HDAC6和Ac-α-Tub在肺腺癌中表達(dá)的臨床病理意義

張暈生 宋旭東

HDAC6和Ac-α-Tub在肺腺癌中表達(dá)的臨床病理意義

張暈生 宋旭東

目的 研究組蛋白去乙?；?HDAC)6和乙?；⒐艿鞍爪?Ac-α-Tub)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義。方法 收集2013-06—2015-06期間在秦皇島市腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)臨床病理證實的NSCLC標(biāo)本52例，以同例患者癌旁肺組織作為對照組。免疫組織化學(xué)染色法和免疫印跡法檢測HDAC6和Ac-α-Tub在NSCLC及對照組中的表達(dá)，分析其與臨床病理參數(shù)(性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理分期)的關(guān)系。結(jié)果 在癌旁組中HDAC6陽性表達(dá)率為5.77%，顯著低于NSCLC組的76.92%，且NSCLC組HDAC6蛋白表達(dá)水平為對照組的6倍，而Ac-α-Tub在NSCLC組織中和陽性表達(dá)率顯著低于癌旁組，其在NSCLC組織中的表達(dá)水平為癌旁的31.03%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。NSCLC組中HDAC6的陽性表達(dá)與分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切；Ac-α-Tub的陽性表達(dá)與分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。且HDAC6在NSCLC組中的表達(dá)與Ac-α-Tub的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論HDAC6在NSCLC中高表達(dá)，而α-Ac-Tub蛋白表達(dá)下調(diào)，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，二者可能在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

肺癌；組蛋白去乙?；福灰阴；⒐艿鞍?/p>

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的第一位，然而70%以上患者確診時已經(jīng)失去了手術(shù)機(jī)會，即使輔以放、化療等多種綜合治療手段，仍然不能顯著提高肺癌的生存率[1]。因此，尋找NSCLC早期診斷標(biāo)志物及靶向治療位點一直是腫瘤研究領(lǐng)域的難點和熱點問題。

作為Ⅱb類組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDAC)的代表，HDAC6與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。有研究顯示，HDAC6的缺失表達(dá)能夠促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞DNA損傷和凋亡，減少裸鼠體內(nèi)移植瘤的體積，而高表達(dá)HDAC6則增加了瘤體對順鉑的耐藥性[2]。在其他腫瘤中也發(fā)現(xiàn)，HDAC6與微管蛋白 (tubulin，Tub)的去乙?；?acetylation，Ac)、泛素化失衡和氧化應(yīng)激關(guān)系密切，在卵巢癌、乳腺癌和食管癌、胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的調(diào)控作用[3-4]。因此，本研究擬通過分析HDAC6和Ac-α-Tub在NSCLC中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義，探討HDAC6對NSCLC的影響，為NSCLC基因治療中靶點的選擇提供一定的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2013-06—2015-06期間在秦皇島市第四醫(yī)院(腫瘤醫(yī)院)手術(shù)切除并經(jīng)臨床病理證實的NSCLC標(biāo)本52例。所有患者臨床資料完整，均為肺癌原發(fā)病灶，無其他腫瘤病史；術(shù)前均未接受放、化療治療；無肝炎、肝硬化、自身免疫性疾病或其他嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病。以腫瘤組織石蠟標(biāo)本作為實驗組，并挑選同例患者的癌旁肺組織石蠟標(biāo)本作為對照組(距離腫瘤＞5 cm，鏡下無癌細(xì)胞浸潤及轉(zhuǎn)移)，所有標(biāo)本采用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm切片，由病理科診斷、存檔并提供。

1.2 實驗試劑 HDAC6(ab1440)購置于美國abcam公司；Ac-α-Tub(sc-23950)購置于美國santa cruz公司；免疫組化試劑盒(PV-6000)、DAB顯色液(ZLI-9018)購置于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；免疫印跡二抗(074-1506/074-1806)購置于英國KPL公司。

1.3 免疫組化法檢測HDAC6和Ac-α-Tub在肺癌和癌旁組織中的定位和表達(dá) 按照北京中杉PV6000免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，高壓修復(fù)及H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶后，加一抗(1∶200稀釋)4℃過夜，次日滴加二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明中性樹膠封片。高倍視野下隨機(jī)選取5個視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分比，按照以下4級進(jìn)行計分，0分：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%；1分：10%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：>75%。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕色或棕褐色3分。以兩者乘積作為陽性評判標(biāo)準(zhǔn)，其中4分以上定義為陽性。采用PBS替代一抗作為陰性對照。

