Rack1與β-catenin在胃癌組織中的表達與臨床意義

王一，郭琳，劉乙蒙，任麗莉，劉超，肖建英Δ

(1.遼寧醫學院 研究生院，遼寧 錦州 121001；2.錦州市食品藥品檢驗所，遼寧 錦州 121000)

Rack1與β-catenin在胃癌組織中的表達與臨床意義

(1.遼寧醫學院 研究生院，遼寧 錦州 121001；2.錦州市食品藥品檢驗所，遼寧 錦州 121000)

目的 研究蛋白激酶1活化受體(protein kinase 1 activation receptors，Rack1)和β-連環蛋白(β-catenin)在胃癌組織中的表達情況，以及與胃癌臨床病理特征的關系，探討二者的相關性及臨床意義。方法 采用免疫組織化學SP法檢測Rack1與β-catenin在70例胃癌組織和30例距癌組織邊緣10 cm以上的癌旁胃組織中的表達情況。結果 與癌旁胃組織相比，Rack1在胃癌組織中的表達明顯降低(P<0.01)，β-catenin在胃癌組織中出現明顯的膜表達缺失(P<0.01)。胃癌組織中Rack1蛋白的高表達率、β-catenin膜表達的缺失率均在不同TNM分期、腫瘤的分化程度以及有無淋巴結轉移方面差異有統計學意義(P<0.01)，而Rack1和β-catenin在胃癌組織的表達水平與不同年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤浸潤深度方面的差異無統計學意義。胃癌組織中Rack1蛋白表達與β-cantenin膜表達缺失呈顯著負相關(r=-0.691，P=0.000)。結論 Rack1和β-catenin蛋白的異常表達可能共同參與胃癌的發生發展，并影響胃癌的淋巴轉移。

胃癌；Rack1；β-catenin；免疫組織化學

胃癌是一類常見的消化道惡性腫瘤，每年死亡人數在各類惡性腫瘤中位居第二[1]。在臨床表現中，各種病理類型的胃癌發生發展與轉歸有所不同，其調控的分子機制尚不清楚。蛋白激酶1活化受體(protein kinase 1 activation receptors，Rack1)是一種細胞構架蛋白并且參與諸多細胞內信號通路的傳導，Rack1有助于使與其結合的蛋白質或分子穩定在失活或者活化狀態[2]。β-連環蛋白(β-catenin)是調控Wnt信號傳導的核心分子，Wnt/β-catenin通路是最經典的一條Wnt信號通路，廣泛存在于多細胞生物體內[3]，此通路的障礙或異常調控影響著腫瘤的發生與發展。在目前的研究中，有關Rack1在胃癌組織中的表達以及對胃癌預后影響的報道極為少見。本實驗應用免疫組織化學方法檢測Rack1與β-catenin在胃癌組織中的表達及分析二者的相關性，并探討二者表達水平與胃癌不同臨床病理特征間的關系，為胃癌早期診斷、治療及預后判斷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集遼寧醫學院附屬第一醫院2012年3月7日～2013年6月20日期間，病理科切除的70例胃癌標本。其中男性43例，女性27例；年齡≥60歲的26例，<60歲的44例；腫瘤直徑≤5 cm的28例，>5 cm的42例；未侵及漿膜的34例，侵及漿膜的36例；有淋巴結轉移的47例，無淋巴結轉移的23例；有遠隔轉移的33例，無遠隔轉移的37例；高-中分化30例，低分化40例；Ⅰ-Ⅱ期41例，Ⅲ-Ⅳ期29例；患者術前均未接受過化療與放療。另選取30例距癌組織邊緣10 cm以上的癌旁正常胃組織標本作為對照，以上標本臨床病例資料完整。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：鼠抗人β-catenin單克隆抗體購于美國BD公司(產品編號：262505)，兔抗人單克隆Rack1抗體購自MILLIPORE公司(產品編號：MABN1036)；DAB顯色試劑盒購置于北京中杉金橋生物技術有限公司(產品編號：ZLI-9017)。PV二步法試劑盒購置于北京中杉金橋生物技術有限公司(產品編號：PV-9003)。

