龍藤筋骨片中蛇床子素含量測定研究

汪 濤，趙雁平，胡衛東，李育芳，程 波（.解放軍武漢療養院藥械科，湖北 武漢 430074；.華中科技大學同濟醫學院，湖北 武漢 430030）

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龍藤筋骨片中蛇床子素含量測定研究

汪 濤1，趙雁平1，胡衛東1，李育芳1，程 波2（1.解放軍武漢療養院藥械科，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學同濟醫學院，湖北 武漢 430030）

[摘要]目的：建立龍藤筋骨片中蛇床子素的含量測定方法。方法：采用HPLC法測定龍藤筋骨片中蛇床子素的含量。選用welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-水（43∶57）為流動相；檢測波長：330 nm；流速：1.5 mL·min-1；柱溫：35 ℃。結果：HPLC法測定蛇床子素不存在干擾，蛇床子素進樣量在1.560×10-3～0.046 8 mg·mL-1范圍內時，線性關系良好（r = 0.999 9）；平均回收率為100.82%，RSD為1.68%。結論：HPLC法測定蛇床子素含量簡便、穩定、可靠，可作為龍藤筋骨片中蛇床子素的質量控制方法。

[關鍵詞]龍藤筋骨片；蛇床子素；含量測定；高效液相色譜法

龍藤筋骨片為解放軍武漢療養院配制的純中藥制劑，于1990年首次取得軍隊醫療機構制劑批準文號，至今已在臨床使多年，2011年再次取得軍隊醫療機構制劑批準文號：廣制字（2011）F03001。該制劑采中藥粉末與中藥提取浸膏混合后制粒，顆粒干燥后壓片的方法制備，屬于半浸膏素片；由中藥獨活、熟地、海桐皮、骨碎補、羌活、當歸、牛膝組成[1]。獨活為君藥；熟地、海桐皮、骨碎補均為臣藥；羌活、當歸、牛膝均為佐藥。諸藥配伍，具有補腎活血、通絡止痛、散寒除濕的功效，于治療肥大性關節炎、骨質增生、腰椎間盤突出、坐骨神經痛、肩周炎、風濕性關節炎等癥。為更好地控制產品質量，筆者采高效液相色譜法（HPLC）對龍藤筋骨片中所含蛇床子素進行了含量測定研究，為該制劑建立完善的質量標準提供參考。

1　儀器與試藥

高效液相色譜儀（Dionex Ultimate3000，美國戴安公司）；色譜柱為welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；LC-350A型超聲波中藥處理機（濟寧市中區魯超儀器廠）。

蛇床子素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110822-201308）。龍藤筋骨片（批號150108、150305、150317）由解放軍武漢療養院提供。乙腈（色譜純，美國Fisher公司，批號15035045）；水為純凈水；其余試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

2　蛇床子素含量測定[2]方法和結果

2.1溶液的制備

2.1.1供試品溶液 取龍藤筋骨片研碎，取粉末約1.0 g（批號150305），精密稱定，置具塞錐形瓶內，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，再稱定重量，甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.2對照品溶液 精密稱取蛇床子素5.20 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液（0.052 0 mg ·mL-1）。再精密吸取對照品儲備液3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得溶液濃度為0.015 6 mg·mL-1。

2.1.3陰性對照溶液 取除去獨活以外的其它藥材，按確定的制備工藝生產陰性供試品。按擬訂的供試品溶液制備方法，制成陰性對照溶液。

2.2色譜條件與系統適用性實驗

色譜柱為welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；以乙腈-水（43∶57）為流動相；檢測波長：330 nm；流速：1.5 mL ·min-1；柱溫為35 ℃。理論塔板數按蛇床子素峰計算應不得低于6000。

2.3專屬性實驗

將上述3種溶液各20 μL，按“2.2”項下方法分別進樣分析，色譜圖結果顯示，蛇床子素出峰時間為21.86 min，色譜峰峰形對稱，達到基線分離，陰性對照供試品溶液無干擾，表明該法專屬性良好。詳見圖1。

