HPLC法與CMIA法監測癲癇患者血漿中苯巴比妥濃度的一致性評價

錢 釗，郭美華，陳 巖，魯 靜，曲 婷，段麗娟，海 鑫（哈爾濱醫科大學附屬第一醫院藥學部，黑龍江 哈爾濱 150001）

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HPLC法與CMIA法監測癲癇患者血漿中苯巴比妥濃度的一致性評價

錢 釗，郭美華，陳 巖，魯 靜，曲 婷，段麗娟，海 鑫（哈爾濱醫科大學附屬第一醫院藥學部，黑龍江 哈爾濱 150001）

[摘要]目的：建立高效、實用的癲癇患者苯巴比妥藥物濃度監測方法，評價高效液相色譜（HPLC）法與化學發光微粒子免疫（CMIA）法的相關性和一致性。方法：分別采用HPLC法和CMIA法監測55例癲癇患者血漿中苯巴比妥的藥物濃度，利用Passing-Bablok回歸法、配對t檢驗法和Bland-Altman法分析，考察兩種方法的相關性及一致性。結果：以兩種方法的測定結果作回歸方程為Y = 1.024 1 X + 0.349 2（r = 0.988，n = 55），顯示兩種方法相關性良好；配對t檢驗（P > 0.05）和Bland-Altman法分析結果表明二者的一致性良好。結論：HPLC法和CMIA法監測癲癇患者血漿中苯巴比妥的藥物濃度具有較好的相關性與一致性，可以相互替代，均可用于臨床監測治療藥物濃度。

[關鍵詞]高效液相色譜法；化學發光微粒子免疫法；苯巴比妥；治療藥物濃度監測；一致性

癲癇是一種常見的、慢性的神經系統疾病。苯巴比妥（phenobarbital，PB）是一種非選擇性的中樞神經系統鎮靜劑[1]，是臨床上常的廣譜抗癲癇藥物，于癲癇大發作和部分性發作的治療，對兒童的抗癲癇治療有效[2]，是新生兒癲癇的一線藥[3]。但其治療窗較窄（15～40 μg·mL-1），毒副作大，其毒性與血藥濃度具有密切相關性，因此在臨床應過程中，應加強對該藥治療藥物濃度監測，以便達到最佳的治療效果[4]。目前，文獻報道監測苯巴比妥血藥濃度常的方法有以下幾種：高效液相色譜（HPLC）法[4-6]、熒光偏振免疫分析（FPIA）法[7]、液相色譜串聯質譜（LC-MS）法[8-9]、化學發光微粒子免疫（CMIA）法[10-11]等。CMIA法是基于免疫反應原理和化學發光原理的化學發光免疫分析方法，具有自動化程度高和靈敏度高等特點，在甲狀腺功能、腫瘤標志物、藥物檢測等方面應廣泛[12]，適合臨床常規監測，但試劑盒價格昂貴，不適于小樣本量的應。HPLC法已廣泛應于臨床藥物濃度的監測[4-6,13-14]，是藥物分析中常規的方法。由于不同的藥物濃度監測方法之間測定結果差異大，給臨床治療評價帶來諸多不便，本研究以CMIA法為對照，采HPLC法監測癲癇患者血漿中苯巴比妥的藥物濃度，并評價二者的相關性及一致性。

1　儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Architect i2000SR全自動化學發光免疫分析儀，D-37520高速離心機（美國Abbott公司）；Vortex Genius 3漩渦混合器（德國IKA公司）；XS205DU電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-600數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

苯巴比妥對照品（PB，中國食品藥品檢定研究院，批號171222-200605），苯妥英對照品（PT，中國食品藥品檢定研究院，批號101187-201001）。甲醇為色譜純，水為超純水，其他為分析純。

患者血漿收集自2014年7月–2015年7月哈爾濱醫科大學附屬第一醫院應苯巴比妥的55例癲癇患者（年齡2個月～61歲），空腹抽取穩態谷濃度血樣3 mL，渦旋混勻1 min，6000 r· min-1離心5 min，分離血漿，分成2份，一份于當日CMIA法測定，另一份于–40 ℃低溫冰箱保存備，每月統一HPLC法測定。空白血漿由志愿者提供。所有血漿樣品均經哈爾濱醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審定批準應。

2　方法與結果

2.1HPLC法

2.1.1色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（47∶53）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：215 nm，240 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

