二萜類化合物微生物轉化研究進展

吳亦晴，虞勁祥，程志紅

(復旦大學 藥學院，上海 201203)

二萜類化合物微生物轉化研究進展

吳亦晴，虞勁祥，程志紅Δ

(復旦大學 藥學院，上海 201203)

二萜類(diterpenoids)化合物是一類含有20個碳原子的天然萜類成分，許多著名的藥物分子如紫杉醇、穿心蓮內酯、銀杏內酯等均為二萜類化合物。由于該類化合物顯著的生物和藥理活性，已成為當今天然藥物研究領域的熱點。利用微生物轉化(microbial transformation)這種高度區(qū)域性和立體選擇性的結構修飾方法對二萜類化合物進行結構改造，已成為發(fā)現(xiàn)新型二萜類先導化合物的一種重要手段。本文就主要二萜類化合物(半日花烷型二萜、克羅烷型二萜、銀杏內酯型二萜；松香烷型二萜、海松烷型二萜、紫杉烷型二萜；貝殼杉烷型二萜、貝葉烷型二萜；假白欖烷二萜、金錢松二萜)的微生物轉化研究進行綜述，為該類化合物在微生物轉化體系下可能發(fā)生的化學反應類型、轉化產物的結構多樣性以及活性變化等提供科學參考。

二萜；微生物轉化；半日花烷；松香烷

二萜類(diterpenoids)化合物是由4個異戊二烯基單元組成、含有20個碳原子的一類天然化合物，其生源上都是由前體物焦磷酸香葉基香葉酯(geranylgeranyl-PP，GGPP)衍生而成，此類化合物廣泛存在于植物界、真菌、昆蟲和海洋生物中。二萜類化合物化學結構豐富多樣，根據(jù)骨架環(huán)系主要可分為鏈狀、單環(huán)、二環(huán)、三環(huán)、四環(huán)和大環(huán)二萜等多種類型(見圖1)。其多變的化學結構和豐富的自然界來源，決定了二萜類成分生物活性的多樣性，如具顯著抗癌活性的紫杉醇[1]、冬凌草甲素[2]和巨大戟醇[3]等；顯著抗炎活性的穿心蓮內酯類[4]；顯著心腦血管保護活性的銀杏內酯類[5]等等。這些活性化合物的發(fā)現(xiàn)使得二萜類化合物至今一直是藥學和天然產物化學研究中的熱點。

微生物轉化(microbial transformation，MT)是利用微生物在其在生長過程中合成的大量酶系的催化作用對化合物(底物)進行結構修飾的轉化反應[6]。微生物轉化利用腸道菌、放線菌、真菌等微生物作為發(fā)酵工廠，底物通過其酶系的作用發(fā)生多種化學反應，如氧化(羥基化、酮基化、脫氫)、水解、(脫)乙酰化、糖苷化等反應，少數(shù)底物在適當?shù)奈⑸镒饔孟聲l(fā)生特異性的碳原子遷移反應和骨架重排反應。早在上世紀50年代，微生物轉化就已經在甾體藥物結構合成領域成功應用，利用常見的根霉菌在甾體底物的C-11位合成羥基，進而極大地加速了甾體激素類藥物的合成效率和產率[7]。由于三萜類化合物在結構上與甾體類化合物的相似性，其非化學活潑位點難以用有機催化進行結構修飾，開始有越來越多研究采用微生物轉化法對三萜類化合物進行結構修飾和優(yōu)化[8-9]。

二萜類化合物結構復雜、骨架多變、來源廣泛，多具有明顯的生物和藥理活性。而微生物轉化具有區(qū)域選擇性高、立體選擇性強和反應類型多等特點。因此，近年來，有越來越多的研究者用微生物轉化對該類化合物進行結構修飾，獲得一些難以用化學合成、結構新穎的二萜衍生物，進而為新藥研發(fā)提供更具價值的先導化合物[9]。本文依據(jù)二萜類化合物的結構類型，對國內外研究較多的主要二萜類化合物的微生物轉化(不包括腸內菌轉化)進行概述。

