoma cells, promote apoptosis of osteosarcoma cells, the inhibition increases with the increase of icaritin concentration increased, promote cell apoptosis increased with time and concentration increase,its mechanism related to Bax, Bcl-2, MMP-9.

Osteosarcoma cell; Herba; proliferation inhibition; apoptosis

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.11

吳慶，通信作者，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：脊柱方面，E-mail：825933047@qq.com。

R738.1

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