1.4 Western blot法檢測HDAC6和Ac-α-Tub在肺癌和癌旁組織中的表達(dá) 常規(guī)提取組織蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度后上樣(20 μg/泳道)，常規(guī)電泳和電轉(zhuǎn)。孵育一抗(1∶500)4℃過夜，二抗(1∶5 000)37℃ 1 h后，ECL發(fā)光顯色，采用Image-Lab 5.1軟件定量分析條帶。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 用Excel建庫，SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。定性資料比較采用χ2檢驗，定量資料采用方差分析，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)法，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HDAC6和Ac-α-Tub在NSCLC中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，在肺癌組織中HDAC6陽性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，主要定位于細(xì)胞漿，偶見孤立的單個腫瘤細(xì)胞核內(nèi)陽性表達(dá)。其在腫瘤組織中的陽性表達(dá)率為76.92%(40/52)，而在癌旁組織中陽性表達(dá)率為5.77%(3/52)，兩者相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(表1，圖1)。而無論在癌旁組還是在腫瘤樣本中，部分支氣管上皮細(xì)胞可見陽性表達(dá)，不計為陽性結(jié)果。Ac-α-Tub在腺癌和癌旁組織均強(qiáng)表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞。且在癌旁肺組織中，還可表達(dá)于多種細(xì)胞類型，包括肺泡上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞，在癌旁組織其陽性表達(dá)率為80.77%；而在癌組織中其陽性表達(dá)率為26.92%，兩者相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝30.333，P＝0.000，表2，圖2)。免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，在52例NSCLC臨床樣本中，HDAC6的表達(dá)量為對照組的6倍，而Ac-α-Tub表達(dá)為對照組的31.03%(表3，圖3)。

表1 HDAC6在對照組及NSCLC組中的表達(dá)

圖1 HDAC6在NSCLC中的陽性表達(dá)

表2 Ac-α-Tub在對照組及NSCLC組中的表達(dá)

圖2 Ac-α-Tub在NSCLC中的弱陽性表達(dá)

表3 HDAC6和Ac-α-Tub在對照組和NSCLC組蛋白表達(dá)量(免疫印跡法，±s)

表3 HDAC6和Ac-α-Tub在對照組和NSCLC組蛋白表達(dá)量(免疫印跡法，±s)

組別 HDAC6 Ac-α-Tub對照組 0.02±0.02 0.29±0.07 NSCLC組 0.12±0.01 0.09±0.08t8.004 4.634P0.000 0.001

圖3 HDAC6和Ac-α-Tub在對照組和肺癌組蛋白水平的表達(dá)(免疫印跡法)

2.2 HDAC6和Ac-α-Tub在NSCLC中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 χ2檢驗結(jié)果顯示，HDAC6在NSCLC中陽性表達(dá)情況與性別、年齡、吸煙史、瘤體大小、腫瘤類型無關(guān)，而在分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期方面有統(tǒng)計學(xué)意義，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而Ac-α-Tub在NSCLC中的陽性表達(dá)與分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，而在性別、年齡、吸煙史、瘤體大小、腫瘤類型和病理分期方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。在52例NSCLC臨床樣本中，HDAC6與Ac-α-Tub陽性共表達(dá)4例，二者在NSCLC中呈負(fù)相關(guān)(r＝－0.697，P＝0.000)。

表4 HDAC6和Ac-α-Tub在NSCLC中表達(dá)的臨床病理意義

3 討論

中國三次惡性腫瘤抽樣回顧性調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，肺癌死亡率逐年攀升，由20世紀(jì)70年代的第4位上升至現(xiàn)在的第1位[5]。

近些年研究發(fā)現(xiàn)，HDAC6在多種實體瘤中高表達(dá)，且對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮雙向調(diào)控作用，其差異取決于HDAC6在細(xì)胞中的定位。在乳腺癌臨床樣本中發(fā)現(xiàn)，HDAC6在一些較為正常的上皮細(xì)胞呈胞核表達(dá)，而在大部分腫瘤細(xì)胞中呈胞漿表達(dá)[6]。本研究也發(fā)現(xiàn)52例NSCLC患者樣本中，76.92%患者腫瘤細(xì)胞胞漿陽性表達(dá)HDAC6，偶見細(xì)胞核表達(dá)。HDAC6在核內(nèi)能夠去乙酰化NF-κB的p65亞基，減少其與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo preteinases，MMP)2啟動子的結(jié)合，導(dǎo)致MMP2表達(dá)下調(diào)，因此影響腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。體外研究也發(fā)現(xiàn)，胞漿內(nèi)過表達(dá)HDAC6能夠顯著促進(jìn)A549和H661細(xì)胞的侵襲和遷移，然而在核內(nèi)表達(dá)的HDAC6則反過來能夠抑制細(xì)胞侵襲(對遷移無明顯的抑制作用)[7]。這說明，HDAC6在多數(shù)研究認(rèn)為，其在核中表達(dá)多提示預(yù)后良好，而在胞漿中陽性表達(dá)則能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。由于胞核內(nèi)HDAC6陽性表達(dá)較少，且在同一樣本中多以胞漿陽性表達(dá)為主，因此本研究并未進(jìn)一步探討HDAC6在細(xì)胞漿/核中的差異表達(dá)與臨床病理之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)HDAC6陽性表達(dá)率與NSCLC分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

