水稻bHLH轉錄因子Os11g39000的功能研究

劉選明 彭玉沖 楊遠柱 李懿星++夏妙林 王文文++林建中

摘要：水稻Os11g39000 為非典型的bHLH家族成員，其功能尚不清楚.酵母雙雜交實驗表明，轉錄因子Os11g39000可以形成同源蛋白聚合體.隨機結合位點篩選實驗表明，轉錄因子Os11g39000可以與DNA結合，并且其結合位點初步確定為TT/CG/CACC/GT/C.Os11g39000基因的組織表達模式分析發現，Os11g39000基因主要在葉片和根中表達，推測該基因可能在葉和根的發育調控中發揮作用.水培實驗發現，該基因功能缺陷型轉基因株系的根長顯著短于野生型，表現出明顯的根部發育缺陷，表明Os11g39000在水稻根的發育中起調控作用.QPCR分析進一步證明，功能缺陷型轉基因植株體內生長素合成和信號轉導相關基因表達量顯著上升，表明轉錄因子Os11g39000參與了水稻生長素的合成和信號轉導的調控.

關鍵詞：水稻；bHLH轉錄因子；Os11g39000；生長素

中圖分類號：S601 文獻標識碼：A

轉錄因子（tarnscription factor， TF）是能夠與目的基因上游特定DNA序列結合的蛋白質，又被稱為反式作用因子，通過與順式作用元件相互作用，從而保證目的基因以特定強度在特定時間與空間表達的蛋白質分子[1].bHLH（basic HelixLoopHelix， 堿性螺旋環螺旋）轉錄因子是真核生物蛋白質中的一個大家族，其成員在動植物界行使著多種重要的功能.例如，一個bHLH蛋白BPEp可以通過與生長素應答因子ARF8相互作用調控擬南芥花蕊的早期發育[2].研究發現bHLH在光敏色素的信號轉導，細胞分化，應答油菜素內酯的基因表達等過程中都起著重要作用[3-5].

典型的bHLH結構域包含大約60個氨基酸，由位于bHLH結構域N端能夠結合DNA的basic區域和HLH區域組成[6].HLH區域包含兩個α螺旋，通過它們bHLH蛋白可以相互作用，形成同源或者異源蛋白聚合體[1， 7-8].一類以人類Id蛋白為代表缺少basic區域的HLH蛋白雖然不能夠與DNA直接相互作用，但是可以通過與其它bHLH蛋白的HLH區域形成特異的異源蛋白聚合體來抑制相應bHLH轉錄因子的活性[9-10].通過抑制像E這樣的bHLH蛋白，從而在細胞分化和發育過程中起到關鍵作用[11].在擬南芥中，發現一個HLH蛋白KIDARI，通過與一個在光調控過程中起作用的bHLH轉錄因子相互作用來抑制該轉錄因子活性，從而調控植物生長發育[12].

隨著水稻全基因組測序的完成，利用生物信息學分析發現，水稻中包含有167個bHLH轉錄因子，絕大多數成員功能未知.有研究表明，bHLH家族在水稻生長發育過程中起著關鍵作用，如Zhang[13]等發現一對參與BR下游的bHLH基因ILI1和PRE1可以通過形成異源二聚體的形式參與調控與BR相關的基因的表達.ili1的水稻突變體表現出與使用BR處理時相同的葉片傾角的表型，過表達和RNA干擾的ILI1轉基因水稻株系都分別表現出了葉片傾角增加和減小的相反表型.ILI1和PRE1的相互作用導致了水稻葉片的直立.因此該家族蛋白功能的揭示將有助于豐富和完善水稻基因功能調控網絡.

本研究選取了一個水稻非典型的bHLH基因家族成員Os11g39000 基因進行了初步的功能研究，發現轉錄因子Os11g39000可以以同源蛋白聚合體的形式結合DNA，從而實現生長素（IAA）信號轉導，調節下游基因的表達，最終實現對水稻根部生長發育的調控.

1材料與方法

1.1生物信息學分析

利用TIGR（http：//tigrblast.tigr.org/tgi， Rice Genome Annotation Project）和NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov， National Center for Biotechnology information）數據庫獲得Os11g39000全長CDS序列、氨基酸序列及啟動子序列.通過基于隱馬科夫模型的蛋白質結構域分析數據庫SMART（http：//smart.emblheidelberg.de， Simple Modular Architecture Research Tool）對Os11g39000氨基酸序列比對分析，獲得Os11g39000蛋白的結構域類型.同時，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數據庫對Os11g39000起始密碼子ATG上游1 500 bp的啟動子序列進行分析，預測該基因啟動子區域所存在的調控元件，根據調控元件推測其可能的調控途徑.