2.1.2樣品的處理 取苯巴比妥對照品，精密稱取10 mg，適量甲醇配成濃度為1 000.0 μg ·mL-1的苯巴比妥對照品儲備液。依次甲醇稀釋得到濃度為1 000.000、500.000、250.000、125.000、62.500、31.250、15.625 μg·mL-1的系列濃度甲醇標準液。取50 μL上述系列濃度甲醇標準液，各加入450 μL空白血漿后渦旋混勻，即得對照品血漿系列樣品。同法配制質量控制（QC）儲備液（1 000 μg·mL-1），于4 ℃冷藏。取苯妥英對照品，精密稱取9 mg，適量甲醇配成濃度為900 μg·mL-1的儲備液。

取血漿200 μL，加入50 μL內標液（苯妥英），渦旋30 s，加入600 μL甲醇，渦旋120 s，離心5 min （15 000 r·min-1，4 ℃），取上清，0.22 μm濾膜過濾后待分析。

2.1.3專屬性考察 分別取空白血漿、空白血漿含苯巴比妥標準品、空白血漿含內標液、空白血漿含苯巴比妥標準品及內標液、患者服藥后血漿樣品+內標液，采“2.1.2”項下方法處理后進樣20 μL。獲得色譜圖，見圖1。樣品分離度及峰形良好，內源性雜質不干擾苯巴比妥的定量。

圖1　高效液相色譜圖A–空白血漿，B–空白血漿+苯巴比妥標準品，C–空白血漿+內標液，D–空白血漿+苯巴比妥標準品+內標液，E–患者血漿+內標液；1–苯巴比妥，2–內標（苯妥英）Fig 1 HPLC chromatogramsA–blank plasma, B–blank plasma with phenobarbital, C–blank plasma with internal standard, D–blank plasma with phenobarbital and internal standard, E–the patient's plasma samples with internal standard; 1–phenobarbital, 2–internal standard (phenytoin)

2.1.4標準曲線的繪制 取對照品血漿系列樣品，按“2.1.2”方法處理分析，以苯巴比妥峰面積/內標峰面積之比（Y）對苯巴比妥濃度（X）的回歸方程為：Y = 0.019 4 X + 0.009 2（r = 0.999，n = 7）。線性范圍為1.56～100.00 μg·mL-1，線性關系良好。

表1　穩定性實驗結果Tab 1 Results of the stability test

2.1.9患者血漿測定 取待測血漿，按“2.1.2”項下方法進行前處理和上機分析，相應的標準曲線計算患者血漿樣品中苯巴比妥的含量。

2.2CMIA法

2.2.1CMIA法原理[12]（Architect 苯巴比妥測定試劑盒說明書）吖啶酯標記的苯巴比妥分子作為酶競爭物，苯巴比妥抗體包被的順磁微粒子作為捕獲物。檢測樣品時，將樣本、苯巴比妥抗體包被的順磁微粒子和吖啶酯標記的苯巴比妥結合物混合，制成反應混合物。苯巴比妥抗體包被的微粒子與樣本中的吖啶酯標記的苯巴比妥結合物結合。沖洗后，將預激發液和激發液加入到反應混合物中，產生化學發光反應。測量產生的化學發光反應，以相對發光單位（RLUs）表示。

2.2.3性能指標的評估 CMIA法的精密度、回收率、線性、靈敏度、特異性等性能指標均按照Architect系統操作手冊執行，結果表明均符合測定要求。

2.2.4患者血樣測定 常規采血后，分離血漿，按照儀器標準操作規范測定，儀器自行取樣、分析測定,每批血漿樣本測定時需進行質控樣品的平行測定。

2.3兩種檢測方法的比較

2.3.1方法 CMIA法作為對照比較的檢測系統，HPLC法作為待評價系統，以兩種檢測方法系統可重復性良好為前提。應MedCalc（醫學統計軟件-英文版），采相關分析、配對t檢驗和Bland-Altman法對兩種方法的一致性進行評價。P < 0.05為差異有統計學意義。

2.3.3一致性分析 配對t檢驗：將測試樣品苯巴比妥的HPLC法和CMIA法測定結果進行配對t檢驗，該藥物血清濃度的HPLC法和CMIA法測定結果在統計學上無顯著性差異（P > 0.05）。