圖1 主要二萜類化合物的骨架結構Fig.1 The major structure skeletons of diterpenoids

1 雙環(huán)類二萜的微生物轉化

1.1 半日花烷型二萜(Labdanes)的微生物轉化 半日花烷型二萜以十氫萘為母核，結構類型多變，根據(jù)其是否含有特殊的結構基團，可將其進一步分為一般半日花烷型、內酯環(huán)型、環(huán)氧型、螺環(huán)型、呋喃型和重排型。大多數(shù)半日花烷型二萜具有豐富的生物活性[10]，其中最具代表性的是從中藥穿心蓮Andrographispaniculata中分得的穿心蓮內酯類(andrographolides)和從毛喉鞘蕊花Coleusforskohlii中分得的毛喉素(forskolin)。該類化合物的結構多樣性和良好的生物活性促使許多研究者采用微生物轉化法對其進行結構修飾研究。對于一般半日花烷型二萜，酶催化反應主要發(fā)生在十氫萘骨架上，羥基化反應主要發(fā)生在C-2、C-3以及C-18位的角甲基上，環(huán)內雙鍵也易發(fā)生雙鍵重排與氧化反應。Aranda等[11]利用毛霉屬的Mucorplumbeus對香紫蘇醇(sclareol)、香紫蘇內酯(sclareolide)和淚杉醇(manool)進行微生物轉化研究，發(fā)現(xiàn)無論使用生長中的M. plumbeus還是過濾并水洗的菌絲，都能將香紫蘇醇轉化為3β、6α或18位羥基化產物。在同樣的轉化條件下，香紫蘇內酯可得到3β羥基化產物和其進一步的C-3羰基化產物，而淚杉醇則得到2α羥基化產物。該研究表明M.plumbeus可作為此類二萜的立體和區(qū)域選擇性羥基化手段，用于增強此類衍生物的水溶性及進一步修飾的位點。Haridy 等[12]利用黑曲霉Aspergillusniger對從菊科Madia屬多種植物中分得的一個C-7/8位環(huán)內雙鍵的半日花烷二萜(13R,14R,15-trihydroxylabd-7-ene)進行微生物轉化，除了得到C-3羥基化衍生物外，還得到一個8α,9β-不飽和酮類化合物。此外，Orden等[13]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉A.niger無法對C-8/9位環(huán)內雙鍵、不含五元環(huán)氧基團的半日花烷二萜發(fā)生轉化反應。比較2者的研究結果，說明黑曲霉對半日花烷二萜的生物轉化有嚴格的區(qū)域選擇性。Lin等[14]發(fā)現(xiàn)諾卡氏菌屬的Nocardiaaurantia可以將異柏油酸(isocupressic acid)轉化為降異柏油酸(nor-isocupressic acid)，即C-13/14位雙鍵通過環(huán)氧化中間體得到C-13羰基化產物。此研究結果表明，選擇合適的菌種也能在非十氫萘骨架上發(fā)生酶催化反應。

內酯環(huán)在半日花烷二萜骨架中存在較為普遍，典型化合物為穿心蓮內酯，是穿心蓮中抗炎作用的主要活性成分。關于穿心蓮內酯的微生物轉化研究有較多報道，如Wang等[15]利用毛霉屬的M.spinosu對穿心蓮丙素(neoandrographolide)進行結構修飾，并比較了轉化產物與底物的活性差異。研究結果表明，該微生物的酶系可以催化穿心蓮丙素發(fā)生羥基化、水解及糖苷化反應，其中雙鍵羥基化的轉化產物具有更好的抑制LPS誘導巨噬細胞釋放NO的活性。Deng等[16]用短刺小克銀漢霉Cunninghamellablakesleana對去氧穿心蓮內酯(deoxyandrographolide)進行微生物轉化研究，得到多個轉化產物，其中包括4個C-3羰基化產物、1個具C-1/2環(huán)內雙鍵的產物和1個內酯環(huán)開裂的產物。對比轉化產物和底物抑制LPS誘導巨噬細胞釋放NO的活性發(fā)現(xiàn)，具C-1/2位雙鍵的轉化產物可提高該抗炎活性，而C-3位羰基化對活性改變影響較小。而He等[17]用赭曲霉A.ochraceus對穿心蓮內酯(andrographolide)進行轉化，可得到其C-8/17位雙鍵羥基化產物、C-19羥甲基的羧基化產物以及C-12/13位雙鍵的遷移化產物。對轉化產物的人乳腺癌細胞(MCF-7)、人結腸癌細胞(HCT-116)和人惡性白細胞(leukemia)的細胞毒活性進行評價，發(fā)現(xiàn)轉化產物中同時具有8β羥基化、19位羧基化以及C-12/13位雙鍵遷移至C-11/12位的轉化產物細胞毒活性明顯高于底物。該研究表明，雖然微生物轉化為生物體進行解毒代謝的過程，但仍能從中獲取保留底物活性或活性增強的轉化產物。

1.2 克羅烷型二萜(Clerodanes)的微生物轉化 克羅烷型二萜的基本骨架也為十氫化萘，是半日花烷二萜的結構重排類型，按其是否存在特殊基團，可進一步分為一般克羅烷型、呋喃型、內酯型和環(huán)氧型。克羅烷型二萜的分布也較為廣泛，許多該類型二萜，尤其是其多氧取代的衍生物具有較強的昆蟲拒食、抗菌和抗腫瘤活性[18]。Choudhary等[19]通過植物病原菌Rhizopusstelonifer對克羅烷內酯(clerodane lactone)和克羅烷甲酯(clerodane methyl ester)進行了微生物轉化研究，除了得到A環(huán)和B環(huán)兩個六元環(huán)不同位置的羥基化產物外，兩底物還均得到呋喃環(huán)發(fā)生氧化開環(huán)的產物。值得注意的是，該開環(huán)的轉化產物與其在P450酶體外生物催化反應的產物一致[20]。Mafezoli等[21]用刺孢小克銀漢霉C.echinulata催化同樣含有呋喃環(huán)的克羅烷二萜，僅得到C-3位羥基化衍生物。與此不同的是，而上述Choudhary等的研究，發(fā)現(xiàn)可在克羅烷二萜骨架的多個非活潑碳上都可以發(fā)生羥基化反應，同時轉化產物具有高度的立體選擇性[19]。由此可見，轉化底物的微小差別以及微生物轉化體系的不同，可導致轉化反應的不同，進一步說明了微生物轉化的特異性和選擇性。

