結(jié)核分枝桿菌黏附素HBHA在結(jié)核病免疫學(xué)診斷中的應(yīng)用

李林彧 曾慶華

【摘要】目的：探討結(jié)核分枝桿菌粘附素（HBHA）在結(jié)核病免疫學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法：將培養(yǎng)基中處于穩(wěn)定期的卡介苗菌株超聲裂解（Pyrolyse）、層析（Chromatography）和洗脫（elution）最終獲得天然HBHA并制備重組蛋白；選取肺結(jié)核（TB）患者、結(jié)核病毒感染者以及健康人各30例，采集3組研究對(duì)象的外周血液中單核細(xì)胞，使用HBHA重組蛋白作為抗原培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，使用ELISA方法檢測(cè)各培養(yǎng)基中的 IFN-γ含量。結(jié)果：潛伏者組患者的IFN-γ含量顯著高于健康人組，同時(shí)略高于結(jié)核病患者組，數(shù)據(jù)差異顯著P<0.05。結(jié)論：在結(jié)核病免疫學(xué)診斷中使用HBHA具有靈敏度高的特點(diǎn)，值得推廣普及。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核病；HBHA；免疫學(xué)；診斷

【中圖分類號(hào)】R-0 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1671-8801（2016）03-0193-02

結(jié)核病的診斷一直一來都是臨床診斷的難點(diǎn)，常規(guī)的診斷方法具有耗時(shí)長(zhǎng)、陽性率低等缺點(diǎn)使得臨床應(yīng)用價(jià)值難以達(dá)到預(yù)期。為了提升肺外結(jié)核病癥診斷的準(zhǔn)確率，并可給患者的治療提供指導(dǎo)依據(jù)，尋求全新且有效的檢測(cè)方法成為亟待解決的問題[1]。HBHA是結(jié)核分支桿菌分泌的一種粘附素，醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其是一種參與肺外結(jié)核轉(zhuǎn)移的基因，并逐漸將其應(yīng)用于肺結(jié)核的診斷中，現(xiàn)做以下報(bào)告：

資料與方法

1.1一般資料

（1）血清樣本：實(shí)驗(yàn)中使用的肺結(jié)核患者血清均是來自于某醫(yī)院確診的TB患者，共計(jì)30例，其中男性18例，女性12例，平均年齡為（45.3±1.4）歲，平均病程為（2.0±0.7）年；結(jié)核病毒感染組30例，男女性比例為1：1，平均年齡為（43.7±3.5）歲；健康組血清為同時(shí)期進(jìn)行健康檢查者的血清樣本，受檢者30例，男女性比例為17：13，平均年齡為（42.3±3.0）歲。（2）BCG菌株：本次實(shí)驗(yàn)的BCG菌株由中國(guó)藥品、生物制品研究所提供。（3）試劑：HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG由北京中杉試劑生產(chǎn)公司提供；肝素吸附柱由US，Sigma公司提供； 吸附柱由鼎國(guó)生物有限公司提供。

1.2方法

（1）HBHA蛋白制備方法：首先在培養(yǎng)基中培養(yǎng)卡介苗時(shí)期繁殖至穩(wěn)定期，采用超聲對(duì)其進(jìn)行Pyrolyse、 和elution處理，最終獲取純天然的HBHA，將BCG基因組作為模版將HBHA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，質(zhì)粒PET，32a為載體，以大腸桿菌（Escherichia Coli）作為宿主菌制備HBHA重組蛋白。（2）外周血管單核細(xì)胞分離方法：分離過程均在無菌環(huán)境中進(jìn)行，采集測(cè)試者的靜脈血液，然后使用淋巴分離液獲得血樣中的單核細(xì)胞并洗滌操作，完畢后使用1640培養(yǎng)基重懸處理，懸浮密度控制在1.0*106/ml，然后將懸浮液分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（250ul/孔）。每個(gè)研究組又分為無刺激（無抗原）和HBHA組（HBHA2mg/L），連續(xù)培養(yǎng)4d后進(jìn)行分析[2]。（3）檢測(cè)方法：使用ELISA方法檢測(cè)各培養(yǎng)基中的 IFN-γ含量，其操作步驟詳見試劑說明書。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理本次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用%表示，組間數(shù)據(jù)用X2檢驗(yàn)，P<0.05數(shù)據(jù)差異顯著。

2結(jié)果

3組研究對(duì)象的IFN-γ平均值差異顯著，健康測(cè)試者無刺激組的IFN-γ平均數(shù)為（8.5±0.2）ng/L，HBHA組平均值為（50.2±0.01）ng/L；病毒感染測(cè)試者無刺激組的IFN-γ平均值為（13.0±0.02）ng/L，HBHA組平均值為（781.5±4.0）ng/L；結(jié)核病患者無刺激組IFN-γ平均值為（12.2±0.4）ng/L，HBHA組平均值為（7876.8±112.4）ng/L，數(shù)據(jù)對(duì)比差異顯著，P<0.05。

3、討論

據(jù)醫(yī)學(xué)前沿報(bào)告顯示，HBHA是目前具備可靠治療效果的結(jié)核病靶抗原，該物質(zhì)能偶促使患者機(jī)體發(fā)生具有保護(hù)效果的免疫應(yīng)答，從而最大程度降低病毒感染體中荷菌數(shù)量。對(duì)于潛伏期的TB患者HBHA能夠誘導(dǎo)其CD8+T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)特異性反應(yīng)，從而產(chǎn)生諸如IFN-γ等類似細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子不僅能夠起到細(xì)胞毒的作用殺死細(xì)胞和病毒，還能夠與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO殺死細(xì)菌[3]。

本文則主要從HBHA在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行分析，天然的HBHA可以和G肌蛋白進(jìn)行結(jié)合來調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白，位于細(xì)胞表面的HBHA通過控制肌動(dòng)蛋白促使動(dòng)態(tài)細(xì)胞骨架發(fā)生改變，吞噬細(xì)胞便可進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)順利繁殖。相比于傳統(tǒng)的PPD抗原診斷方式，HBHA診斷方法在操作上更加簡(jiǎn)便，另外檢測(cè)耗費(fèi)的時(shí)間更短，檢測(cè)者也不會(huì)出現(xiàn)陽性反應(yīng)的情況。本次實(shí)驗(yàn)中我們將IFN-γ的指標(biāo)作為診斷的參考物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將HBHA抗原刺激后，其分泌量顯著升高，與無刺激組數(shù)據(jù)差異對(duì)比異常顯著，P<0.01；與此同時(shí)，結(jié)核病患者測(cè)試組IOFN-γ分泌量顯著高于健康人組和病毒感染組，數(shù)據(jù)對(duì)比差異顯著P<0.05，顯著提升診斷的準(zhǔn)確率。

綜上所述，在肺結(jié)核疾病的診斷時(shí)以HBHA抗原進(jìn)行刺激后，能夠使得檢測(cè)物質(zhì)分泌量迅速且大量升高，從而診斷提供依據(jù)，提升診斷的準(zhǔn)確率，值得普及應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]張念倫.結(jié)核分枝桿菌黏附素在結(jié)核診斷中的引用分析[J].中外健康文摘， 2012（43）：27-29.

[2]肖佳妮，吳家寶，季萍.抗結(jié)核分枝桿菌蛋白IgA在結(jié)核診斷中的應(yīng)用研究[J].全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)， 2015（05）：67-68.

[3] Diel R， Goletti D， Ferrara G， et al. Interferon-γ release assays for the diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection： a systematic review and meta-analysis[J]. European Respiratory Journal， 2011， 37（1）： 88-99.