HPLC同時測定清火膠囊中5種成分的含量

伍國怡

【摘 要】 目的：建立HPLC法測定清火膠囊中靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚含量的方法。方法：采用Eclipse XDB（4.6×250 mm）色譜柱；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫；流速為0.80 ml/min；檢測波長：289 nm。結果：靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚與其相鄰質峰能完全分離。靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的線性范圍分別為：0.050～5.00μg/ml（r=0.9999）、0.391～39.1μg/ml（r=0.9999）、0.696～69.6μg/ml（r=0.9997）、0.216～21.6μg/ml（r=1.0000）、0.212～21.2μg/ml（r=1.0000）；方法回收率均不低于97%。結論：該方法靈敏度高、簡便、準確，可用于清火膠囊的質量控制。

【關鍵詞】 HPLC；靛玉紅；蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素；大黃酚；清火膠囊

【中圖分類號】R286.0 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）11-0019-03

Abstract：Objective HPLC method was established for the determination of Indirubin、Aloe-emodin、Rhein、Emodin and Chrysophanol in Qinghuo capsules.Methods Eclipse XDB（4.6×250mm） column was used with the mobile phase of methonal-0.1% phosphate acid solution by gradient elutio，The flow rate was 0.80ml/min. The detection wavelength was set at： 289nm.Results Indirubin、Aloe-emodin、Rhein、Emodin and Chrysophanol could be completely separated from interfacing impurity peaks. The HPLC method showed agood linear relationship in the range of 0.050～5.00μg/ml（r=0.9999）for Indirubin，0.391～39.1μg/ml（r=0.9999） for Aloe-emodin，0.696～69.6μg/ml（r=0.9997）for Rhein，0.216～21.6μg/ml（r=1.0000） for Emodin，0.212～21.2μg/ml（r=1.0000）for Chrysophanol. Recoveries for the three components were all above 97%. Condusion The method is sensitive， simple， accurate， and can be used for the quality control of Qinghuo capsules.

Keywords：HPLC；Indirubin；Aloe-emodin；Rhein；Emodin；Chrysophanol；Qinghuo Capsules

清火膠囊是由大青葉、大黃、石膏、薄荷腦等藥物經適宜加工制成的中成藥，收載于國家食品藥品監督管理局標準[1]，具有清熱泄火，通便的功效。臨床用于咽喉腫痛，牙痛，頭目眩暈，口鼻生瘡，大便不通等。原標準只有大黃素、大黃酚的含量測定項，文獻也無同時測定清火膠囊中靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚5種成分的報道。研究參考有關文獻[2-11]，建立HPLC法測定清火膠囊中大青葉的主要成分靛玉紅，大黃的主要成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚含量的方法。該方法靈敏度高、簡便、準確，可用于清火膠囊的質量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200系列高效液相色譜儀（Agilent 1200 LC色譜工作站、G1322A DEGASSER 溶劑脫氣機、G1311A 四元泵、G1329A（ALS）自動進樣器、G1314B VWD 紫外檢測器）；德國賽多利斯 CP225D電子天平；西班牙COBOS AW-120自動電子天平；上海必能信SB3200WS 超聲波清洗器。

1.2 材料 靛玉紅（批號：717-200204）、蘆薈大黃素（批號：110795-201007）、大黃酸（批號：0757-200206）、大黃素（批號：110756-200110）和大黃酚（批號：110796-201319）對照品均購自中國藥品生物制品檢定所。清火膠囊（批號：140111、141006，江西藥都仁和制藥有限公司；批號：140607，浙江泰康藥業集團有限公司）。甲醇為色譜純、水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），其梯度見表1；流速：0.8ml/min；檢測波長：289 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μl。理論板數按靛玉紅計應不低于2500。

2.2 供試品溶液的制備 取本品10粒的內容物，精密稱定，研細，取約1粒的量，精密稱定，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40KHz）30min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，濾液用0.45μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 陰性對照溶液的制備 按處方中藥味的比例，分別自配不含大黃和不含大青葉的群藥，按其工藝制成陰性對照樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.4 系統適用性試驗 分別取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液注入色譜儀，色譜圖見圖1。在該色譜條件下，靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚與相鄰組分峰的分離度均大于1.5，理論板數按靛玉紅峰計不低于2500，陰性樣品在與對照品色譜峰相應的位置上無吸收峰，表明處方中的其他成分對測定結果無影響。