微管蛋白α(α-Tub)是細(xì)胞骨架蛋白之一，廣泛參與維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。有研究報道了α-Tub與乳腺癌、胃癌、直腸癌和前列腺癌中高表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，且微管動力學(xué)的破壞和異常有絲分裂能夠?qū)е伦仙即寄退帲瑫r微管的異常也能導(dǎo)致細(xì)胞間信息傳遞異常，引起黏附能力下降，而侵襲性偽足與微管的伸長有關(guān)[3-4]。諸多研究顯示，HDAC6能夠通過對α-Tub乙?；恼{(diào)節(jié)，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。在轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞[8]和人肺成纖維細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)HDAC6表達(dá)上調(diào)和Ac-α-Tub表達(dá)下調(diào)，并伴隨上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)能夠誘導(dǎo)促進(jìn)Ac-α-Tub去乙酰化，從而誘導(dǎo)EMT的形成[9-10]。從α-Tub的乙?；揎梺碇v，HDAC6抑制劑已經(jīng)被證明是治療腫瘤的一個新的靶點。本研究結(jié)果顯示，Ac-α-Tub主要陽性表達(dá)于癌旁組織，而在癌組織中多缺失表達(dá)，Ac-α-Tub與HDAC6的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其缺失表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05)。提示α-Ac-Tub在NSCLC中的缺失表達(dá)可能在肺癌的發(fā)生、發(fā)展具有一定的調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)缺失可能與HDAC6的負(fù)調(diào)控有關(guān)，具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究和探討。

[1]Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al.Cancer incidence and mortality worldwide：sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer，2015，136(5)：359-386.

[2]Lei W，Shengyan X，Williams KA，et al.Depletion of HDAC6 enhances cisplatin-induced DNA damage and apoptosis in non-small cell lung cancer cells[J].Plos One，2012，7(9)：e44265.

[3]顧洪豐.微管與腫瘤關(guān)系研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥研究，2001，17(5)：56-57.

[4]彭琦，李君君，張濟(jì)，等.α-微管蛋白與腫瘤的研究[J].中華臨床醫(yī)師，2013，7(20)：9315-9316.

[5]劉永軍，楊嬋嬋.我國肺癌流行趨勢及疾病負(fù)擔(dān)概況[J].現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)，2016，2(2)：212-214.

[6]Zhenhuan Z，Hiroko Y，Tatsuya T，et al.HDAC6 expression is correlated with better survival in breast cancer[J].Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research，2004，10(20)：6962-6968.

[7]Chih-Jen Y，Yu-Peng L，Hong-Ying D，et al.Nuclear HDAC6 inhibits invasion by suppressing NF-κB/MMP2 and is inversely correlated with metastasis of non-small cell lung cance[J].Oncotarget，2015，6(30)：30263-30276.

[8]Shan B，Yao TP，Nguyen HT，et al.Requirement of HDAC6 for transforming growth factor-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition[J].J Biol Chem，2008，283(30)：21065-21073.

[9]Wang Z，Chen C，F(xiàn)ingerSN，etal.Suberoylanilide hydroxamic acid：a potentialepigenetic therapeutic agentforlung fibrosis[J].Eur Respir J，2009，34(1)：145-155.

[10]Hashimoto-Komatsu A，Hirase T，Asaka M，et al.AngiotensinⅡinduces microtubule reorganization mediated by a deacetylase SIRT2 in endothelial cells[J].Hypertens Res，2011，34(8)：949-956.

Objective To study the expression of HDAC6 and Ac-α-Tub and the clinic pathological significance in non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods 52 cases confirmed with NSCLC with clinic pathology after surgical resection at Qinhuangdao Tumor Hospital from June 2013 to June 2016 were collected for samples，and adjacent cancer lung tissues of the same sufferers were taken as control group.Immunohistochemical staining and immunoblotting were adopted to detect HDAC6 and Ac-α-Tub expression in NSCLC group and control group and its relationship with clinicopathological parameters(sex，age，smoking history，tumor size，histological type，differentiated degree，lymphatic metastasis and clinicopathological stage)was analyzed.Results The positive expression rate of HDAC6 in adjacent cancer group was 5.77%，lower than 76.92%in NSCLC group，and HDAC6 protein expression level in NSCLC group was six times of that in adjacent cancer group，while Ac-α-Tub and its positive expression rate in NSCLC group were clearly lower than those in adjacent cancer group，among which the positive expression rate in NSCLC group was 31.03%of that in adjacent cancer group，with differences of statistical significance(P＜0.05).The HDAC6 positive expression in NSCLC group was closely related to differentiated degree，clinical stages，and lymphatic metastasis.The Ac-α-Tub positive expression was closely related to differentiated degree and lymphatic metastasis.The HDAC6 expression in NSCLC group was negatively related to Ac-α-Tub expression.Conclusion The high HDAC6 expression in NSCLC group and down-regulated expression of α-Ac-Tub protein were closely related to tumor invasion and metastasis，both can have critical regulating effects in the occurrence and development of NSCLC.

Lung cancer；HDAC；Acetylated tubulin

2016-05-20)

1005-619X(2016)09-0903-04

10.13517/j.cnki.ccm.2016.09.003

063000 華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院