NtC3H基因對煙草類黃酮及綠原酸合成的影響

李 洋，唐雪冰，李曉峰，李 明，儲昭輝，丁新華*

（1.作物生物學國家重點實驗室，山東省農業微生物重點實驗室，山東農業大學，山東 泰安 271018；2.黑龍江煙草工業有限責任公司海林卷煙廠，黑龍江 海林 157100）

?

NtC3H基因對煙草類黃酮及綠原酸合成的影響

李 洋1，唐雪冰2，李曉峰2，李 明1，儲昭輝1，丁新華1*

（1.作物生物學國家重點實驗室，山東省農業微生物重點實驗室，山東農業大學，山東 泰安 271018；2.黑龍江煙草工業有限責任公司海林卷煙廠，黑龍江 海林 157100）

摘 要：為驗證NtC3H是否參與煙草中類黃酮和綠原酸等次生代謝物質的合成，構建了pCXSN∶∶NtC3H超量表達載體，利用農桿菌介導的葉盤轉化法將NtC3H基因轉入野生型煙草三生煙，并通過HPLC檢測轉基因煙草中綠原酸以及蘆丁、山奈酚蕓香苷等類黃酮的含量變化。結果顯示，與野生型三生煙草相比，轉基因煙草葉片中綠原酸及蘆丁的含量最高，分別提高了3.6倍和6.1倍，山奈酚蕓香苷含量提高了24.6倍。研究結果證實了NtC3H基因參與煙草中類黃酮和綠原酸等次生代謝物質的合成。

關鍵詞：煙草；NtC3H基因；綠原酸；類黃酮

細胞色素P450（cytochrome，CYP450）是一類存在一個由半胱氨酸和含鐵血紅素組成的活性中心的酶類家族［1-2］。對-香豆酸 3-羥化酶（pcoumarate 3-hydroxylase，C3H）屬于細胞色素P450家族，催化對-香豆酰莽草酸/奎寧酸到咖啡酰莽草酸/奎寧酸C3位置的羥基化反應，決定木質素單體的碳源流向，并控制植物生長過程中木質素不同單體的組成［3-5］。超量表達煙草NtC3H基因對煙草中綠原酸及蘆丁、山奈酚蕓香苷等次生代謝物質積累的影響，目前鮮有報道。

次生代謝物質在植物對環境脅迫和病蟲害的防御過程中起到重要作用［6-8］。此外，植物次生代謝物質對人類抗氧化、延緩衰老、抗擊癌癥以及預防心腦血管疾病等方面也存在重要作用［9-11］。分析煙草中NtC3H基因超量表達對煙草次生代謝物質含量的影響，是研究煙草次生代謝合成機制的有效方式，同時也可作為提高煙草葉片中營養物質含量及煙草抗逆性的研究基礎。本研究對煙草NtC3H基因在煙草次生代謝途徑中的作用做了初步探討。

1　材料與方法

1.1 材料

煙草品種三生煙（Nicotiana tabacum cv. samsun）及其轉基因煙草T0和 T1代均在培養室進行，培養室條件如下：培養溫度25 ℃；光暗周期16 h/8 h；相對濕度（70±10）%。待煙草植株生長至8葉期，取中部葉片進行檢測。