將兩組測定值輸入MedCalc軟件進行Bland-Altman（B-A）分析[15]，結果如圖2所示。橫坐標X軸表示兩種測定方法測定每個樣本的平均值，縱坐標Y軸表示兩種測定方法測定每個樣本的差值與樣本平均值的百分比。圖中的上下兩條水平虛線代表95%一致性界限的上下限，中間實線代表差值的百分比均數。兩種分析方法的一致程度越高，實線越接近虛線。圖中還顯示了分析過程中出現的極端情況，是由偶然誤差所造成的。

圖2　HPLC與CMIA法偏差圖Fig 2 Deviation chart of HPLC and CMIA method

一般來說，B-A圖形中，在置信區間上、下限內的點要占所有點的95%，并且上下限要在專業、臨床可接受的臨界值范圍內。由圖2可見，3.6%（2/55）的點在95%的一致性界限以外，達到要求；在一致性界限范圍內，HPLC法苯巴比妥的檢測值與CMIA法檢測值相比，差值百分比的絕對值最大為20.1%，國家臨檢中心要求血漿樣本血藥濃度的檢測限為±25%。因此，從一致性方面分析，HPLC法與CMIA法對苯巴比妥測定的結果一致性較好，兩種方法可以互換。

3　討論

本研究所建立的HPLC法測定苯巴比妥血漿藥物濃度，方法簡便，專屬性好、靈敏度高、準確可靠，更適于小樣本量的濃度監測，當樣品量較大時建議仍采CMIA法。本研究對兩種分析方法進行了科學系統的方法學驗證，兩者的效能學指標均符合分析要求；對兩種分析方法的測定結果進行了Passing-Bablok相關性分析[16-17]和Bland-Altman法的一致性評價及差別比較。

相關性分析結果顯示，兩種方法的相關性較好，具有可比性，可以互換。但相關分析評價兩種檢測結果具有明顯的片面性。當系統誤差較大時，相關分析也呈現較好的一致性，容易產生錯誤的結論，因為回歸分析只能顯示兩種分析方法測定值之間的相關性及密切程度。因此，還需要進行一致性的評價和分析。

綜上所述，本研究所建立的檢測苯巴比妥藥物濃度的HPLC法與CMIA法相關性和一致性良好，兩種檢測方法可以互換，均可于臨床血藥濃度監測。另外，在評價兩種臨床檢測手段時可采Passing-Bablok相關性分析和Bland-Altman法進行一致性分析。

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Consistent analysis of HPLC and CMIA method in TDM of phenobarbital in epileptic patients' plasma

QIAN Zhao, GUO Mei-hua, CHEN Yan, LU Jing, QU Ting, DUAN Li-juan, HAI Xin(Department of Pharmacy, the First Affliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，China)

[ABSTRACT]Objective: To establish a practical and reliable method to quantify phenobarbital in epileptic patients' plasma for therapeutic drug monitoring (TDM), and evaluate the correlation and consistency of high-performance liquid chromatography (HPLC) and chemiluminescence microparticle immunoassay (CMIA). Methods: HPLC and CMIA methods were used to monitor the plasma concentration of phenobarbital in 55 epileptic patients, respectively. Then the correlation and consistency of the two methods were analyzed by Passing-Bablok regression, Paired t-test and Bland-Altman analysis. Results: The regression equation of the determination results by HPLC (Y ) and CMIA (X ) was Y = 1.024 1 X + 0.349 2 (r = 0.988, n = 55), which suggested good correlation of the two methods. Paired t-test (P > 0.05) and Bland-Altman analysis suggested a good consistency of the two methods for determining the plasma concentration of phenobarbital. Conclusion: HPLC and CMIA methods had good correlation and consistency in TDM of phenobarbital. These two methods can be replaced by each other and used for clinical TDM.

[KEY WORDS]HPLC; CMIA; Phenobarbital; Therapeutic drug monitoring; Consistency

[中圖分類號]R917

[文獻標識碼]A

[文章編號]1672–8157(2016)02–0080–05

[基金項目]哈爾濱醫科大學附屬第一醫院科研基金（2016B010）

[通信作者]海鑫，女，副主任藥師，主要從事藥物分析工作。E-mail：491824878@qq.com

[作者簡介]錢釗，女，主管藥師，主要從事臨床藥學工作。E-mail：qz0419@163.com

收稿日期：（2015-10-06 修回日期：2015-12-13）