布洛芬混懸滴劑抑菌劑劑量篩選與抑菌效力研究

夏哲林，周彬

(1.浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院 藥劑科，浙江 臺(tái)州 318000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部，浙江 溫州 325000)

布洛芬混懸滴劑抑菌劑劑量篩選與抑菌效力研究

夏哲林1Δ，周彬2

(1.浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院 藥劑科，浙江 臺(tái)州 318000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部，浙江 溫州 325000)

目的 篩選適用于布洛芬混懸滴劑的抑菌劑劑量。方法 用不同配比濃度的抑菌劑對(duì)布洛芬混懸滴劑的抑菌效果考察，篩選出適宜的抑菌劑加入量，根據(jù)抑菌效力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)不同濃度抑菌劑的抑菌效力。結(jié)果 0.4%的苯甲酸鈉對(duì)微生物生長繁殖有良好的抑制作用，且為最低有效劑量。結(jié)論 0.4%的苯甲酸鈉可以作為布洛芬混懸滴劑的抑菌劑。

布洛芬混懸滴劑；劑量篩選；抑菌效力；苯甲酸鈉

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器：UV2550紫外分光光度計(jì)(日本島津儀器(蘇州)有限公司)；SPX-150C型恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；BI01200-Ⅱ-A2生物潔凈安全柜(上海振梓創(chuàng)空氣凈化設(shè)備有限公司)；LMQ.6立式壓力蒸氣滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；BS210S電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.1.2 試藥：菌種：銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) [CMCC(B)10104]、大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B) 44102]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC( B) 26003]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]均購自中國食品藥品檢定研究院醫(yī)學(xué)菌種保藏中心，工作中均使用第3代傳代菌種。

培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào):151013)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):151025)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號(hào):150922)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):151018)均購自北京三藥科技開發(fā)公司。各培養(yǎng)基均經(jīng)適用性試驗(yàn)，結(jié)果符合現(xiàn)行藥典要求。

1.1.3 樣品：根據(jù)布洛芬混懸滴劑的處方制成含不同濃度抑菌劑的樣品。a組(含0.1%苯甲酸鈉的供試品)；b組(含0.2%苯甲酸鈉的供試品)；c組(含0.3%苯甲酸鈉的供試品)；d組(含0.4%苯甲酸鈉的供試品)；e組(含0.5%苯甲酸鈉的供試品)。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備：

① 細(xì)菌培養(yǎng)物的制備：在TSA培養(yǎng)基斜面上接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌，將培養(yǎng)基置于35 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用適量無菌生理鹽水洗脫上述瓊脂培養(yǎng)基表面，將培養(yǎng)物洗脫，采用比濁法制成每1 mL含菌數(shù)約為108cfu的菌懸液。

當(dāng)苗有3對(duì)葉以后，每周對(duì)池水消毒1次，每2個(gè)月更換1次池水。施肥用復(fù)合肥(氮∶磷∶鉀=15∶15∶15)加水配成800倍液均勻注入水池中；同時(shí)用磷酸二氫鉀1 000倍液在早上或傍晚進(jìn)行葉面追肥。復(fù)合肥每月追施1次，葉面肥每月追施2次。經(jīng)煉苗后，幼苗長至高10～15厘米、莖粗2～5毫米時(shí)即可移栽。

② 真菌培養(yǎng)物的制備：白色念珠菌接種到SDA培養(yǎng)基斜面上，將培養(yǎng)基置于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用適量無菌0.9%NaCl溶液洗脫上述瓊脂培養(yǎng)基表面，將培養(yǎng)物洗脫，采用比濁法制成每1 mL含菌數(shù)約為108cfu的菌懸液。黑曲霉采用SDA培養(yǎng)基，同樣置培養(yǎng)箱中于培養(yǎng)7 d，溫度設(shè)為25 ℃。要求制取每1 mL含孢子數(shù)108cfu的孢子懸液，方法如下：取新鮮培養(yǎng)物，用5 mL含0.05%(mL/mL) 聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫孢子，并用無菌試管收集孢子懸液，用適量溶劑稀釋制得。

1.2.2 抑菌劑濃度篩選：

① 第一次篩選實(shí)驗(yàn)：考察含不同濃度苯甲酸鈉的供試品，對(duì)5種試驗(yàn)菌的抑制作用。觀察試驗(yàn)菌生長與否，分別用“+”和“-”表示，然后根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果尋找適當(dāng)?shù)臐舛葏^(qū)間進(jìn)行正式試驗(yàn)。文中實(shí)驗(yàn)對(duì)照苯甲酸鈉的常用量，分別選取0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%濃度的抑菌劑進(jìn)行試驗(yàn)。