試驗用菌株：大腸桿菌Escherichia coli DH5ɑ，農桿菌LBA4404，以及含有35S啟動子的真核超量表達載體pCXSN均由本實驗室保存提供。DNA聚合酶LAmp-Taq、反轉錄試劑及試劑盒購自康為生物公司，DNA凝膠回收試劑盒購自OMEGA Biotek公司，限制性內切酶Xcm I和T4 DNA連接酶等均購自NEB公司。引物合成由上海生工生物工程技術有限公司完成，DNA測序由華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 NtC3H的克隆 按照 Trizol（Invitrogen）說明書中描述方法提取煙草葉片總 RNA，1.5 μg上述總RNA用DNaseI（NEB，美國）37 ℃處理15 min，75 ℃放置10 min，去除基因組DNA后以其為模板進行第一鏈NtC3H cDNA的合成，反應條件如下：在上述除去基因組的 RNA中加入1.5 μL oligo（dT）15寡聚引物，70 ℃反應10 min后冰上急速冷卻2 min。加入5×M-MLV Buffer，1.5 μL dNTP（10 μM），0.5 μL反轉錄酶M-MLV （Invitrogen，USA），最后加入DEPC水補充至20 μL。42 ℃條件下反應時間為1 h，70 ℃處理15 min得到cDNA第一鏈產物。以上述反應得到的cDNA為模板，根據NCBI［12］上煙草NtC3H基因序列（GeneBank DQ350326）和EST序列特征，設計 NtC3H基因擴增引物 NtC3HF1：5?-ATGT ACTCTCATAGGTCAAAAGT-3?和NtC3HR1：5?-TTACATATCCACTGGCACAC-3?，選取高保真DNA聚合酶LAmp（康為，北京）對目的基因進行擴增，擴增反應體系如下：20～50 ng模板，10×PCR緩沖液，4 μL dNTPs（2.5 mM），1 μL引物（10 μM），1 UDNA聚合酶，最后加入滅菌雙蒸水補充至50 μL。PCR具體反應條件如下：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃復性30 s，72 ℃延伸90 s（30～60 s/kb速度）循環數35；72 ℃延伸10 min。

1.2.2 NtC3H表達載體的構建 通過限制性內切酶Xcm I（NEB，美國）對超量表達載體pCXSN進行酶切，對酶切后載體進行酶的滅活和純化。將通過高保真聚合酶擴增到的NtC3H基因片段連接到純化后的表達載體上，形成煙草超量表達轉化載體pCXSN∶∶NtC3H轉入大腸桿菌DH5ɑ，挑白斑擴繁后用菌液PCR的方法進行初篩，挑選陽性克隆送出測序。經驗證測序結果與NCBI上煙草C3H基因序列（GeneBank DQ350326）一致后，轉化農桿菌LBA4404。

1.2.3 農桿菌介導的煙草轉化 將已構建好的超量表達載體 pCSXN∶∶NtC3H 通過農桿菌（LBA4404）介導的葉盤轉化法［13］，轉入受體材料三生煙草的葉片。待轉基因煙草根系在生根培養基中發育良好后，移栽到土壤中。采用CTAB［14］法提取轉基因和非轉基因植株葉片基因組 DNA，以 35S啟動子內部序列設計的引物 35SF：5?-ACGCACAATCCCACTATCCTT-3?和基因序列內部設計的引物 NtC3HR1：5?-TTACATATCC ACTGGCACAC-3?組合進行PCR陽性檢測。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行分析，擴增出1500 bp左右片段，為陽性植株。

1.2.4 類黃酮提取和HPLC測定 取轉基因及野生型煙草葉片用液氮研磨至粉末狀，各取 0.3 g，3 mL 100%色譜甲醇-20 ℃提取2 h，每15分鐘振蕩1次。對提取物進行4 ℃、10000 rpm離心2 min，上清經0.22 μm微孔濾膜過濾至樣品瓶，取10 μL濾液用于 HPLC分析，按照 Li［15］等設置HPLC條件。標準品為綠原酸（購自Sigma），蘆?。ㄙ徸?Sigma），山奈酚蕓香苷（購自Extrasynthese）。

2　結果

2.1 NtC3H基因的克隆和表達載體的構建

按照 NCBI中提供的三生煙草中 NtC3H （GeneBank DQ350326）已知序列設計引物，以三生煙草葉片cDNA為模板，通過高保真DNA聚合酶PCR擴增獲得長為1562 bp的清晰目標條帶（圖1），對獲得片段進行切膠回收。將Xcm I酶切后的pCXSN載體與切膠回收后片段相連接，轉入大腸桿菌DH5ɑ，挑白斑擴增繁殖過夜后用菌液PCR的方法進行初篩，并挑選3個陽性克隆提取質粒，通過載體上啟動子引物35SF和基因擴增引物NtC3HR1 進行PCR陽性驗證（圖2），將驗證成功的陽性質粒送出測序。所獲測序結果與目標序列比對，二者序列比對一致，證明成功克隆到三生煙草中NtC3H的完整基因序列。

