RP-HPLC法同時測定芍棗膠囊中3種主要成分的含量

王羽凝，穆麗華，王 石，魏沛沛，王 茹，劉 屏（.解放軍總醫院外科臨床部，北京 008；.解放軍總醫院臨床藥理研究室，北京 008；.解放軍醫學院，北京 008；.蚌埠醫學院，安徽 蚌埠 00；.解放軍總醫院門診藥房，北京 008）

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·實驗研究·

RP-HPLC法同時測定芍棗膠囊中3種主要成分的含量

王羽凝1，穆麗華2，王 石3，魏沛沛4，王 茹5，劉 屏2（1.解放軍總醫院外科臨床部，北京 100853；2.解放軍總醫院臨床藥理研究室，北京 100853；3.解放軍醫學院，北京 100853；4.蚌埠醫學院，安徽 蚌埠 233003；5.解放軍總醫院門診藥房，北京 100853）

[摘要]目的：建立同時測定芍棗膠囊中3種主要成分的RP-HPLC方法。方法：采用RP-HPLC 法，選用Kromasil C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動相：乙腈（A）和水（B）；洗脫梯度：0～10 min 10%～19% A，10～16 min 19%～20% A，16～22 min 20%～90% A，22～25 min 90% A，25～25.1 min 90%～10% A，25.1～35 min 10% A；流速：0.8 mL·min-1。Alltech 2000ES ELSD檢測器，漂移管溫度：115 ℃，空氣流速3.3 L·min-1。結果：結果表明芍藥苷，斯皮諾素，3,6'-二芥子酰基蔗糖的檢測分別在0.975～5.850 μg，0.060～0.660 μg，0.100～0.600 μg范圍內線性關系良好。上述3種成分的平均回收率（n = 9）分別為99.5% （RSD 0.69%），100.2%（RSD 1.03%），99.9%（RSD 1.20%）。結論：該方法操作簡單、結果準確，具有較好的重復性和穩定性，為芍棗膠囊的質量控制提供理論參考。

[關鍵詞]芍棗膠囊；芍藥苷；斯皮諾素；3,6'-二芥子酰基蔗糖；反相高效液相色譜法

1　儀器與試藥

Hitachi高效液相色譜儀（日本日立公司），Alltech 2000ES蒸發光散射檢測器（美國奧泰公司）、梅特勒-托利多AG285型電子天平（瑞士梅特勒公司），KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。芍藥苷對照品（純度：98%，批號110736-201539），斯皮諾素對照品（純度：98%，批號111869-201203）均購自中國食品藥品檢定研究院；3,6'-二芥子酰基蔗糖對照品（解放軍總醫院藥理室自制，純度> 98%）。芍棗膠囊（解放軍總醫院自制，規格：0.34 g）。乙腈為色譜純，水為超純水；其他試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1溶液的配制

2.1.1對照品溶液 分別精密稱取芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子酰基蔗糖對照品適量，分別甲醇溶解，配制成芍藥苷0.195 g ·L-1、斯皮諾素0.030 g·L-1、3,6'-二芥子酰基蔗糖0.050 g·L-1，各標準品取適量體積混合作為混合對照品,混合后芍藥苷的濃度為0.039 g·L-1，斯皮諾素0.012 g ·L-1，3,6'-二芥子酰基蔗糖0.020 g·L-1。

2.1.2供試品溶液 精密稱定本品內容物0.300 0 g，加入70%乙醇適量，加熱回流2 h，濾過，濾渣甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液經0.45 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.1.3陰性對照溶液 按處方中藥味的比例，分別稱取除白芍、酸棗仁、遠志外的其他藥材，按照芍棗膠囊的制備工藝和供試品溶液的制備方法分別制備白芍、酸棗仁、遠志的陰性對照溶液。

2.2色譜條件

Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）和水（B）；洗脫梯度：0～10 min 10%～19% A，10～16 min 19%～20% A，16～22 min 20%～90% A，22～25 min 90% A，25～25.1 min 90%～10% A，25.1～35 min 10% A；流速：0.8 mL ·min-1。Alltech 2000ES ELSD檢測器，漂移管溫度：115 ℃；空氣流速：3.3 L·min-1；進樣量：10 μL。