2.5 線性關系的考察 精密稱取靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚對照品適量，以甲醇為溶劑，分別配制成對照品貯備溶液（即含靛玉紅0.4996mg/ml、蘆薈大黃素0.3910mg/ml、大黃酸0.3480mg/ml、大黃素0.2156mg/ml、大黃酚0.2119mg/ml的溶液）倍比稀釋法配置成系列質量濃度的溶液。進樣10μl，測定各組分峰面積。以各組分濃度（C）橫坐標，相應峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。靛玉紅： A=91.267 C+9.9152，r=0.9999，線性范圍：0.050～5.00μg/ml；蘆薈大黃素：A=38.850C-6.6232，r=0.9999，線性范圍：0.391～39.1μg/ml；大黃酸：A=121.823C-12.269，r=0.9997，線性范圍：0.696～69.6μg/ml；大黃素：A=83.911C-3.6159，r=1.0000，線性范圍：0.216～21.6μg/ml；大黃酚：A=46.881C-1.5005，r=1.0000，線性范圍：0.212～21.2μg/ml。

2.6 精密度試驗 精密吸取同一供試品（批號：140111）溶液10μl，按上述色譜條件進樣，測定靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的峰面積，重復進樣6次，其RSD分別為0.76%、1.04%、1.28%、0.91%、1.46%。

2.7 [JP3]重復性試驗 取同一批樣品（批號：140111）共6份，精密稱定，分別制備供試品溶液，各進樣10μl，測定靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的含量，分別為：0.0075、0.0073、0.0073、0.0077、0.0077、0.0074mg/粒，平均：0.0075mg/粒（RSD為2.45%）；0.245、0.244、0.247、0.245、0.248、0.242mg/粒，平均：0.245mg/粒（RSD為0.87%）；0.100、0.096、0.097、0.099、0.095、0.098mg/粒，平均：0.098mg/粒（RSD為1.92%）；0.139、0.142、0.138、0.135、0.141、0.137mg/粒，平均：0.139mg/粒（RSD為1.86%）；0.530、0.536、0.534、0.525、0.529、0.528mg/粒，平均：0.530mg/粒（RSD為0.76%）。

2.8 穩定性試驗 取同一供試品（批號：140111）溶液，分別在0、1、2、4、6、8、10、12h時進樣10μl，記錄色譜峰面積，計算靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的峰面積的RSD分別為0.59%、1.53%、1.28%、0.94%、1.62%。

2.9 加樣回收率試驗 精密量取已測定靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的清火膠囊（批號：140111）樣品9份（每份約0.5粒的量），精密稱定，于①②③樣品中分別精密加入靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚對照品貯備液4、150、60、150、600μl，于④⑤⑥樣品中分別精密加入靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚對照品貯備液8、300、120、300、1200μl，于⑦⑧⑨樣品中分別精密加入靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚對照品貯備液12、150、180、450、1800μl，制備供試品溶液，進樣測定，計算加樣回收率，結果見表2。

2.10 樣品測定 取不同批號的清火膠囊，按供試品溶液制備方法處理，進行HPLC分析，以外標一點法計算靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的含量。結果見表3。

3 討論

3.1 實驗曾嘗試用單一流動相甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶[KG-*2]25）進行洗脫，部分組份分離效果不佳，加大水相組分的比例進行洗脫，結果發現分離效果大大提高，但出峰時間較長，影響工作效率；而選擇現正文所用流動相，待測的5個成分分離較好且峰形較佳。

3.2 檢測波長的選擇：中國藥典[2]收載大青葉中靛玉紅檢測波長為289nm，大黃中4個成分的檢測波長為254nm，由于靛玉紅含量較低，故選擇289nm作為檢測波長。

3.3 提取溶劑及時間的選擇：分別用甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇作為提取溶劑超聲提取，結果發現甲醇提取率最高。用甲醇超聲提取30、40、50、60min等后進行對比考察，結果顯示30min已經能夠將目標組份提取完全。

3.4 由表3可知，不同廠家不同批號生產的清火膠囊中靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的含量有差別，特別是靛玉紅的含量，差別很大，提示不同的生產工藝制備出的清火膠囊內在質量有差異。現有的清火膠囊的質量控制方法較簡單，不能有效地控制清火膠囊質量。該方法經方法學研究表明，實驗所建立的方法簡單、可靠，可作為評價清火膠囊的質量標準之一。

參考文獻

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（收稿日期：2016.04.07）