1.2載體構建與功能缺陷型轉基因株系的獲得

以粳稻品種日本晴的cDNA為模板，利用Gateway方法，設計含有attB接頭的引物（F：5'CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGTCGAGCCGGCG3'； R： 5'CAAGAAAGCTGGGTCTTACATGAGTAGGCTACGGATGAGG3'），PCR克隆目的片段.PCR反應程序為：98 ℃， 5 min；98 ℃，10 s；58 ℃，15 s；72 ℃，20 s；共35個循環.利用BP ClonaseII （Invitrogen）經BP重組反應將PCR產物克隆到入門載體pDONR/Zeo，測序正確后，利用LR ClonaseII （Invitrogen）將Os11g39000克隆到玉米Ubiquitin啟動子驅動表達的pCAMBIA1301GWEAR表達載體中，得到N端添加轉錄抑制基序EAR的合成型轉錄因子[14]，并抑制目標轉錄因子的轉錄活性.

根據林建中等的水稻轉化方法[15]，將重組的pCAMBIA1301GWEAROs11g39000質粒經過電擊法轉入農桿菌，通過農桿菌侵染水稻粳稻品種Kitaake的愈傷組織，獲得功能缺陷型轉基因株系Ubi：：EAROs11g39000.

1.3酵母雙雜交

pGADT7Os11g39000重組質粒能夠編碼融合Os11g39000和GAL4激活域的蛋白，pGBKT7Os11g39000重組質粒能夠編碼融合Os11g39000和GAL4結合域的蛋白，將兩個重組質粒按照酵母手冊進行酵母轉化，涂布于SD/Leu/Try平板上培養.28 ℃培養2～3 d，挑選4～5個單克隆用無菌水混勻后涂布于SD/Leu/Try/His平板上，分析結果.為了進一步檢測相互作用的真實性，同時參照COLONTECH說明書進行濾紙顯色實驗.

1.4蛋白表達和隨機結合位點篩選

根據Liu等[14]的蛋白誘導純化方法，分別將pGEX4T1Os11g39000和pGEX4T1質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3），誘導表達.離心收集菌體，超聲破碎，離心，谷胱甘肽瓊脂糖珠（Ferments）親合純化蛋白，SDSPAGE檢測.將已純化的重組蛋白保存，用于后續隨機結合片段篩選實驗.

根據Blackwell的方法[16]，使用引物RBSS4和CPDF4進行PCR擴增，得到雙鏈隨機DNA片段并與結合目的蛋白的谷胱甘肽瓊脂糖珠室溫孵育10 min.使用DNA結合緩沖液洗滌離心，重復5次，最后加入30 μL蛋白洗脫緩沖液，洗脫后離心取上清為模板，PCR擴增目的片段，正向引物為RBSS3，反向引物為CPDF4，瓊脂糖凝膠電泳觀察結果.重復6～8次，直到擴增出目的條帶，然后將擴增片段克隆至pMD18T載體（TaKaRa），測序.測序結果使用在線分析工具分析（http：//weblogo.berkeley.edu/）.引物見表1.

1.5植物材料種植、激素處理及取材設置

參照Lin等[17]水稻種子催芽及種植方法，用3%次氯酸鈉溶液對水稻種子表面消毒，37 ℃下種子吸脹處理48 h，28 ℃恒溫培養箱催芽48 h.待種子露白后，用1∶1 000濃度的潮霉素（Hyg）溶液對種子進行初篩，然后將陽性植株轉入1/2 MS培養液置于恒溫培養箱中（28 ℃，光照16 h/黑暗8 h）.

參照Song等[18]檢測基因時空表達的取材方法，分別對營養生長期和生殖生長期的水稻材料進行取材.營養生長期的水稻材料取自溫室生長20 d的野生型水稻日本晴，分別取根、莖和葉3部分；生殖生長期的水稻材料取自大田內灌漿時期的野生型水稻日本晴，分別取根、莖、葉、節間、葉鞘和幼穗等組織材料.液氮速凍，-80 ℃低溫保存.

參照Li等[19]植物生長素誘導基因表達檢測的方法， 將正常條件生長10 d的日本晴幼苗，轉入含有10 μmol/L生長素的水培溶液中，分別處理0，1，3，6和12 h并取材，-80 ℃保存.設置生長素濃度梯度為0，10-8，10-7，10-6和10-5 mol/L分別處理野生型材料Kitaake和功能缺陷型轉基因材料，處理7 d后觀察表型并統計分析.