按照上述色譜條件進行測定，結果顯示芍藥苷，斯皮諾素，3,6'-二芥子酰基蔗糖的色譜峰得到很好的分離，陰性對照品對樣品測定無干擾，待測組分與相鄰組分均達到基線分離，各成分理論塔板數不低于3000，分離度良好，詳見圖1。

圖1　HPLC 色譜圖A–芍棗膠囊供試品，B–對照品，C–白芍陰性對照，D–酸棗仁陰性對照，E–遠志陰性對照；1–芍藥苷，2–斯皮諾素，3–3,6'-二芥子酰基蔗糖Fig 1 HPLC ChromatogramsA–sample, B–reference substance, C–Baishao negative control, D–Suanzaoren negative control, E–Yuanzhi negative control; 1–paeoniforin，2 - spinosin，3 - 3，6'-disinapoyl sucrose

2.3線性關系考察

按“2.2”項下色譜條件，分別精密吸取芍藥苷對照品溶液5、10、15、20、25、30 μL，斯皮諾素對照品溶液2、6、10、14、18、22 μL，3,6'-二芥子酰基蔗糖對照品溶液2、4、6、8、10、12 μL注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以進樣量的常對數為橫坐標（X），以峰面積的常對數為縱坐標（Y），計算芍藥苷、斯皮諾素和3,6'-二芥子酰基蔗糖的回歸方程分別為Y = 0.996 X + 5.435，r = 0.999 9；Y = 1.009 X + 4.305，r = 0.999 9；Y = 1.007 X + 4.824，r = 0.998 9。結果表明，芍藥苷，斯皮諾素，3,6'-二芥子酰基蔗糖分別在0.975～5.850 μg，0.060～0.660 μg，0.100～0.600 μg范圍內線性關系良好。

2.4精密度實驗

精密吸取同一濃度的對照品溶液10 μL，按“2.2”項下色譜條件，重復進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子酰基蔗糖峰面積的RSD分別為0.71%、0.94%、0.86%，表明儀器精密度良好。

2.5穩定性實驗

按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件，分別在0、2、8、12、24 h進樣10 μL，記錄峰面積。結果顯示，芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子酰基蔗糖峰面積的RSD分別為0.92%、1.21%、1.63%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.6重復性實驗

精密稱取芍棗膠囊6份，按“2.1.2”項下制備供試品溶液6份，分別按“2.2”項下色譜條件，分別進樣10 μL，記錄峰面積并計算含量。結果顯示，芍藥苷、斯皮諾素和3,6'-二芥子酰基蔗糖平均含量分別為23.602、0.880、0.621 mg·g-1，RSD分別為1.32%、0.91%、1.26%，表明該方法重復性良好。

2.7加樣回收率實驗

精密稱取9份已知含量的同一批芍棗膠囊，分別加入適量芍藥苷、斯皮諾素和3,6'-二芥子酰基蔗糖對照品溶液，按“2.1.2”項下制備供試液，進樣10 μL，記錄峰面積，計算各對照品的加樣回收率。結果表明，芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子酰基蔗糖的平均回收率分別為99.5%、100.2%、99.9%，RSD分別為0.69%、1.03%、1.20%。詳見表1。

2.8樣品含量測定

按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別對4批次芍棗膠囊中芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子酰基蔗糖的含量進行分析，記錄色譜峰面積，根據回歸方程計算各組分含量，詳見表2。