圖1　NtC3H擴增電泳圖Fig. 1 Cloning electrophoresis pattern of NtC3H

2.2 轉NtC3H基因煙草的獲得

將測序成功的大腸桿菌質粒，轉入農桿菌LAB4404。通過農桿菌介導的葉盤轉化法［13］，轉入受體材料三生煙草的葉片獲得轉NtC3H基因煙草植株，進一步通過PCR的方法驗證陽性轉基因煙草植株。共獲得12棵轉基因材料，其中有9棵擴增到了目標基因序列，確認為陽性轉基因植株，轉化率為75%（圖3）。

2.3 轉基因煙草葉片類黃酮和綠原酸含量檢測

待轉基因陽性及野生型煙草長到8葉期，參照 Li［15］等的方法用 HPLC檢測了 3種物質的含量。結果顯示，轉NtC3H基因的煙草葉片中綠原酸、蘆丁及山奈酚蕓香苷的含量都有較為明顯的提高（圖4，表1）。

與野生型相比，轉NtC3H基因的煙草葉片中綠原酸的含量提高了 0.3～3.6倍，最高含量為1167.1 μg/g（鮮重）；蘆丁的含量提高了0.7～6.1倍，最高含量為177.3 μg/g（鮮重）；山奈酚蕓香苷含量提高了1.2～24.6倍，最高含量達到了302.6 μg/g（鮮重），均遠遠高于野生型煙草（圖4，表1）。

圖2　NtC3H質粒檢測圖Fig. 2 NtC3H verification by plasmid PCR

圖3　T0代NtC3H轉基因煙草植株陽性檢測Fig. 3 Positive detection of transgenic tobacco in T0generation

表1　轉基因煙草T0代葉片中次生代謝物質含量Table 1 Quantification of main secondary metabolites in the T0generation of NtC3H-expressing tobacco and wild-type （SS） leaves

圖4　T0代轉基因煙草與野生型煙草葉片中次生代謝物質含量HPLC檢測Fig. 4 HPLC analysis of methanol extracts from leaves of wild-type and NtC3H-expressing T0generation plants

在PCR檢測陽性的植株中選擇T0代3個株系，編號為（1，2和5），進行T1代陽性檢測，并對陽性植株葉片混合后進行HPLC檢測，測定上述3種物質含量。轉基因煙草T1代植株綠原酸及山萘酚蕓香苷含量與T0代基本一致，蘆丁含量略高于T0代，說明NtC3H轉基因煙草高含類黃酮及綠原酸等次生代謝物質的優勢可以穩定遺傳（圖5，表2）。

圖5　轉基因煙草T1葉片中次生代謝物質含量Fig. 5 HPLC analysis secondary metabolites contents of NtC3H transgenic tobacco leaves in T1generation and control

表2　T1代轉基因煙草葉片中次生代謝物質含量Table 2 Quantification of main secondary metabolites in the T1generation of NtC3H-expressing tobacco and wild-type （SS） leaves

3　討論

對-香豆酸 3-羥化酶（C3H）屬于細胞色素P450單氧化酶，催化苯丙烷苯環C3位置的羥基化反應，決定了木質素代謝過程中H單體向G/S單體轉化的碳源流向，近年來得到廣泛驗證［3-5］。在煙草植株中，通過超量表達載體將煙草自身NtC3H基因進行超量表達，通過分析煙草中3種次生代謝物質含量發現：轉基因煙草中綠原酸，蘆丁及山萘酚蕓香苷含量均提高數倍，這種含量的提高在后代中穩定遺傳。這種變化很可能是由于C3H在次生代謝途徑中起到的作用不僅僅是調節木質素的合成過程，也同時對綠原酸，蘆丁及山萘酚蕓香苷所在的合成途徑中其他相關酶的表達產生了影響［16］，促進其在煙草植株體內的累積。