2.4線性關系的考察

分別精密吸取對照品儲備液（0.052 0 mg·mL-1）0.3、0.6、1.5、3.0、6.0、9.0 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度的對照品溶液。分別精密吸取不同濃度的對照品溶液20 μL注入液相色譜儀中，測定峰面積，以質量濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程為：Y = 7.467 1×102X + 0.034 1，r = 0.999 9。結果表明：蛇床子素對照品在1.560×10-3～0.046 8 mg·mL-1范圍內，線性關系良好。

2.5儀器精密度實驗

精密吸取同一供試品溶液（批號150305）重復進樣6次，測定峰面積，RSD為0.30%。結果表明，本試驗精密度良好。

2.6重復性實驗

取同一批供試品（批號150305）6份，分別按“2.1.1”項下方法擬定制備，測定峰面積并計算含量，結果表明供試品中蛇床子素的平均含量為0.263 1 mg·g-1，RSD為1.16%。

2.7穩定性實驗

取同一批供試品（批號150305），按“2.1.1”項下方法擬定制備，分別于配制后0、1、2、8、16、24 h進樣測定，測定峰面積值的RSD為0.23%。結果表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8加樣回收率實驗

分別精密吸取對照品儲備液（0.104 mg·mL-1）3、5、10 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得不同濃度的蛇床子素對照品溶液（濃度分別為3.12、5.20、10.40 μg ·mL-1）。再精密稱取已知準確含量的同一批供試品（批號150305）共9份，分別精密加入上述不同濃度的蛇床子素對照品溶液20 mL，每個濃度制備3份，按擬訂的供試品溶液制備方法制備，精密吸取20 μL注入高效液相色譜儀，按“2.2”項下色譜條件進行測定，結果顯示蛇床子素的平均回收率為100.82%，RSD為1.68%，詳見表1。

圖1　HPLC色譜圖A–對照品，B–供試品，C–陰性對照；1–蛇床子素Fig 1 HPLC chromatogramsA–reference substance, B–sample, C–negative reference substance; 1–osthole

2.9耐用性試驗

分別精密稱取同一批號（批號150305）的供試品粉末，按“2.1.1”項下方法制備，按照“2.2”項下色譜條件，采3種不同品牌的色譜柱，依法測定。結果顯示：welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：分離度 > 1.5，理論塔板數11 944，含量為0.263 1 mg·g-1；Phenomenex Luna C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：分離度 > 1.5，理論塔板數9904，含量為0.267 1 mg· g-1；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：分離度> 1.5，理論塔板數12 517，含量為0.267 7 mg·g-1，RSD為0.94%。表明3種不同品牌色譜柱均能重現現有方法。

2.10供試品的含量測定

取本品3批，批號分別為150108、150305、150317，按“2.2～2.4”項下方法進行實驗。結果見表2。

表1　加樣回收率實驗結果. n = 9Tab 1 Results of recovery test. n = 9

表2　供試品中蛇床子素的含量測定結果Tab 2 Results of content determination of osthole in samples

3　討論

龍藤筋骨片由7味中藥材組成，方中獨活味辛、苦，性微溫，治風寒濕痹，腰膝酸痛，手腳攣痛，藥理研究顯示其具有擴張血管、減少滲出、鎮痛抗關節炎等作[3]。羌活辛散祛風、味苦燥濕、能祛風散寒除濕，故善治腰以上風寒濕痹，尤以肩背肢節疼痛者佳。研究表明羌活能解熱鎮痛、抗炎、增加腦血流量、緩解疼痛和抗凝[4]。當歸，以補血行氣、舒筋活絡、活血止痛[5]。研究顯示，牛膝具有擴張下肢血管和改善血液黏度和微循環的作，從而起到消腫止痛的治療作[6]。熟地以“填骨髓，長肌肉，生精血”，“通血脈，益氣力”。研究顯示，骨碎補具有促進骨折愈合和補腎強骨的功效[7-8]。諸藥合，起到祛風除濕散寒、活血化瘀、通絡鎮痛、改善血液循環、消炎止痛的作。

3.1含量測定指標成分的選擇

在建立龍藤筋骨片中有效成分含量測定方法的過程中，根據龍藤筋骨片所含7味藥材所起作及量，分別對獨活、熟地中的有效成分進行了含量測定實驗。但是在實驗過程中發現，龍藤筋骨片溶液中熟地所含毛蕊花糖苷HPLC色譜峰未達到基線分離、獨活所含二氫歐山芹醇當歸酸酯加樣回收實驗時存在干擾，均不能被作龍藤筋骨片的含量測定指標成分。