1.3 銀杏內酯型二萜(Ginkgolides)的微生物轉化 銀杏內酯類是銀杏葉中所獨有的成分，骨架中含有六個五元環(huán)(其中包括一個螺壬烷、一個四氫呋喃環(huán)和三個內酯環(huán))和一個叔丁基。銀杏內酯類是公認的血小板活化因子受體拮抗劑，其中活性最強的是銀杏內酯B，其次為銀杏內酯A，但目前對其的微生物轉化研究報道較少。Ding等[22]采用食用真菌Coprinuscomatus對銀杏內酯類化合物進行了微生物轉化研究，發(fā)現(xiàn)多種銀杏內酯類化合物經羥基化反應可轉化成活性更好的銀杏內酯B，且部分轉化產率高達88%。

2 三環(huán)類二萜的微生物轉化

2.1 松香烷型二萜(Abietanes)的微生物轉化 松香烷二萜基本骨架為氫化菲，C-4位存在一個偕二甲基，其代表性的化合物是從唇形科植物迷迭香Rosmarinusofficinalis中分得的鼠尾草酸(carnosic acid)。van Beek 等[23]對從歐洲赤松Pinussylvestris中分得的一個微生物毒性成分脫氫樅酸(dehydroabietic acid)進行了微生物轉化，分別以兩種真菌Phlebiopsisgigantean和Trametesversicolor為轉化體系，采用HPLC-DAD-ELSD法進行跟蹤檢測，從兩株菌株發(fā)酵產物中得到種類不同的氧化產物，主要為在發(fā)生在氫化菲骨架C-1、C-7和邊鏈C-17位的羥基化反應產物，以及C-7位的羰基化反應產物。而Fraga等[24]同樣以脫氫樅酸的類似物dehydroabietanol和teideadiol為底物，采用毛霉屬M.plumbeus進行轉化，也得到了C-1和C-17位羥基化產物，但羰基化反應發(fā)生在C-2位。以C-20位為羧基的鼠尾草酸為底物，利用諾卡氏菌屬的Nocardiasp. NRRL 5646進行轉化，則得到C-7羥基與C-20羧基發(fā)生分子邁克爾加成的產物-鼠尾草酚(carnosol)[25]。綜合以上研究結果發(fā)現(xiàn)，羥基化及其進一步的氧化反應主要發(fā)生在飽和的十氫萘環(huán)和偕二甲基上，而駢合的苯環(huán)基本不發(fā)生轉化反應。

松香烷二萜中的碳原子常發(fā)生遷移，除常見的甲基遷移外，一些分子骨架中的碳原子也易發(fā)生遷移。雷公藤二萜是衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygiumwilfordii的主要有效成分，屬于松香烷型二萜C-18位甲基遷移的產物，形成特有的A環(huán)α,β-不飽和內酯結構[26]。雷公藤二萜具有免疫抑制和抗腫瘤等多種顯著的生理活性，但由于腎毒性大，其臨床應用受到一定的限制。果德安教授課題組利用黑曲霉A.niger對雷公藤主要成分雷公藤甲素(triptolide)和雷公藤內酯酮(triptonide)進行轉化反應，分別得到4個新雷公藤甲素衍生物(5α-羥基雷公藤甲素、19α-羥基雷公藤甲素、19β-羥基雷公藤甲素和1β-羥基雷公藤甲素)以及3個新雷公藤內酯酮衍生物(5α-羥基雷公藤內酯酮、16-羥基雷公藤內酯酮和17-羥基雷公藤內酯酮)。活性評價結果表明，除C-19羥基化產物外，其他轉化產物均表現(xiàn)出對人胃癌細胞BGC-823、人宮頸癌細胞Hela和人白血病細胞HL-60等較強的體外細胞毒活性，但均比底物略有下降[27]。Chen 等[28]利用粗糙脈孢菌Neurosporacrassa也對雷公藤內酯酮衍生物(14-deoxy-14-methylenetriptolide)進行了微生物轉化，但僅得到其C-5羥基化產物。值得注意的是，雷公藤二萜B/C環(huán)上特殊的三元氧環(huán)均未有酶催化發(fā)生開環(huán)反應的報道。

丹參酮二萜類成分是唇形科植物丹參Salviamiltiorrhiza的主要脂溶性有效成分，其結構為松香烷型C-20降二萜[29]。以雅致小克銀漢霉C.elegans為轉化體系，隱丹參酮(cryptotanshinone)為底物，得到一對C-3位羥基化差向異構體和C-18位羥基化產物，該轉化產物與隱丹參酮經灌胃小鼠膽汁中的代謝產物結構一致[30]。該研究結果的重要意義在于，用微生物轉化試驗可用于預測及合成藥物在哺乳動物體內的代謝產物，且微生物轉化法具有微量代謝產物易制、耗費低、重復性強等顯著優(yōu)點。