1.2.2 儀器：OlympusDP72型顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.3 實驗方法 采用免疫組織化學SP法，將組織切片置于60 ℃烤箱中2 h，組織切片按實驗常規步驟脫蠟水化。高壓鍋將抗原修復液加熱至沸騰，140 ℃高壓修復3 min后冷卻至50 ℃以下。3%的H2O2去除氫化物酶，去背景染色。加入一抗，Rack1(1：200)，β-catenin(1：200)4 ℃過夜保存。從4 ℃冰箱取出，室溫復溫1 h后滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復染10 min、鹽酸酒精分化5 s、自來水沖洗、脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片、顯微鏡下觀察。同時用磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對照，用已知的Rack1與β-catenin的陽性表達標本做陽性對照。

1.4 結果判定

1.4.1 Rack1表達：Rack1蛋白的陽性表達主要定位于細胞漿，Rack1陽性細胞計數是指在400倍光鏡下隨機選取每張切片的5個視野，每個高倍視野計數多于300個細胞。采用雙評分法，陽性細胞所占的百分比<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。陽性細胞染色強度評分，無著色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。綜合評分由兩類積分相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～9分為陽性(++)，>10分為強陽性(+++)。(+)～(++)為低表達，(+++)以及(+++)以上為高表達。

1.4.2 β-catenin表達：從細胞膜、細胞質和細胞核著色3個方面判斷β-catenin的表達特征。β-catenin的免疫組織化學結果參照文獻[4]評定，陽性染色呈棕黃色。在光學顯微鏡下，隨機選擇5個高倍視野進行觀察，每一視野計數多于300個細胞，細胞膜陽性細胞率>70%評定為正常表達，反之為膜表達缺失。細胞質或細胞核陽性表達，陽性細胞數>10%為異位表達。膜表達缺失與異位表達均為陽性表達。所有切片均由兩位資深病理科醫生應用雙盲法進行臨床評價。

1.5 統計學方法 數據采用SPSS17.0軟件進行統計分析，計數資料采用例數或率表示，2組間比較采用χ2檢驗分析,2指標之間的相關性采用Spearman相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Rack1在胃癌組織和癌旁胃組織中的表達 Rack1蛋白在癌旁胃組織和胃癌組織中的陽性表達均定位于細胞質(見圖1B、C、D)。Rack1在胃癌組織(圖1C、D)中的表達明顯低于癌旁胃組織(圖1B)，并且Rack1在高中分化的胃癌組織(圖1C)中的表達量高于低分化胃癌組織(圖1D)。

圖1 Rack1在胃癌組織和癌旁胃組織中的表達(SABC×400)A：陰性對照；B：癌旁胃組織；C：高中分化胃癌組織；D：低分化胃癌組織Fig.1 Expressions of Rack1 in tissues of carcinoma and para-carcinoma(SABC×400)A：negative control; B：para-carcinoma tissue；C：well-differentiated and severe-differentiated gastric carcinoma tissue；D: poorly differentiated gastric carcinoma tissue

分析結果顯示，Rack1在癌旁胃組織中高表達率為86.7%(26/30)，在胃癌組織中高表達率為34.3%(24/70)，胃癌組織中Rack1的高表達率明顯低于癌旁胃組織(χ2=23.048，P<0.05)。見表1。

表1 70例胃癌組織和30例癌旁胃組織中Rack1表達

*P<0.05，與癌旁胃組織比較，compared with para-carcinoma tissue

2.2 β-catenin在胃癌組織和癌旁胃組織中的表達 β-catenin在癌旁胃組織中的陽性表達主要定位于細胞膜(圖2B)，而在胃癌組織中的陽性表達主要定位于細胞質和細胞核(圖2C、D)，即β-catenin在胃癌組織中出現明顯的膜表達缺失。

圖2 β-catenin在胃癌組織和癌旁正常胃組織中的表達(SABC×400) E：陰性對照；F：癌旁胃組織；G：高中分化胃癌組織；H：低分化胃癌組織 Fig.2 Expressions of β-catenin in tissues of carcinoma and para-carcinoma(SABC×400)A：negative control; B：para-carcinoma tissue；C：well-differentiated and severe-differentiated gastric carcinoma tissue；D: poorly differentiated gastric carcinoma tissue