蛇床子素為獨活有效成分之一，獨活又為方中主藥，并且含量測定及加樣回收實驗不存在干擾，故選擇蛇床子素作為控制龍藤筋骨片質量的指標成分。

3.2流動相的選擇

《中國藥典》2015年版一部中獨活項下測定蛇床子素，以乙腈-水（49∶51）為流動相，測定時發現供試品分離度差，經反復實驗，選定乙腈-水（43∶57）為流動相進行測定，結果顯示供試品溶液峰形較好，蛇床子素能夠達到基線分離，理論塔板數按蛇床子素峰計算不低于6000。故最終采此流動相。

3.3蛇床子素含量限度的確定

由于《中國藥典》2015年版一部中對獨活中蛇床子素的含量有規定，根據實驗情況，選擇蛇床子素的含量為重點控制對象。根據含量測定的結果及大量配制中的實際情況，建議龍藤筋骨片應含蛇床子素≥70 μg·片-1。龍藤筋骨片的臨床觀察數據顯示，其對患者血、尿常規、肝腎功能、心電圖等方面檢查均無不良影響，未發現異常變化。同時，在治療前后也未發現因龍藤筋骨片引起的毒副作[9]。因此，我們認為該制劑在目前口服劑量、療效范圍內藥安全。

[參考文獻]

[1] 汪濤，胡衛東，李衛興，等.龍藤筋骨片制備工藝研究[J].中國藥業，2012，21（14）：59-61.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：通則0512.

[3] 江蘇新醫學院.中藥大辭典[M].上海：上海人民出版社，1977：1705.

[4] 馬玉林，李建民，馬莉，等.藥植物羌活的研究進展[J].安徽農業科學，2010，38（24）：13092-13093.

[5] 汪濤，胡衛東，李衛興，等.龍藤筋骨片的藥效學實驗研究[J].中國療養醫學，2013，22（2）：98-100.

[6] 李衛興，李育芳，李清紅，等.龍藤筋骨片治療老年骨質增生性腰椎病療效觀察[J].華南國防醫學雜志，2012，26（4）：328-330，371.

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[8] 高穎，王新巒，王乃利，等.骨碎補中的化學成分[J].中國藥物化學雜志，2008，18（4）：284-287.

[9] 李衛興，李清紅，陳立.龍藤筋骨片對肝腎功能影響的臨床觀察[J].華南國防醫學雜志，2011，25（5）：450-451.

Study on content determination of osthole in Longtengjingu tablets

WANG Tao1, ZHAO Yan-ping1, HU Wei-dong1, LI Yu-fang1, CHENG Bo2(1. The Drug and Equipment Section of Wuhan Sanatorium of PLA, Wuhan 430074, China; 2. Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)

[ABSTRACT]Objective: To establish a content determination method of osthole in Longtengjingu tablets. Methods：The content of osthole in Longtengjingu tablets were determined by HPLC. The analysis was performed on welch Ultimate AQ-C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm). The mobile phase was consisted of acetonitrile and water (43 : 57). The detection wavelength was 330 nm. The fow rate was 1.5 mL·min-1. The column temperature was 35 ℃. Results: There was no interference for osthole detection by HPLC method. The linear range of osthole was 1.560 × 10-3–0.046 8 mg·mL-1(r = 0.999 9). The average recovery was 100.82% (RSD = 1.68%). Conclusion: The method is simple, stable, reliable, and can be adopted as the quality control method of osthole.

[KEY WORDS]Longtengjingu tablets; Osthole; Content determination; HPLC

[中圖分類號]R917

[文獻標識碼]A

[文章編號]1672–8157(2016)02–0089–03

[基金項目]軍隊醫療機構制劑標準提高計劃項目（14TG0197）

[作者簡介]汪濤，男，主管藥師，研究方向：醫院藥學、中藥制劑。E-mail：taidi1127@126.com

收稿日期：（2015-10-12 修回日期：2015-12-05）