2.2 海松烷型二萜(Pimaranes)的微生物轉化 與松香烷二萜一樣，海松烷二萜最初也是從松香中分離出來的，根據(jù)分子中手性中心的差異可以分為4大類：海松烷型、異海松烷型、對映-海松烷型和對映-異海松烷型。海松烷型二萜具有解痙和肌肉松弛等活性。Fraga等[31]用弗基克羅赤霉Gibberellafujikuroi對蒲包花屬植物Calceolariapetioalaris中分得的異海松烷型二萜進行了微生物轉化，得到一系列C-7/8位雙鍵發(fā)生氧化反應的轉化產物。此后，該研究組利用該菌對含有C-9/11雙鍵的海松烷二萜酸(1)進行生物轉化，得到C-1羰基化產物和一個經Baeyer-Villiger 氧化重排的七元內酯環(huán)產物(2)(見圖2)[32]。該重排產物推測可能是由C-2-oxo插入氧原子形成的，該研究是第一次發(fā)現(xiàn)弗基克羅赤霉可以催化Baeyer-Villiger氧化重排反應。Severiano等[33]分別用真菌圍小叢殼菌Glomerellacingulata和魯西毛霉菌M.rouxii對一個具有抗菌作用的異海松烷二萜(ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid)進行微生物轉化，得到3個雙鍵重排產物，其中一個產物存在8α,9β-不飽和酮結構，推測該產物是先由底物生成C-7/8位環(huán)氧中間體，該中間體進而氧化形成鄰二醇中間體，最后經脫水而成。通過比較以上海松烷型二萜微生物轉化研究發(fā)現(xiàn)，除了骨架中C-1、C-2和C-7位容易發(fā)生羥基化反應外，環(huán)內雙鍵也容易發(fā)生氧化或重排反應。

圖2 海松烷型二萜酸(1)經Gibberella fujikuroi轉化得到的結構重排產物(2)Fig.2 A rearrangement product(2)obtained by biotransformation of 1 with Gibberella fujikuroi

2.3 紫杉烷型二萜(Taxanes)的微生物轉化 紫杉烷型二萜是從紅豆杉屬植物TaxusLinn.中得到的一類二萜成分，其中最具代表性的化合物紫杉醇(paclitaxel)，是目前臨床上使用最廣泛的抗癌藥物之一。對紫杉烷二萜的生物轉化研究引起了各國學者的重視，以期將紫杉醇類似物轉化為紫杉醇或者尋找到活性和水溶性更好的紫杉醇衍生物。主要的微生物催化反應包括氧化反應、雙鍵還原反應、酯水解反應、酰化反應、重排反應和C-7位羥基的差向異構化反應等[34]。近年來研究發(fā)現(xiàn)灰色鏈霉菌Streptomycesgriseus能將一紫杉烷衍生物(4)轉化成罕見的帶有罕見6/8/6/5環(huán)狀結構的重排產物(5)(見圖3)[35]。戴均貴教授課題組對紫杉烷型二萜的微生物轉化及生物合成進行了較為深入的研究，利用蘭色犁頭霉Absidiacoerulea和日內瓦毛霉M.genevensis2種培養(yǎng)體系對4個紫杉烷型二萜(sinenxan、yunanxane和2個sinenxan衍生物)進行轉化，得到53個轉化產物，其中對轉化產物9α-羥基取代sinenxan A的進一步化學反應得到的9α-肉桂酰取代sinenexan A，具有良好的逆轉腫瘤多藥耐藥活性[36]。該研究的重要意義在于，對于二萜結構中不活潑的碳原子，可利用微生物酶進行選擇性羥基化反應，并在此基礎上結合化學反應進行結構修飾，這是一個合成先導化合物的有效途徑之一。

圖3 紫杉烷型二萜(4)經Streptomyces griseus轉化得到的結構重排產物(5)Fig.3 A rearrangement product(5)obtained by biotransformation of 4 with Streptomyces griseus

同樣含有紫杉烷骨架的化合物還有三尖杉寧堿(cephalomannine)，用一種從東北紅豆杉根際土壤中分離得到的細菌Luteibactersp.，可將三尖杉寧堿轉化生成8個代謝產物，其中兩個產物為糖苷化產物。糖基的引入能大大提高三尖杉寧堿的水溶性，增加其成藥性[37]。

3 四環(huán)類二萜的微生物轉化

3.1 貝殼杉烷型二萜(Kauranes)的微生物轉化 貝殼杉烷型二萜是一類具有重要生物活性的二萜類化合物，自然界以對映-貝殼杉烷型(ent-kauranes)化合物居多。此類化合物在醫(yī)藥和食品方面有著廣泛的應用，有許多此類化合物的微生物轉化研究報道。Fraga等[38]采用毛霉類M.plumbeus對從植物Sideritiscandicans分得的對映-貝殼杉二萜類化合物candidiol進行了生物轉化，得到C-3和C-11位羥基化產物，以及一個C-6/11橋氧環(huán)化合物，并推測這個橋氧環(huán)化合物是由C-16/17形成的三元氧環(huán)開環(huán)形成的。該課題組又用M.plumbeus轉化candidiol的C-4位羥基差向異構體，也得到發(fā)生相似橋氧環(huán)反應的產物，同時得到2個糖苷化產物[38]，這是首次利用M.plumbeus對二萜類化合物進行糖苷化反應的報道。Candicandiol和epicandicandiol是2個C-7位羥基差向異構化的貝殼杉烷型二萜，利用該毛霉菌對它們進行微生物轉化發(fā)現(xiàn)，2者轉化產物主要區(qū)別在前者能得到9β-羥基化物，后者能得到3α-羥基化物，推測可能是由于C-7位羥基的立體方向影響了氧化酶在A環(huán)和B環(huán)的羥化行為[39]。