② 第二次篩選實(shí)驗(yàn)：根據(jù)第一次篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果中對(duì)所選抑菌劑抗性作用最強(qiáng)的微生物為試驗(yàn)菌進(jìn)行第二次篩選。供試品試驗(yàn)組分配如下：a組(含0.1%苯甲酸鈉的供試品)；b組(含0.2%苯甲酸鈉的供試品)；c組(含0.3%苯甲酸鈉的供試品)；d組(含0.4%苯甲酸鈉的供試品)；e組(含0.5%苯甲酸鈉的供試品)。每組取供試品1瓶(裝量10 mL)，接種銅綠假單孢菌，使接種后供試品中接菌量最終濃度約為105～106 cfu/mL，充分混合，于25 ℃避光條件培養(yǎng)。

1.2.3 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)[2]：根據(jù)第2次篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳供試品中抑菌劑的添加量，進(jìn)行抑菌效力測定。供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。取含有最佳抑菌劑添加量的供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成1:10的供試液。加入5種試驗(yàn)菌液，混勻，使每mL供試液中含菌量不大于100 cfu，采用平皿法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.4 抑菌效力試驗(yàn)：

① 供試品制備：取含有最佳抑菌劑添加量的供試品5瓶(裝量10 mL)，分別轉(zhuǎn)移至5支具塞無菌玻璃試管中，備用。

② 供試品接種：取上述5批供試液，每批5份，置于無菌試管中，接種“1.2.1”項(xiàng)下的制備好的菌懸液，接種量為100 μL，使每ml供試品中接菌量為105～106 cfu，振蕩搖勻，然后將接種后的供試品置溫度設(shè)為25 ℃的培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)。

③ 存活菌數(shù)測定：根據(jù)口服制劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的間隔時(shí)間，于供試品剛接種的0、14、28 d，精密量取上述加菌供試液1 mL，稀釋成適當(dāng)?shù)南♂尲?jí)。菌數(shù)測定方法按“1.2.3”項(xiàng)下適用性試驗(yàn)后的方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。全部采用直接接種法，細(xì)菌和真菌不同之處在于培養(yǎng)基的選擇，分別是TSA培養(yǎng)基和SDA培養(yǎng)基，觀察計(jì)數(shù)，最終以對(duì)數(shù)值表示即lg值。

2 結(jié)果

2.1 篩選實(shí)驗(yàn)

2.1.1 第一次篩選實(shí)驗(yàn)：結(jié)果見表1。濃度高于0.5%的抑菌劑表現(xiàn)出對(duì)全部5種試驗(yàn)菌較強(qiáng)的抑制作用，而低于0.1%濃度的抑菌劑則表現(xiàn)出對(duì)部分菌或全部試驗(yàn)菌無抑制作用。故筆者對(duì)此區(qū)間的抑菌劑濃度進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)分，計(jì)劃濃度如下：0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%。

表1 第一次篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 第二次篩選實(shí)驗(yàn)：首次篩選實(shí)驗(yàn)中銅綠假單胞菌對(duì)所選擇的抑菌劑抗性作用最強(qiáng)，故選擇0.1%～0.5%濃度的抑菌劑以銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌進(jìn)行第二次篩選。結(jié)果見表2。5個(gè)試驗(yàn)組中，d組和e組供試品的細(xì)菌計(jì)數(shù)14 d菌數(shù)下降值大于3.0 lg，且28 d菌數(shù)未有增加，表現(xiàn)出有效的抑制作用。即抑菌劑含量在0.4%以上可有效抑制銅綠假單胞菌的生長繁殖。而a組供試品則表現(xiàn)出在此劑量下無抑菌作用。b組和c組雖然有抑菌作用，但是抑菌效果可能未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。綜合考慮上述因素，最低有效抑菌濃度應(yīng)在0.3%～0.4%之間。由于需要考慮到在藥物的生產(chǎn)過程中，抑菌劑添加量的允許偏差是±20%。因此，在藥物的處方設(shè)計(jì)階段應(yīng)對(duì)抑菌劑處方濃度可能產(chǎn)生的偏差即最低至80%處方濃度進(jìn)行有效性確認(rèn)，保證抑菌作用的有效性不受投料偏差的影響。故選擇d組(含0.4%苯甲酸鈉)作為供試品中抑菌劑的添加量，進(jìn)行了抑菌效力的測定。

表2 第二次篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn) 結(jié)果見表3。

表3 1:10供試液平皿法驗(yàn)證結(jié)果

2.3 抑菌效力試驗(yàn) 結(jié)果表明，14 d細(xì)菌數(shù)下降不少于3.0對(duì)數(shù)值，14 d到28 d細(xì)菌數(shù)未見增加；真菌計(jì)數(shù)結(jié)果同樣令人滿意，14 d菌數(shù)下降不少于3.0對(duì)數(shù)值，14 d到28 d細(xì)菌數(shù)未見增加，故抑菌劑含量為0.40%的供試品抑菌效力試驗(yàn)結(jié)果符合判定標(biāo)準(zhǔn)。見表4～表7。

表4 5種試驗(yàn)菌初始菌量計(jì)數(shù)結(jié)果(cfu/mL)