分析結果顯示，β-catenin在癌旁胃組織中發生膜表達缺失率為10.0%(3/30)，在胃癌組織中發生膜表達缺失率為62.9%(44/70)。胃癌組織中β-catenin的膜表達缺失率明顯高于癌旁胃組織(χ2=23.048，P<0.05)。見表2。

表2 70例胃癌組織和30例癌旁胃組織中β-catenin表達

*P<0.05，與癌旁胃組織比較，compared with para-carcinoma tissue

2.3 Rack1與β-catenin蛋白在胃癌組織的表達與臨床病理參數的關系 胃癌組織中Rack1蛋白表達的高低與TNM分期、腫瘤的分化程度以及有無淋巴結轉移有關。Rack1在Ⅰ-Ⅱ期胃癌組織中的表達高于在Ⅲ-Ⅳ期胃癌組織中的表達(P<0.01)；在高-中分化胃癌組織中Rack1的表達高于低分化胃癌組織(P<0.01)；Rack1在無淋巴結轉移的胃癌組織中的表達高于有淋巴結轉移的胃癌組織(P<0.01)。

同時，β-catenin膜表達的缺失率也與腫瘤的分化程度、TNM分期以及有無淋巴結轉移有關。β-catenin在低分化胃癌組織的膜表達缺失明顯高于高中分化的胃癌組織(P<0.01)；β-catenin在Ⅲ、Ⅳ期胃癌標本中的膜表達缺失明顯高于Ⅰ、Ⅱ期胃癌標本(P<0.01)；并且β-catenin在有淋巴結轉移的胃癌組織中的膜表達缺失顯著高于無淋巴結轉移的胃癌組織中的膜表達缺失(P<0.01)。而Rack1和β-catenin在胃癌組織的表達水平與年齡、性別等因素無關。見表3。

表3 Rack1與β-catenin蛋白在胃癌組織中的表達與臨床病理參數的關系(n)

2.4 胃癌組織中Rack1蛋白表達與β-catenin膜表達缺失的相關性分析 在70例胃癌組織中，Rack1蛋白高表達、β-catenin膜表達缺失為4例；β-catenin蛋白高表達、β-catenin膜表達正常為20例；Rack1蛋白低表達、β-catenin膜表達缺失為40例；Rack1蛋白低表達、β-catenin膜表達正常為6例。采用Spearman相關分析表明，Rack1蛋白表達水平越低，β-catenin膜表達缺失越高；相反Rack1蛋白表達越高，β-catenin膜表達缺失越低，二者呈顯著負相關(r=-0.691，P=0.000)。見表4。

表4 胃癌組織中Rack1蛋白表達水平與β-catenin蛋白膜表達缺失的相關性(n)

3 討論

研究表明，Rack1與G蛋白β亞基具有高度同源性，并且Rack1所具有的七葉螺旋槳結構，可促進Rack1與其它蛋白質相結合[5]。Rack1作為調控多條重要腫瘤侵襲轉移信號通路的關鍵基因，亦可整合不同的信號通路，協調關鍵信號分子相互作用，在腫瘤細胞功能活動中發揮重要作用[6-7]。Rack1可以通過激活蛋白激酶C(PKC)來促進腫瘤的侵襲轉移和多種細胞功能[8-9]。有研究發現，Rack1在胃癌組織中表達下調，且其表達水平與腫瘤的分化程度和浸潤深度顯著相關[10-11]。本研究發現Rack1在胃癌組織中的表達量明顯低于癌旁正常胃組織(P<0.05)，且表達水平的高低與TNM分期、腫瘤的分化程度、以及有無淋巴結轉移有關。即：Rack1在Ⅰ-Ⅱ期胃癌組織中的表達高于在Ⅲ-Ⅳ期胃癌組織中的表達(P<0.01)；在高-中分化組中Rack1的表達高于低分化組(P<0.01)；Rack1在無淋巴結轉移組中的表達高于有淋巴結轉移組(P<0.05)，提示Rack1表達水平可能影響胃癌的發生發展與轉移。