3.2 貝葉烷型二萜 (Beyeranes)的微生物轉化 貝葉烷型二萜包括貝葉烷類及對映-貝葉烷類，在自然界多數(shù)以對映體的形式存在。對于該類二萜的生物活性文獻報道較少，代表性化合物為異甜菊醇(isosteviol)及其C-3位取代的類似物，具有良好的昆蟲拒食活性。Shwu-Jiuan Lin課題組采用多種微生物系統(tǒng)對異甜菊醇進行了微生物轉化研究，得到多個非活性碳位點的羥基化衍生物[40-44]。當異甜菊酮通過Baeyer-Villiger反應生成酯后的產物(6)，再用真菌班尼小克銀漢霉C.bainieri進行微生物轉化，可得到兩個重排產物(7-8)和一個裂環(huán)產物(9)，其結構經X射線單晶體衍射確定(見圖4)[44]。為了得到更多結構新穎且具有生物活性的貝葉烷型化合物，該課題組將異甜菊醇經過堿水處理得到肟化產物，再經A.niger和犁頭霉屬的A.pseudocylindrospora進行微生物轉化，不僅得到一定數(shù)量的C-1或C-7位羥基化衍生物，還得到含有內酰胺基團和腈基基團的衍生物[43,45]。以上研究提示，異甜菊醇C-8/13位橋環(huán)的結構改造可以結合化學反應與微生物轉化法，能得到更多結構新穎、活性提高的貝葉烷型二萜。此外，異甜菊醇的生物轉化產物7β-hydroxy-isosteviol以及11β、12β或17位發(fā)生羥基化的異甜菊醇具有抑制埃-巴二氏病毒抗原(Epetein-Barr virus early antigen)的活性[46]。

圖4 貝葉烷二萜衍生物(6)經Cunninghamella bainieri轉化得到的結構重排產物(7-8)和內酯環(huán)開環(huán)產物(9)Fig.4 Two rearrangement products(7-8)and a lactone ring-cleavage product(9) obtained by biotransformation of 6 with Cunninghamella bainieri

3.3 其他四環(huán)二萜的微生物轉化 貝殼杉烷型、阿替生烷型(astisanes)、貝葉烷型和綽奇烷型(trachylobanes)二萜在生物合成和化學結構上有著緊密聯(lián)系，四類結構在酸水條件下易通過碳正離子重排相互轉換。其中，綽奇烷二萜與其他3種四環(huán)二萜最大的區(qū)別在于其C-12、C-13和C-16位形成三元碳環(huán)，嚴格說為五環(huán)二萜。有相關研究表明微生物產生的酶系可以促使四類二萜發(fā)生骨架轉化。Fraga等用M.plumbeus對一個對映-綽奇烷二萜(trachinodiol，9)進行轉化，得到一系列A環(huán)羥基化產物和一個對映-貝殼杉烷二萜(10)，并推測該對映-貝殼杉烷二萜產物是通過開環(huán)、重排和氧化產生的(見圖5)[47]，說明了綽奇烷型與貝殼杉烷型二萜之間的轉化。該重排過程與之前推測的毒馬草屬SideritisL.植物中對映-綽奇烷二萜與對映-貝殼杉烷二萜相互衍生的途徑相似[47]。類似的，Leverrier等[48]用匍枝根霉R.arrhizus對木瓣樹屬植物Xylopiacaudata中分得的一個對映-綽奇烷二萜(ent-trachyloban-18-oic acid，11)進行轉化，得到了3個對映-貝殼杉烷型二萜骨架的羥基化衍生物(12-14)。該結果進一步表明綽奇烷型二萜能經微生物酶發(fā)酵后可轉化為貝殼杉烷型二萜(圖6)。此外，還得到一個綽奇烷型骨架重排的化合物(15)(圖6)，該重排產物的三元環(huán)由C-12/13/16位重排至C-11/12/13位，此類二萜骨架是首次在自然界發(fā)現(xiàn)[48]。

圖5 綽奇烷二萜衍生物(trachinodiol，9)經Mucor plumbeus轉化得到的結構重排產物(10)Fig.5 A rearrangement product(10)obtained by biotransformation of 9 with Mucor plumbeus

另有研究表明貝葉烷型二萜和貝殼杉烷型二萜經過微生物發(fā)酵后也能發(fā)生骨架轉化。Chang等[41]用灰色鏈霉菌S.griseus和班尼小克銀漢霉C.bainieri對骨架為對映-貝殼杉烷型二萜16α,17-環(huán)氧甜菊醇(steviol-16α,17-epoxide)進行轉化，得到8個對映-貝葉烷型二萜羥基化衍生物。該研究表明，特定的微生物酶系能將貝殼杉烷型二萜轉化為貝葉烷型二萜。

4 大環(huán)二萜的微生物轉化

常見的大環(huán)二萜類骨架包括西松烷型(cembranes)、假白欖烷型(jatrophanes)、續(xù)隨子烷型(lathyranes)、巴豆烷型(tiglianes)、瑞香烷型(daphnanes)、巨大戟烷型(ingenanes)、麻風樹烷型(jatropholanes)及曼西烷型(myrsinanes)等，這類多元大環(huán)二萜類化合物從生源上絕大多數(shù)是從香葉基香葉醇磷酸酯衍生而成。大環(huán)二萜類衍生物多具有明顯生理活性，如從大戟科植物中發(fā)現(xiàn)的巴豆烷型二萜具有顯著的抗腫瘤和抗HIV病毒活性[49]，一直是天然藥物研究中的熱點，但目前為止，對該類二萜的微生物轉化研究報道較少。