已經證實，在次生代謝物質中具有代表性的類黃酮類物質在植物對環境脅迫、昆蟲及病原微生物等的防御過程中起到重要作用［6-8］。另外科學家們也已經證實，長期服食綠原酸以及蘆丁等次生代謝物質對人類的健康非常有益，可以降低許多疾病發生的概率，如心腦血管疾病，癌癥等［17］。另外次生代謝物質也提供豐富的香料及工業原料。在煙草中，綠原酸、蘆丁及山奈酚蕓香苷均是主要的酚類物質，經過燃吸均會裂解產生揮發性物質從而對煙氣香味產生直接影響［18-20］。

野生煙草中3種主要的次生代謝物質含量均不高，NtC3H作為煙草中自身含有的一種羥化酶，在煙草中超量表達后，上述物質均有了明顯的提高，這既可以幫助我們提取豐量的上述次生代謝物質，也可以幫助提高煙草對多種蟲害，病害等逆境的抗性，并提高煙氣香味對香煙品質進行改良。

4　結論

本研究通過超量表達煙草的NtC3H基因，獲取多株轉基因陽性植株，并分析了T0及T1代轉基因煙草中蘆丁、山奈酚蕓香苷和綠原酸等次生代謝物質含量的變化。結果顯示，轉基因煙草葉片中綠原酸的含量最高提高了 3.6倍，最高含量達到1167.1 μg/g（鮮重）；蘆丁的含量最高提高了6.1倍，最高含量達到177.3 μg/g（鮮重）；山奈酚蕓香苷含量最高提高了24.6倍，最高含量達到了302.6 μg/g （鮮重）；并且這種優勢可在后代中穩定遺傳。

本研究為深入了解NtC3H在多個不同代謝途徑中的作用和功能提供了研究基礎。與此同時，提高煙草本身次生代謝物質的研究有限，通過對次生代謝物質合成基因的研究有助于了解次生代謝各個途徑之間的關聯性及合成機理，并能夠在生產實際中提高煙草對多種逆境的抗性，同時為提高煙氣品質、減輕吸煙對健康的負面影響提供了理論支持。

參考文獻

［1］ Liu X，Deng Z，Gao S，et al. A new gene coding for pcoumarate 3-hydroxylase from Ginkgo biloba［J］. Russ J Plant Physiol，2008，55（1）∶ 82-92.

［2］ Franke R，Hemm M R，Denault J W，et al. Changes in secondary metabolism and deposition of an unusual lignin in the ref8 mutant of Arabidopsis［J］. Plant J，2002，30（1）∶ 47-59.

［3］ Abdulrazzak N，Pollet B，Ehlting J，et al. A coumaroylester-3-hydroxylase insertion mutant reveals the existence of nonredundant meta-hydroxylation pathways and essential roles for phenolic precursors in cell expansion and plant growth［J］. Plant Physiol，2006，140（1）∶ 30-48.

［4］ Ralph J，Akiyama T，Kim H，et al. Effects of coumarate 3-hydroxylase down-regulation on lignin structure［J］. J of Bio Chem，2006，281（13）∶ 8843-8853.

［5］ Reddy M S，Chen F，Shadle G，et al. Targeted downregulation of cytochrome P450 enzymes for forage quality improvement in alfalfa （Medicago sativa L.）［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（46）∶ 16573-16578.

［6］ Diaz Napal G N，Carpinella M C，Palacios S M. Antifeedant activity of ethanolic extract from Flourensia oolepis and isolation of pinocembrin as its active principle compound［J］. Bioresour Technol，2009，100（14）∶ 3669-3673.

［7］ Amil-Ruiz F，Blanco-Portales R，Mu?oz-Blanco J，et al. The strawberry plant defense mechanism∶ a molecular review［J］. Plant Cell Physiol，2011，52（11）∶ 1873-1903.

［8］ Izaguirre M M，Mazza C A，Svatos A，et al. Solar ultraviolet-B radiation and insect herbivory trigger partially overlapping phenolic responses in Nicotiana attenuata and Nicotiana longiflora［J］. Ann Bot，2007，99（1）∶ 103-109.

［9］ Hannum S M. Potential impact of strawberries on human health∶ a review of the science［J］. Crit Rev Food Sci Nutr，2004，44（1）∶ 1-17.