表5 供試品14、28 d菌量計(jì)數(shù)結(jié)果(cfu/mL)

表6 抑菌效力結(jié)果判定表

表7 抑菌效力試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

3 討論

《中華人民共和國藥典》2015年版將原2010年版中的抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則升級(jí)為抑菌效力檢查法。其中口服制劑、口腔黏膜制劑、直腸給藥制劑中抑菌劑的抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)較《中華人民共和國藥典》2010年版中原2類供試品和3類供試品更加嚴(yán)苛[4]，由原標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌數(shù)14 d下降1.0 lg或2.0 lg提高到3.0 lg，真菌數(shù)14 d不再增加改為下降1.0 lg。已上市品種的抑菌劑效力極可能達(dá)不到中國藥典2015年版抑菌效力的要求[5-7]，藥品生產(chǎn)廠家或研發(fā)機(jī)構(gòu)需對(duì)原處方重新進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)以滿足新版藥典的相關(guān)要求，同時(shí)監(jiān)管部門應(yīng)增加抑菌效力項(xiàng)目的監(jiān)督抽查力度以加強(qiáng)對(duì)抑菌劑的監(jiān)管。

“抑菌效力檢查法(通則1121)”規(guī)定存活菌數(shù)測定方法適用性試驗(yàn)試驗(yàn)菌的回收率不得低于70%，其計(jì)算方法參照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢査：微生物計(jì)數(shù)法(通則1105)”，即試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值大于0.7[8]。與上版藥典相比，未明確規(guī)定需做3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，本文仍然采用上版要求，進(jìn)行了3次平行實(shí)驗(yàn)。

文中布洛芬混懸滴劑為多劑量包裝的兒童用藥，在使用過程中需多次開啟，存在微生物污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，稍有不慎，即有可能對(duì)患兒造成傷害。筆者通過對(duì)不同濃度的抑菌劑苯甲酸鈉試驗(yàn)，力求在更低的濃度范圍，在保證藥品安全穩(wěn)定有效的同時(shí)，盡量接近最低有效濃度。為了提高工作效率，參考相關(guān)文獻(xiàn)，選擇對(duì)苯甲酸鈉抗性相對(duì)較大的銅綠假單胞菌進(jìn)行了兩步篩選。試驗(yàn)結(jié)果表明，0.4%的苯甲酸鈉加入量可以滿足工業(yè)生產(chǎn)中可能的±20%偏差下的抑菌效力。

綜上所述，參照現(xiàn)行《中國藥典》關(guān)于抑菌劑和抑菌效力檢查法的相關(guān)規(guī)定，本處方對(duì)方法中的各試驗(yàn)菌有較強(qiáng)的抑制能力，0.4%的苯甲酸鈉可用作布洛芬混懸滴劑的抑菌劑。

[1] 胡皓夫.現(xiàn)代兒科治療學(xué)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，1999：216-219.

[2]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].四部，2015：23-24.

[3]上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥物制劑部.藥用輔料應(yīng)用技術(shù)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2001：344-362.

[4]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].二部,2010：215-216.

[5]劉艷，王志宏，曲金瑤,等.乙酰半胱氨酸口服溶液抑菌劑抑菌效力研究[J].中國藥事，2015，34(3)：152-155.

[6]江志杰，李玉立，劉文杰,等.吡諾克辛滴眼液的抑菌效力評(píng)價(jià)[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2015，32(6):704-708.

[7]李玨，王知堅(jiān)，相露婷.芐達(dá)賴氨酸滴眼液中抑菌劑的檢測與評(píng)價(jià)[J].藥物分析雜志，2015，35(5):884-888.

[8]肖璜，林吉恒，陳萬勝,等.四國藥典中抑菌效力檢查法的比較[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2014，15(1):10-12.

(編校：王儼儼)

Screening concentration of antimicrobial preservative for ibuprofen suspension and its antimicrobial effectiveness

XIA Zhe-lin1Δ, ZHOU Bin2

(1.Department of Pharmacy, Taizhou Central Hospital, Taizhou 318000, China; 2.Department of Pharmacy, The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China)

ObjectiveTo investigate the optimal concentration of antimicrobial preservative that was added to ibuprofen suspension.MethodsThe antimicrobial effectiveness of antimicrobial preservatives at different ratio were evaluated and the optimal concentration was screened.The antimicrobial effectiveness of antimicrobial preservatives was evaluated by criterion of inhibitory effectiveness.ResultsThe growth of test microorganisms were inhibited effectively by 0.4% sodium benzoate added to ibuprofen suspension which was also the minimum effective dosage.Conclusion0.4% sodium benzoate could be used as antimicrobial preservative for ibuprofen suspension.

ibuprofen suspension; inhibition dose; antimicrobial effectiveness; sodium benzoate

夏哲林，通信作者，男，本科，主管藥師，研究方向：藥事管理及藥物臨床試驗(yàn)，E-mail：2858141295@qq.com。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.51