1.6實時熒光定量PCR分析

按照RNAeasy Mini Kit （TaKaRa）試劑盒說明提取總RNA，然后利用Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit （TaKaRa）合成cDNA，用于實時定量PCR分析.利用Ferments 定量試劑盒（Ferments），Mx3000P儀器 （Stratagene）進行PCR分析.實時熒光定量PCR反應程序為：95 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；45個循環.實驗重復3次，以持家基因OsACTIN1為內參，Mx3000P軟件分析檢測基因的相對表達水平.定量PCR引物見表2.

2結果

2.1生物信息學分析與基因克隆

根據TIGR和NCBI數據庫的序列信息，設計引物，以水稻cDNA為模板克隆出和預測分子量大小相似的DNA片段（圖1（a））.測序發現該片段的序列和數據庫中預測相同，命名為Os11g39000.該基因的編碼序列含有306個核苷酸，編碼含102個氨基酸序列的蛋白質.利用蛋白質結構域分析數據庫SMART對Os11g39000蛋白結構進行分析，發現Os11g39000蛋白在第19～63個氨基酸區域包含一個HLH保守結構域（圖1（b）），但是并沒有結合DNA的basic區域，因此Os11g39000是一個非典型的bHLH蛋白，單個的Os11g39000蛋白不能夠直接結合DNA片段.有研究表明bHLH蛋白可以通過HLH結構域形成同源或異源聚合體行使功能[7-8].因此推測該蛋白可能是以蛋白聚合體的形式行使功能.

2.2Os11g39000蛋白與自身的相互作用

為了探究該編碼蛋白能夠形成同源蛋白聚合體，進行了酵母雙雜交實驗.首先構建了pGADT7Os11g39000重組質粒和pGBKT7Os11g39000重組質粒，然后將重組質粒共轉入AH109酵母中，同時用共轉pGADT7Os11g39000/pGBKT7，pGADT7/ pGBKT7Os11g39000和pGADT7/pGBKT7載體的酵母作為陰性對照，涂布于含有10 mmol/L 3AT的SD/Leu/Try固體平板，以及于含有10 mM 3AT的SD/Leu/Try/His固體平板.結果顯示只有共轉入pGADT7Os11g39000/ pGBKT7Os11g39000的酵母在含有10 mmol/L 3AT的SD/Leu/Try/His固體平板上繼續生長.濾紙顯色實驗也發現只有共轉入pGADT7Os11g39000和pGBKT7Os11g39000重組質粒的酵母可以顯色（圖2（a）），說明Os11g39000蛋白可以形成同源蛋白聚合體.

2.3Os11g39000蛋白的DNA隨機結合位點篩選

酵母雙雜交實驗證明Os11g39000蛋白可以形成同源蛋白聚合體，為了進一步驗證Os11g39000蛋白形成的同源蛋白聚合體是否可以與DNA直接相互作用，構建了pGEX4T1Os11g39000重組質粒.將重組質粒通過熱激法轉化入大腸桿菌BL21（DE3）并成功誘導純化了GSTOs11g39000重組蛋白（圖2（b））.DNA隨機結合位點篩選實驗.結果顯示，該蛋白可以通過形成同源蛋白聚合體與DNA片段直接相互作用，且直接結合的DNA片段為TT/CG/CACC/GT/C（圖2（c））.表明該蛋白可以通過HLH區域相互作用形成同源蛋白聚合體結合特定DNA片段，從而行使調控下游基因表達的功能.

2.4Os11g39000在水稻不同組織器官中的表達

基因的時空表達模式可以為預測和研究其生物學功能提供參考依據.實時定量PCR分析Os11g39000基因在水稻不同組織器官中的相對表達量，表明該基因在苗期和抽穗期都主要在葉和根表達，其它的組織器官表達量極少（圖3（a），（b）），推測該基因可能參與植物根和葉的生長發育調控.

2.5轉基因植物鑒定與表型分析

利用嵌合抑制因子基因沉默技術[14，20]（chimeric repressor genesilencing technology CREST）及Gateway技術獲得了pCAMBIA1301GWEAROs11g39000重組質粒（圖4（a））.通過農桿菌侵染水稻Kitaake愈傷組織的方法，得到Os11g39000轉錄抑制型的轉基因株系，即該轉錄因子的功能缺陷型轉基因株系.通過DNA和RNA水平上的分子鑒定（圖4（b），（c）），篩選出2個陽性功能缺陷型轉基因株系Ubi：：EAROs11g3900010和Ubi：：EAROs11g3900011.水培實驗表明，轉基因株系Ubi：：EAROs11g3900010和Ubi：：EAROs11g3900011的根長比野生型的短，表現為明顯的根部發育缺陷（圖4（c），（d））.該結果表明，當抑制Os11g39000的轉錄活性時嚴重干擾了水稻根部的正常生長發育，說明Os11g39000基因參與了水稻根部發育的調控.