Wnt/β-catenin通路是Wnt通路中一條最經典的通路，其核心部件在進化中是高度保守的。當Wnt信號通路發生異常調控時，會影響細胞正常的生長、分化、增殖與遷移，從而導致腫瘤的發生[12-13]。有文獻報道，在Wnt信號缺失的情況下，胞質內的β-catenin會被磷酸化而降解，隨β-catenin含量的上升，它進入并聚集在細胞核內，與特定的轉錄因子相互作用，激活Wnt/β-catenin信號通路靶基因的轉錄，引起細胞遷移能力和細胞極性的改變，從而誘發腫瘤的發生[14]。本研究表明，胃癌組織中β-catenin膜表達的缺失率與腫瘤的分化程度、TNM分期以及有無淋巴結轉移有關。β-catenin膜表達的缺失率隨胃癌分化程度的降低而升高(P<0.05)； β-catenin在Ⅲ期-Ⅳ期胃癌標本中的膜表達缺失率明顯高于Ⅰ期-Ⅱ期胃癌標本(P<0.01)；并且β-catenin的膜表達缺失率也與有無淋巴結轉移有關，有淋巴結轉移組的膜表達缺失率明顯高于無淋巴結轉移組的膜表達缺失率(P<0.05)。本實驗結果提示，β-catenin膜表達缺失率的高低可能與胃癌的發生發展及淋巴轉移有關。

文獻報道[15]， Rack1顯著促進Wnt/ β-catenin信號通路，并促進其核心分子β-catenin的降解，使其信號通路的活化受到抑制。由于Rack1與β-catenin在腫瘤的發生發展及侵襲轉移中起重要作用，所以本研究聯合檢測Rack1與β-catenin在胃癌中表達的相關性。結果發現：Rack1表達水平與β-catenin膜表達缺失呈顯著負相關(r=-0.691，P=0.000)。提示二者表達量的變化可能與胃癌的發生發展及轉移等過程有關，所以聯合檢測Rack1與β-catenin在胃癌組織中的表達情況有助于進一步探討胃癌發展趨勢，為預后判斷提供有利的實驗依據。

綜上所述， Rack1和β-catenin蛋白的異常表達可能共同參與胃癌的發生發展，并影響胃癌的淋巴轉移。因此，深入研究Rack1與β-catenin蛋白，將有助于進一步探討胃癌發生的分子機制。在臨床治療中，聯合檢測這兩個蛋白，有望為腫瘤的治療提供有效的新靶點。

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(編校：王儼儼)

Expressions and clinical significance of Rack1 and β-catenin in gastric carcinoma tissue

WANG Yi-zhao1, GUO Lin2, LIU Yi-meng1, REN Li-li1, LIU Chao1, XIAO Jian-ying1Δ

(1.School of Graduates,Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China; 2.Jinzhou Institute for Food and Drug Control, Jinzhou 121000, China)

ObjectiveTo explore the expression levels of protein kinase 1 activation receptors(Rack1)and β-catenin in gastric carcinomas and the relations with clinical pathological parameters, and correlation between Rack1 and β-catenin and their significance.MethodsImmunohistochemical SP method was used to detect the expressions of Rack1 and β-catenin protein in 70 cases of human gastric carcinomas and 30 cases of gastric mucosa(distance from tumor edge ≥10 cm).ResultsCompared to the gastric surrounding tissues, the expression of Rack1 in gastric cancer decreases apparently(P<0.01)，and the expression of β-catenin deletion was more significant in the membrane of gastric cancer(P<0.01).There were significant difference in high expression of Rack1 protein and deletion expression of β-catenin of gastric carcinomas between different TNM stage, tumor differentiation and lymphatic metastasis(P<0.01),while there were no significant difference between different age, gender, diameter of tumor and the depth of neoplasm invasiveness.The expression of Rack1 and the deletion of β-catenin in membrane had a negative correlation(r=-0.691，P=0.000).ConclusionThe abnormal expression of Rack1 and β-catenin may be relevant to the occurrence and development of gastric carcinomas It also affects the lymphatic metastasis of gastric carcinomas.

gastric carcinomas; Rack1; β-catenin; immunohistochemical

遼寧省科技廳項目(2013225305)

王一曌，女，碩士在讀，研究方向：生物化學與分子生物學,E-mail：babyyizhao@126.com；肖建英，通信作者，女，博士，教授，研究方向：生物化學與分子生物學，E-mail：xiaojianying@lumn.edu.cn。

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.08