［10］ Soobrattee M A，Bahorun T，Aruoma O I. Chemopreventive actions of polyphenolic compounds in cancer［J］. Biofactors，2006，27（1-4）∶ 19-35.

［11］ Hertog M G，Feskens E J，Hollman P C，et al. Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease∶the Zutphen Elderly Study［J］. Lancet，1993，342（8878）∶1007-1011.

［12］ 丁安明，陳雅瓊，Zahid Hussain，等. 煙草GA代謝相關基因ga1和ga2的克隆和表達分析［J］. 中國煙草科學，2014，35（12）：102-107.

［13］ 李曉薇，張艷，趙旭，等. 大豆 GmMYB12B2 植物表達載體的構建及轉化煙草的研究［J］. 中國農學通報，2011，287（12）：91-95.

［14］ 杜希華，陸海，高述民，等. 文冠果花藥總RNA提取方法研究［J］. 北京林業大學學報，2003，25（1）：10-13

［15］ Li Y，Chen M，Wang S，et al. AtMYB11 regulates caffeoyl quinic acid and flavonol synthesis in tomato and tobacco［J］. Plant Cell Tiss Organ Cult，2015，122∶309-319.

［16］ Lister C E，Lancaster J E，Walker J R. Phenylalanine ammonialyase （PAL） activity and its relationship to anthocyanin and falvonoid levels in New Zealandgrown apple cultivars［J］. J Am Soc Hortic Sci，1996，121∶ 281-285.

［17］ Ackland M L，van de Waarsengurg S，Jones R. Synergistic antiproliferative action of the flavonols quercetin and kaempferol in cultured human cancer cell lines［J］. In Vivo，2005，19∶ 69-76.

［18］ 王霞，楊鐵釗，殷全玉，等. 影響煙草香味的主要次生代謝途徑及其研究進展［J］. 中國煙草科學，2008，29（1）：47-50.

［19］ 楊鐵釗，李欽奎，李偉，等. 植物次生與煙草香味物質［J］. 中國煙草科學，2005，26（4）：23-26.

［20］ 牛維環，謝小東，程廷才，等. 植物類萜代謝及其在煙草中的研究進展［J］. 中國煙草科學，2010，31（5）：84-89.

The Influence of NtC3H on the Synthesis of Flavonoids and Chlorogenic Acid in Tobacco

LI Yang1，TANG Xuebing2，LI Xiaofeng2，LI Ming1，CHU Zhaohui1，DING Xinhua1*
（1. State Key Laboratory of Crop Biology，Shandong Provincial Key Laboratory of Agricultural Microbiology，Shandong Agricultural University，Tai'an，Shandong 271018，China；2. Heilongjiang Tobacco Industry Co.，Ltd.，Hailin Cigarette Factory，Hailin，Heilongjiang 157100，China）

Abstract:To test whether NtC3H participates in the biosynthesis of flavonoids，and chlorogenic acid （CGA） in tobacco and increases the contents of these secondary metabolites，we constructed the over-expression vector pCXSN∶∶NtC3H and introduced it into Nicotiana tabacum var. samsun via Agrobacterium-mediated transformation. The concentrations of the different secondary metabolites including CGA，rutin，and kaempferol rutinoside in leaves of wild-type and transgenic lines were determined by HPLC. Compared to wild-type samsun tobacco，in transgenic tobacco the concentrations of CGA were increased 3.6-fold，rutin and kaempferol rutinoside were increased 6.1- and 24.6-fold respectively. These results suggested that NtC3H positively regulated the synthesis of flavonoids and CGA in tobacco.

Keywords:tobacco；NtC3H；chlorogenic acid；flavonoids

中圖分類號：S572.03

文章編號：1007-5119（2016）01-0008-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.002

基金項目：國家高技術研究發展計劃“富含類黃酮及咖啡?？崴岱哑贩N的培育”（863，2010AA10Z103）

作者簡介：李 洋（1988-），女，博士研究生，研究方向為植物次生代謝調控。E-mail：younuowanwan@126.com*通信作者，E-mail：xinhuading@hotmail.com

收稿日期：2015-08-31 修回日期：2015-10-18