假白欖烷二萜多數(shù)具有如羥基、酯、酮等氧化官能團，該類二萜主要分布在大戟科大戟屬等植物中。此類二萜具有多種生物活性，最引人注目的是其逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性活性和P-蛋白抑制活性。Pertino等[50]用黑曲霉A.niger對從大戟科植物Jatrophaisabelli中分得的一個假白欖型二萜假白欖酮(jatrophone)進行微生物轉化，得到其C-8/12閉環(huán)的產物，但該轉化產物對人胃癌細胞AGS和人胚肺成纖維細胞MRC-5的細胞毒活性降低。

金錢松二萜是從土槿皮中分得的一系列結構獨特的二萜類化合物，土槿皮PseudolaricisCortex為傳統(tǒng)中藥，為松科植物金錢松Pseudolarixkamefer的干燥根皮。該類二萜具有三環(huán)骨架，其中五元環(huán)與七元環(huán)反式稠合，并在稠合碳位置上含有一個內酯環(huán)。這類二萜化合物有明顯的抗真菌、抗生育、抗血管生成等活性。Zhang等[51]用真菌球毛殼菌Chaetomiumglobosum對土槿皮乙酸(pseudolaric acid B，圖6)進行微生物轉化，分別得到18-酰基丙氨酸(pseudolaric acid B 18-oyl-alanine)和18-酰基絲氨酸(pseudolaric acid B 18-oyl-serine)取代的產物，并經X射線單晶體衍射確定其結構和絕對構型，不過其抗真菌活性要明顯低于底物土槿皮乙酸。

圖6 對映綽奇烷二萜衍生物(11)經Rhizopus arrhizus轉化得到的結構重排產物(12-15)Fig.6 Four rearrangement products(12-15)obtained by biotransformation of 11 with Rhizopus arrhizus

5 小結與展望

微生物轉化是改變各種二萜衍生物底物結構的重要手段，其中最主要的修飾結構反應是區(qū)域選擇性和立體選擇性羥化反應，羥基化位置與構型是由底物結構特點和微生物體酶系共同決定的。不同微生物體系轉化底物得到的產物數(shù)量和產率有很大不同，而且轉化產物在轉化體系下可進行多步的轉化反應。通過微生物轉化方法，幾乎可實現(xiàn)在二萜衍生物的所有位置進行羥基化。這些羥基化產物不但增加了水溶性，而且為進一步的結構修飾提供活性位點。另一類重要的轉化反應為重排反應，這種復雜的酶催化體系下的碳骨架重排結構為研究藥物的構效關系以及各種二萜結構之間的生源關系提供了重要的科學素材。此外，通過微生物轉化產物與底物在哺乳動物中的代謝產物比較，可對藥物在人體內的代謝途徑和產物進行預測，利用微生物轉化制備相關代謝產物，具有成本低、重現(xiàn)性好、易批量制備等特點。

但是現(xiàn)階段的微生物轉化尚具有較大的盲目性。微生物轉化主要還是通過底物與微生物混合體系共發(fā)酵方法進行生物轉化。這個孵化過程變量多、體系復雜、難以進行分解研究，在合成上無法進一步闡述真正催化化學反應的酶系特點。加之菌株一旦發(fā)生變異，酶系類型也可能發(fā)生變化。因此，現(xiàn)階段微生物轉化產物并不能提前預測反應結果，更難以從底物合成目標轉化產物。因此，為了增加生物合成效率，應增加對微生物轉化菌株酶系的研究，利用多種生化手段，對轉化酶系的分離、提純、表征和功能進行研究，闡明底物在特定酶系下的轉化過程和轉化機制，最終實現(xiàn)微生物轉化的機制清楚和目標可控的目標。

[1] Wani MC,Taylor HL,Wall ME,et al.Plant antitumor agents.VI.Isolation and structure of taxol,a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifoli[J].J Am Chem Soc,1971,93(9):2325-2327.

[2]左海軍,李丹,吳斌,等.冬凌草的化學成分及其抗腫瘤活性[J].沈陽藥科大學學報,2005,22(4):258-263.

[3]Ferreira MJU,Duarte N,Reis M,et al.Euphorbia and Momordica metabolites for overcoming multidrug resistance[J].Phytochem Rev,2014,13(4): 915-935.

[4]Zhou B,Zhang DY,Wu XM.Biological activities and corresponding SARs of andrographolide and its derivatives[J].Mini-Rev Med Chem,2013,13(2):298-309.

[5]Nabavi SM,Habtemariam S,Daglia M,et al.Neuroprotective effects of ginkgolide B against ischemic stroke:a review of current literature[J].Curr Topics Med Chem,2015,15(21):2222-2232.

[6]Loughlin WA.Biotransformations in organic synthesis[J].Biores Technol,2000,74(1):49-62.

[7]Mahato SB,Garai S.Advances in microbial steroid biotransformation[J].Steroids,1997,62(4):332-345.