3　討論

3.1色譜條件選擇

芍棗膠囊中的芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子酰基蔗糖的最大紫外吸收波長差別較大，使二極管陣列檢測器很難同時測定3種主要成分，而蒸發光散射檢測器為質量型檢測器，流動相在檢測前即已蒸發，因此提高了其基線的穩定性和檢測的準確性。本課題組曾嘗試采等度洗脫，但分離效果不夠理想，在篩選了多個梯度流動相之后，最終選定乙腈（A）和水（B）作為流動組，洗脫梯度：0～10 min 10%～19% A；10～16 min 19%～20% A；16～22 min 20%～90% A；22～25 min 90% A；25～25.1 min 90%～10% A；25.1～35 min 10% A。在此色譜條件下，色譜圖結果顯示基線平穩，雜質峰少，分離度良好。霧化氣體流速和漂移管溫度是蒸發光散射檢測器的兩個重要可調節參數。實驗中經過反復、仔細調節參數，得到了最優信噪比及平穩基線。

表1　芍棗膠囊加樣回收率實驗結果. n = 9Tab 1 Results of recovery test of Shaozao capsules. n = 9

表2　芍棗膠囊樣品含量測定結果. mg·g-1Tab 2 Content determination of Shaozao capsules sample. mg·g-1

3.2提取方法考察

提取方法的選擇對比了超聲和回流提取方法，結果顯示加熱回流提取法的效果更佳，并且耗時短、操作方便。溶媒的選擇考察了甲醇、95%乙醇、70%乙醇、水，結果顯示70%乙醇提取效果最好。隨后考察了溶劑量（1∶10，1∶50，1∶100）和提取次數，結果表明，50倍量的70%乙醇，加熱回流提取2 h，可提取完全。

3.3結果分析

含量測定結果表明，不同批次之間相同指標成分含量差異不明顯，表明提取工藝穩定、可靠。本研究建立了同時測定芍棗膠囊中芍藥苷、斯皮諾素、3,6'-二芥子酰基蔗糖的反相高效液相色譜測定方法，為芍棗膠囊的質量控制提供了理論參考。

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Determination of three main constituents in Shaozao capsules by RP-HPLC

WANG Yu-ning1, MU Li-hua2, WANG Shi3, WEI Pei-pei4, WANG Ru5, LIU Ping2(1. Clinical Surgery Division, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2. Department of Clinical Pharmacology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 3. Medical School of Chinese PLA, Beijing 100853, China; 4. Faculty of Pharmacy, Bengbu Medical College, Bengbu 233003, China; 5. Outpatient Pharmacy, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

[ABSTRACT]Objective: To establish the quantitative method of three main constituents in Shaozao capsules by RPHPLC method. Methods: The separation was performed on Kromasil C18column （4.6 mm × 250 mm，5 μm） by RP-HPLC method. The mobile phase consisted of acetonitrile (A) and water (B), elution gradient was as follows: 0–10 min 10%–19% A; 10–16 min 19%–20% A; 16–22 min 20%–90% A; 22–25 min 90% A; 25–25.1 min 90%–10% A; 25.1–35 min 10% A. The flow rate was 0.8 mL ·min-1. The detector was Alltech 2000ES ELSD. The temperature of drift tube was 115 ℃ and the air flow rate was 3.3 L·min-1. Results: The linear ranges of the three components were 0.975–5.850 μg (paeoniflorin), 0.060–0.660 μg （spinosin） and 0.100–0.600 μg （3，6'-disinapoyl sucrose) respectively. The average recoveries of the above three components in Shaozao capsules were 99.5% (RSD 0.69%), 100.2% (RSD 1.03%), 99.9% (RSD 1.20%) respectively. Conclusion: The method was reliable, simple, and precise, which was suitable for quality control of Shaozao capsules.

[KEY WORDS]Shaozao capsules；Paeoniforin；Spinosin；3，6'-disinapoyl sucrose; RP-HPLC

[中圖分類號]R917

[文獻標識碼]A

[文章編號]1672–8157(2016)02–0077–04

[基金項目]軍隊“十二五”中醫藥推廣研發項目（10ZYZ141）

[通信作者]劉屏，女，研究員，主要從事中藥化學和中藥藥理研究。E-mail：liuping301@126.com

[作者簡介]王羽凝，女，主管藥師，主要從事中藥藥理和中藥化學研究。E-mail：sunny_5087@163.com

收稿日期：（2015-11-21 修回日期：2016-01-12）