2.6生長素對Os11g39000的表達調控

研究表明，生長素對植物根部發育具有顯著影響[21].利用Plant CARE數據庫對Os11g39000基因起始密碼子ATG上游1 500 bp的啟動子序列進行分析，發現該基因啟動子-792 bp處含有一個生長素應答元件（圖5（a）），推測該基因功能可能與生長素有關.實時熒光定量PCR分析表明，隨著生長素處理時間的延長，該基因表達量持續升高（圖5（b）），表明該基因表達受到生長素誘導.同時，不同濃度生長素對野生型Kitaake和轉基因株系Ubi：：EAROs11g3900010和Ubi：：EAROs11g3900011處理7 d發現，隨著生長素濃度的升高，野生型根長受到明顯抑制，而轉基因株系根長沒有明顯變化（圖5（c），（d）），表現為對生長素不敏感，即抑制轉錄因子Os11g39000的轉錄活性干擾了植物對生長素的響應，暗示該基因參與了生長素的相關途徑.

為了進一步探究該基因對生長素生物合成、信號轉導和極性運輸途徑的影響，選取這些途徑中的相關基因，檢測其表達量.結果表明，在功能缺陷型轉基因株系中，生長素信號轉導相關基因OsARF23，OsARF24和生長素合成相關基因OsYUCCA1，OsYUCCA4的表達量顯著提高（圖6（a），（b））；生長素極性運輸相關基因OsPIN1b和OsPIN2表達量沒有明顯變化（圖6（c））.該結果說明，Os11g39000基因的功能缺陷主要影響了生長素的信號傳導和生物合成途徑，而對于生長素的極性運輸并沒有顯著影響，推測Os11g39000參與了生長素合成與顯著信號轉導的調控.

3討論

bHLH蛋白通常通過HLH區域相互作用形成同源或異源蛋白聚合體行使對下游基因的調控[8].本研究發現，Os11g39000蛋白不能直接結合DNA的basic區域（圖1（b）），但Os11g39000蛋白可以通過形成同源蛋白聚合體來直接結合DNA片段，從而調控下游基因表達（圖2（a）～（c））.同時通過DNA隨機結合位點篩選實驗分析了該基因的直接DNA結合位點TT/CG/CACC/GT/C（圖2（c）），為深入研究Os11g39000蛋白的生理功能提供了重要線索.

分析基因在植物不同組織器官中的表達可以對該基因行使的功能進行預測[22].通過QPCR分析發現Os11g39000基因主要在水稻葉和根中表達（圖3（a），（b）），暗示該基因可能參與植物葉和根的發育.水培實驗發現，功能缺陷型轉基因株系的根相對于野生型明顯變短（圖4（d），（e）），證實了該基因在根發育過程中起作用.但葉片中我們沒有發現明顯差異，對于該結果還有待進一步研究.

bHLH基因家族在動植物界廣泛存在且行使多種多樣的功能，已知 PIF3，PIF4，HFR1在光敏色素信號傳導中起作用，SPT和ALC與雌蕊發育有關，AMS在花粉粒發育中起作用，AtMYC2與脫落酸誘導的基因表達有關[23].植物激素是調控植物生長發育的重要因子.生長素影響植物生長發育的各個方面，包括細胞分裂與生長，細胞分化，頂端優勢，根的向地性等[24].本研究通過Plant CARE對Os11g39000基因的啟動子順式元件進行分析，結果顯示該基因啟動子區域存在生長素響應元件（圖5（a））.Os11g39000基因的表達受到生長素誘導并且隨著生長素處理時間的延長，該基因的表達量顯著提高（圖5（b））.不同濃度的生長素對轉基因株系處理發現其根長對生長素不敏感（圖5（c），（d）），說明該基因的表達受到生長素的調控.為了進一步研究該基因對生長素途徑的影響，對功能缺陷型轉基因株系中生長素的相關基因進行定量分析，發現與生長素信號轉導和合成相關的基因表達量顯著提高（圖6（a），（b）），表明抑制轉錄因子Os11g39000的轉錄活性主要影響了生長素的信號轉導和合成途徑.這些結果表明，Os11g39000是生長素對植物調節途徑中的相關基因，為進一步闡明Os11g39000的作用機理奠定了良好的基礎.

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