[8]Parra A,Rivas F,Garcia-Granados A,et al.Microbial transformation of triterpenoids[J].Mini-Rev Org Chem,2009,6(4):307-320.

[9]Bhatti HN,Khera RA.Biotransformations of diterpenoids and triterpenoids:a review[J].J Asian Nat Prod Res,2014,16(1):70-104.

[10]Peters RJ.Two rings in them all:The labdane-related diterpenoids[J].Nat Prod Rep,2010(27),1521-1530.

[11]Aranda G,El-Kortbi MS,Lallemand JV.Microbial transformation of diterpenes:hydroxylation of sclareol manool and derivatives by Micrastur plumbeus[J].Tetrahedron,1991,47(39):8339-8350.

[12]Haridy MSA,Ahmed AA,Doe M.Microbiological transformation of two labdane diterpenes,the main constituents of Madia species,by two fungi[J].Phytochemistry,2006,67(14):1455-1459.

[13]Orden AA,Cifuente DA,Borkowski EJ,et al.Stereo- and regioselective hydroxylation of grindelic acid derivatives by Aspergillus niger[J].Nat Prod Res,2005,19(6):625-631.

[14]Lin SJ,Rosazza JPN.Microbial transformations of isocupressic acid[J].J Nat Prod,1998,61(7):922-926.

[15]Wang Y,Chen L,Zhao F,et al.Microbial transformation of neoandrographolide by Mucor spinosu (AS 3.2450)[J].Mol Catal B Enzym,2011,68(1):83-88.

[16]Deng S,Zhang BJ,Wang CY,et al.Microbial transformation of deoxyandrographolide and their inhibitory activity on LPS-induced NO production in RAW 264.7 macrophages[J].Bioorg Med Chem Lett,2012,22(4):1615-1618.

[17]He XJ,Wang YH,Hu H,et al.Novel bioconversion products of andrographolide by Aspergillus ochraceus and their cytotoxic activities against human tumor cell lines[J].J Mol Catal B:Enzym,2011,68(1):89-93.

[18]Rico-Martinez M,Medina FG,Marrero JG,et al.Biotransformation of diterpenes[J].Rsc Advances,2014,4(21):2046-2069.

[19]Choudhary MI,Mohammad MY,Musharraf SG,et al.Biotransformation of clerodane diterpenoids by Rhizopus stolonifer and antibacterial activity of resulting metabolites[J].Phytochemistry,2013(90):56-61.

[20]Peterson LA.Reactive metabolites in the biotransformation of molecules containing a furan ring[J].Chem Res Toxicol,2013,26(1):6-25.

[21]Mafezoli J,Oliveira MC,Paiva JR,et al.Stereo and regioselective microbial reduction of the clerodane diterpene 3,12-dioxo-15,16-epoxy-4- hydroxycleroda-13(16),14-diene[J].Nat Prod Commun,2014,9(6):759-762.

[22]Ding HX,Zhang ZC,Cao SN,et al.Transformation of multi-component ginkgolide into ginkgolide B by Coprinus comatus[J].BMC Biotechnol,2015(15):17.

[23]van Beek TA,Claassen FW, Dorado J,et al.Fungal biotransformation products of dehydroabietic acid[J].J Nat Prod,2007,70(2):154-159.

[24]Fraga BM,Hernández MG,Artega JM,et al.The microbiological transformation of the diterpenes dehydroabietanol and teideadiol by Mucor plumbeus[J].Phytochemistry, 2003,63(6):663-668.

[25]Hosny M,Johnson HA,Ueltschy AK,et al.Oxidation,reduction,and methylation of carnosic acid by Nocardia[J].J Nat Prod,2002,65(9):1266-1269.

[26]Kupchan SM,Court WA,DaileyJr RG,et al.Triptolide and tripdiolide,novel antileukemic diterpenoid triepoxides from Tripterygium wilfordii[J].J Am Chem Soc,1972,94(20):7194-7195.

[27]葉敏,寧黎麗,占紀勛,等.雷公藤內酯及蟾毒配基類化合物的生物轉化研究進展[J].北京大學學報(醫(yī)學版),2004,36(1):82-89.

[28]Chen Z,Li JA,Lin H,et al.Biotransformation of 14-deoxy-14-methylenetriptolide into a novel hydroxylation product by Neurospora crassa[J].J Biosci Bioeng,2013,116(2):199-202.

[29]馬曉馳,果德安.中藥活性成分生物轉化的研究思路與方法[J].中國天然藥物,2007,5(3):162-168.

[30]Sun JH,Yang M,Ma XC,et al.Microbial biotransformation of cryptotanshinone by Cunninghamella elegans and its application for metabolite identification in rat bile[J].J Asian Nat Prod Res,2009,11(6):482-489.

[31]Fraga BM,Hernández MG,González P,et al.The biotransformation of 18-hydroxy-9-epi-ent-pimara-7,15-diene by Gibberella fujikuroi[J].Phytochemistry,2000, 53(3):395-399.

[32]Fraga BM,Guillermo R,Hernandez MG,et al.Biotransformation of two ent-pimara-9(11),15-diene derivatives by Gibberella fujikuroi[J].J Nat Prod,2009,72(1):87-91.

