應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)快速檢測(cè)基因Ⅱ型諾如病毒的價(jià)值探討

姚秀林

（遼寧省撫順市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 撫順 113006）

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應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)快速檢測(cè)基因Ⅱ型諾如病毒的價(jià)值探討

姚秀林

（遼寧省撫順市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 撫順 113006）

【摘要】目的 研究探討實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)快速檢測(cè)基因Ⅱ型諾如病毒的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 選取2015年4～9月在撫順市中心醫(yī)院收治因食物或懷疑由食物引起的感染性或中毒性就診病例82例，均通過(guò)采集患者糞便提取病毒RNA，并結(jié)合基因Ⅱ型諾如病毒特點(diǎn)采取熒光定量RT-PCR技術(shù)及常規(guī)RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方式對(duì)感染性或中毒性患者進(jìn)行諾如病毒篩查診斷，其診斷檢出率明顯高于常規(guī)RT-PCR方式。結(jié)論 采取實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)基因Ⅱ型諾如病毒具有良好的特異性與敏感度，可針對(duì)病毒標(biāo)本濃度不同進(jìn)行定量檢測(cè)，并能夠?qū)χZ如病毒疑似疫情或病例的快速鑒別診斷。

【關(guān)鍵詞】實(shí)時(shí)熒光定量；RT-PCR技術(shù)；檢測(cè)；基因Ⅱ型諾如病毒

諾如病毒屬于杯狀病毒之一，同時(shí)也是當(dāng)前非細(xì)菌類(lèi)急性胃腸炎疾病主要致病源，可在醫(yī)院、學(xué)校、餐館等人群密集地爆發(fā)急性胃腸炎，通過(guò)對(duì)諾如病毒不斷研究發(fā)現(xiàn)，人群致病諾如病毒大致分為GⅠ、GⅡ、GⅣ3個(gè)基因型，其中統(tǒng)計(jì)表明當(dāng)屬GⅡ型諾如病毒最為高發(fā)［1］。過(guò)去臨床中對(duì)于諾如病毒的檢測(cè)多是通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA或逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR進(jìn)行診斷，但其操作方式較為復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、易產(chǎn)生交叉污染等因素不利于臨床廣泛性篩查，并且在檢出率也尚有不足。而近幾年發(fā)展的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)則通過(guò)定量檢測(cè)病毒，一步完成等優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用。為進(jìn)一步探討實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)快速檢測(cè)基因Ⅱ型諾如病毒的價(jià)值，通過(guò)對(duì)收集的感染性或中毒性病例樣本進(jìn)行不同方式對(duì)照檢測(cè)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2015年4～9月在撫順市中心醫(yī)院收治因食物或懷疑由食物引起的感染性或中毒性就診病例82例，主要臨床表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉（排便≥3次/天）且糞便性狀異常（稀水樣便、黏液便、膿血便）。均通過(guò)直接采集8～10 g糞便樣本置于-70 ℃環(huán)境下保存待檢。

1.2 病毒RNA提取方法：取糞便樣本2 g加入無(wú)菌液震蕩稀釋呈10%懸液，并8000 r/min離心5 min，靜置取上清液100 μL，參照QIAGEN RNeasy Mini Kit提取試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病毒RNA提取，并存放與-70 ℃環(huán)境冰凍保存。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR：cDNA合成：采用江蘇碩世生物科技有限公司生產(chǎn)擴(kuò)增試劑為諾如病毒GⅡ核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置RT-PCR反應(yīng)液。反應(yīng)體系配置：RT-PCR反應(yīng)液7.5 μL，酶混合液5 μL，諾如病毒GⅡ反應(yīng)液4 μL，去RNA酶水3.5 μL，病毒核酸/RNA 5 μL。PCR反應(yīng)檢測(cè)諾如病毒GⅡ型采用引物COG2F/G2-SKR。反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min→95 ℃ 5 min預(yù)變性→95 ℃ 10 s變性55 ℃ 40 s退火、延伸及檢測(cè)熒光45cycle檢測(cè)通道：FAM、VIC。將具有反應(yīng)的病毒RNA樣品建立3個(gè)不同濃度，均采取實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，并均采取五次重復(fù)性反應(yīng)，結(jié)合變異系數(shù)驗(yàn)證方法的重現(xiàn)性。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)重復(fù)性：通過(guò)對(duì)不同濃度的3個(gè)具有反應(yīng)的病毒RNA樣品采取定量PCR檢測(cè)，并均重復(fù)性檢查5次，通過(guò)計(jì)算同一樣本Ct值的差異來(lái)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，見(jiàn)表1。

表1 熒光定量RT-PCR檢測(cè)諾如病毒的重復(fù)性

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)與常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果：通過(guò)對(duì)82例患者糞便標(biāo)本病毒RNA分別采取實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)與常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)，其結(jié)果表明實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)呈陽(yáng)性標(biāo)本檢出率顯著高于常規(guī)RT-PCR方法，詳見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)與常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

諾如病毒基因亞型種類(lèi)復(fù)雜切龐大，并具有極高的變異性，因此在采取PCR技術(shù)檢測(cè)中，需針對(duì)病毒敏感度、特異性指標(biāo)針對(duì)病毒RNA進(jìn)行研究并探討出較為廣譜的引物是極為重要的。目前臨床中RT-PCR方法在檢測(cè)中多將ORF1的聚合酶區(qū)段與ORF2的殼蛋白區(qū)段作為關(guān)鍵性引物與探針進(jìn)檢測(cè)反應(yīng)［2］，而國(guó)外學(xué)者Kageyama［3］通過(guò)針對(duì)諾如病毒RNA特點(diǎn)，選擇ORF1-ORF2交界處的N/S結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)，其引物具有良好的穩(wěn)定性與保守度，尤為適用于諾如病毒基因分型診斷，其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)在該項(xiàng)引物反應(yīng)中具有良好的敏感性和特異性。諾如病毒在爆發(fā)感染后往往具有發(fā)病迅速、傳播范圍廣，特性消失早等問(wèn)題，在面臨臨床診斷時(shí)就要求需在短時(shí)間內(nèi)對(duì)巨大數(shù)量樣品性準(zhǔn)確分析檢測(cè)，其實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)相比與常規(guī)RT-PCR技術(shù)具有更為突出的檢測(cè)敏感性及特異性，同時(shí)前者可采取閉管操作避免樣品交叉感染風(fēng)險(xiǎn)，降低了假陽(yáng)性污染的頑弊，提升檢測(cè)質(zhì)量及效率。并且在熒光探針的作用下增加檢測(cè)靈敏度，簡(jiǎn)化操作步驟，無(wú)需重復(fù)實(shí)施酶切分析、探針雜交或序列測(cè)定等方式來(lái)明確驗(yàn)證結(jié)果。總之實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR較為適用于對(duì)諾如病毒疑似疫情或病例的快速鑒別診斷，值得臨床應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

［1］ 李志凱，蘇國(guó)成，蘇文金，等.諾如病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2014，41（7）:1417-1424.

［2］ 夏體嬌，金敏，陳照立，等.熒光定量RT-PCR檢測(cè)諾如病毒基因Ⅱ型方法的建立和評(píng)估［J］.解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，31（3）:200-203.

［3］ Kageyama T，Koji ma S，Shinohara M，et al.Broadlyreactive and highlysensitive assayfor Norwalk-like viruses based on real-ti me quantitative reverse transcription-PCR［J］. J Clin Microbiol，2003，41（4）:1548-1557.

中圖分類(lèi)號(hào)：R45

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-8194（2016）03-0179-01