[33]Severiano ME,Simao MR,Porto TS,et al.Anticariogenic properties of ent-pimarane diterpenes obtained by microbial transformation[J].Molecules,2010,15(12):8553-8566.

[34]Liu X,Chen RD,Xie D,et al.Microbial transformations of taxadienes and the multi-drug resistant tumor reversal activities of the metabolites[J].Tetrahedron,2012, 68(47):9539-9549.

[35]Liu X,Xie D,Chen RD,et al.A furantaxane with an unusual 6/8/6/5 ring system and potent tumor MDR reversal activity obtained via microbial transformation[J].Org Lett,2012,14(16):4106-4109.

[36]Dai JG,Qu RJ,Zou JH,et al.Structural diversification of taxanes by whole-cell biotransformation[J].Tetrahedron,2008,64(35):8102-8116.

[37]Li JH,Dai JG,Chen XG,et al.Microbial transformation of cephalomannine by Luteibacter sp[J].J Nat Prod,2007,70(12):1846-1849.

[38]Fraga BM,de Alfonso I,Gonzalez-Vallejo V,et al.Microbial transformation of two 15α-hydroxy-ent-kaur-16-ene diterpenes by Mucor plumbeus[J].Tetrahedron,2010,66(1):227-234.

[39]Fraga BM,Alvarez L,Suarez S.Biotransformation of the diterpenes epicandicandiol and candicandiol by Mucor plumbeus[J].J Nat Prod,2003,66(3):327-331.

[40]Hsu FL,Hou CC,Yang LM,et al.Microbial transformations of isosteviol[J].J Nat Prod,2002,65(3):273-277.

[41]Chang SF,Yang LM,Hsu FL,et al.Transformation of steviol-16r,17-epoxide by Streptomyces griseus and Cunninghamella bainieri[J].J Nat Prod,2006,69(10):1450-1455.

[42]Chang SF,Yang LM,Lo CH,et al.Microbial transformation of isosteviol and bioactivities against the glucocorticoid/ androgen response elements[J].J Nat Prod,2008,71(1):87-92.

[43]Chang SF,Chou BH,Yang LM,et al.Microbial transformation of isosteviol oxime and the inhibitory effects on NF-(B and AP-1 activation in LPS-stimulated macrophages[J].Bioorg Med Chem,2009,17(17):6348-6353.

[44]Chou BH,Yang LM,Chang SF,et al.Microbial transformation of isosteviol lactone and evaluation of the transformation products on androgen response element[J].J Nat Prod,2008,71(4):602-607.

[45]Chou BH,Yang LM,Chang SF,et al.Transformation of isosteviol lactam by fungi and the suppressive effects of its transformed products on LPS-induced NOS expression in macrophages[J].J Nat Prod,2011,74(6):1379-1385.

[46]Akihisa T,Hamasaki Y,Tokuda H,et al.Microbial transformation of isosteviol and inhibitory effects on Epstein-barr virus activation of the transformation products[J].J Nat Prod,2004,67(3):407-410.

[47]Fraga BM,Gonzalez-Vallejo V,Guillermo R.On the biotransformation of ent-trachylobane to ent-kaur-11-ene diterpenes[J].J Nat Prod,2011,74(9):1985-1989.

[48]Leverrier A,Martin MT,Servy C,et al.Rearranged diterpenoids from the biotransformation of ent-trachyloban-18-oic acid by Rhizopus arrhizus[J].J Nat Prod,2010,73(6):1121-1125.

[49]Wang HB,Wang XY,Liu LP,et al.Tigliane diterpenoids from the Euphorbiaceae and Thymelaeaceae families[J].Chem Rev,2015,115(9):2975-3011.

[50]Pertino M,Schmeda-Hirschmann G,Santos LS,et al.Biotransformation of jatrophone by Aspergillus niger ATCC 16404[J].Zeitschrift für Naturforschung B,2007,62(2):275-279.

[51]Zhang X,Ye M,Gong YJ,et al.Biotransformation of pseudolaric acid B by Chaetomium globosum[J].Process Biochem,2011,46(10):2064-2067.

(編校：王冬梅)

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Research progress on microbial transformations of diterpenoids

WU Yi-qing, YU Jing-xiang, CHENG Zhi-hongΔ

(School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203, China)

Diterpenoids are important plant secondary metabolites, which contain 20 carbons. Many well-known drug molecules belong to diterpenoids, such as paclitaxel, andrographolides and ginkgolides. Diterpenoids are a research hotspot in natural product chemistry. Structural modification of diterpenoids by microbial transformations is an important approach for discovery of leading compounds of diterpenoids derivatives. This review article focuses on the microbial transformation of diterpenoids(Labdanes,Clerodanes,Ginkgolides;Abietanes,Pimaranes,Taxanes;Kauranes,Beyeranes;Jatrophanes,Pseudolaricis,et al) including different reaction types, the structure diversity of biotransformed products, and their biological activity changes between substrates and products.

diterpenoids; microbial transformation; labdanes; abietanes

吳亦晴，女，碩士在讀，研究方向：中藥成分的微生物轉化，E-mail: yiqingwu13@fudan.edu.cn；程志紅，通信作者，男，博士，副研究員，研究方向：中藥成分的微生物轉化，E-mail: chengzhh@fudan.edu.cn。

R284.3

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.03