β2腎上腺素能受體基因Arg16Gly和Gln27Glu多態性與高海拔地區藏族人群原發性高血壓的相關性研究

李星輝，喬燕，馬玉安，齊文華，李彩霞，李寶鵑

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β2腎上腺素能受體基因Arg16Gly和Gln27Glu多態性與高海拔地區藏族人群原發性高血壓的相關性研究

李星輝，喬燕，馬玉安，齊文華，李彩霞，李寶鵑

摘要

目的: 檢測高海拔地區藏族人群β2腎上腺素能受體（β2-AR）基因Argl6Gly和Gln27Glu多態性，并研究其與原發性高血壓的相關性。

方法：選擇原發性高血壓患者（原發性高血壓組）385例及正常對照（對照組）297例為研究對象，通過SNaPshot微測序技術測定其基因型和等位基因，對在兩組人群中的頻率分布進行對比。

結果: β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu多態性的基因型和等位基因頻率原發性高血壓組和對照組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），進一步進行不同性別人群間的對比分析，差異亦無統計學意義（P＞0.05）。

結論：未觀察到β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu多態性與高海拔地區藏族人群原發性高血壓的相關性。

關鍵詞 受體, 腎上腺素能β2 ；基因；高血壓；藏族

Objective: To investigate β2 adrenergic receptor (β2-AR) gene polymorphism, Arg16Gly, Gln27Glu and essential hypertension (EH) occurrence in Tibetan population living at high altitude area.

Methods: Our research included in 2 groups: EH group, n=385 patients and Control group, n=297 normal healthy subjects. β2-AR polymorphisms of Arg16Gly and Gln27Glu were detected by Snapshot mini-sequencing technique and their frequencies were compared between 2 groups and male, female genders.

Results: The genotype and allele frequency distributions of Arg16Gly and Gln27G1u were similar between 2 groups, P＞0.05; there were no significant differences between male and female genders, P＞0.05.

Conclusion: No obvious relationship was found between β2-AR gene polymorphism (Arg16Gly, Gln27Glu) and EH occurrence in Tibetan population living at high altitude area.

Key words Receptors, adrenergic, beta-2; Gene; Hypertension; Tibetan

(Chinese Circulation Journal, 2016, 31:372.)

高血壓發病與遺傳因素和環境因素有關，大約25%～40%的血壓升高程度與遺傳基因相關[1]。到目前為止，有200多個基因被列為原發性高血壓候選基因，近年來研究較多的原發性高血壓易感性有腎素—血管緊張素—醛固酮系統（RAAS）、交感神經系統、細胞膜離子轉運系統等基因[2]。但諸多文獻顯示，這些相關基因的單核苷酸多態性（SNPs）與原發性高血壓的關系，不同種族、不同人群研究結果不盡相同，存在較多差異,爭議較多，因此值得進一步深入分析探討。在原發性高血壓候選基因識別研究中，β2腎上腺素能受體（β2-AR）基因是較受重視的一個候選基因。近年來盡管國內外已在這方面進行了一些研究，但結果不一，提示不同種族和人群該基因SNPs的分布及其在原發性高血壓的發病機制中所起的作用存在差異[3，4]。鑒于遺傳背景對遺傳性疾病發病的影響，我們選擇地處我國西北甘肅省高海拔少數民族地區藏族人群作為研究對象，采用病例—對照基礎上的關聯分析研究,即以確診的原發性高血壓患者作為病例,以不患有該病但具有可比性的個體作為對照,應用SNaPshot技術比較原發性高血壓組與對照組中各基因型和等位基因的頻率和差異,以期探討此基因多態性與這一人群原發性高血壓發生發展的關聯性。

1 資料與方法

研究對象：2014-03至2014-10，采用隨機、分層、整群抽樣的方法,對甘肅省甘南藏族自治州2個城區、8個農村定居地區的18歲以上人群進行橫斷面流行病學調查。在10個抽樣地區的醫療機構單位共調查18歲以上藏族成人682例，其中原發性高血壓患者（原發性高血壓組）385例，正常對照（對照組）297例。所有研究對象為世居高原地區人群，兩組之間無親緣關系，無異族通婚史。本研究前期通過甘肅省人民醫院倫理委員會批準，調查獲得當地政府同意，所有受調查者均簽署了知情同意書。

血壓測量：采用經核準的水銀柱血壓計測量右臂坐位血壓共3次。測量前30 min, 要求調查對象不能飲酒、吸煙、飲咖啡或茶及進行較為劇烈的活動,休息5 min 后測量血壓。原發性高血壓組患者排除繼發性高血壓、心肌病、心臟瓣膜病、先天性心臟病、糖尿病、肝和腎功能疾患等，均符合2010年中國高血壓防治指南的高血壓診斷標準[5]。對照組為從未接受過降壓治療并且靜息時收縮壓＜140 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）和舒張壓＜90 mmHg者,無高血壓家族史，同樣排除了上述疾患，性別、年齡均基本匹配。被調查者采血前8～14 h禁食，晨間采取坐位肘部靜脈血5 ml，標本采取后存放至隨身攜帶的冷藏包內，后用當地疾控中心冷鏈車運送至同一實驗室進行測定，進行DNA提取及檢測。

基因型測定：本次實驗采用SNaPshot技術也稱微測序技術對β2-AR Argl6Gly（rs1042713）和Gln27Glu（rs1042714）多態位點進行了檢測。從GENBANK中獲取人類β2-AR編碼基因，并獲得位點信息。根據以上信息位點設計兩個引物，上游引物：5’-ATGAGGCTTCCAGGCGTC-3’，下游引物：5’-GATGAGAGACATGACGATGCC-3’（上海生物工程有限公司合成）。聚合酶鏈反應（PCR）體系20 μl，其中含有1.0 μl的基因組DNA、10×buffer 2.0 μl、50 mmol/L MgCI 20.8 μl、脫氧核苷三磷酸（dNTP） 0.5 μl、PCR引物1.0 μl、Platinum Taq聚合酶0.2 μl。PCR循環參數為：預變性95℃ 2 min后，繼之進行35個循環，每個循環95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后72℃ 持續5 min延伸。后取2.0 μl PCR擴增產物用ExoI酶和蝦堿性磷酸酶（SAP）純化，主要是用ExoI去除反應產物中的剩余引物，用SAP去除反應中剩余的dNTP。SNP分型利用1.0 μl上述純化延伸產物，與GenescanTM-120LIZ Size Standard 0.5 μl和去離子甲酰胺8.5 μl混合均勻后,95℃變性5 min，ABI3730測序儀進行分型。收集的原始數據用Gene Mapper4.0 （Applied Bio systems Co.Ltd.USA）分析。

統計學處理：采用SPSS18.0統計軟件進行分析。所有計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組均數間比較采用t檢驗，分類資料用構成比和率描述，用直接計數法分別計算對照組和原發性高血壓組基因型頻率,由基因型頻率計算等位基因頻率；各組基因型、等位基因分布頻率比較采用χ2檢驗，用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗樣本的群體代表性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

原發性高血壓組與對照組的基線資料比較（表1）： 原發性高血壓組體重指數、收縮壓、舒張壓均高于對照組（P均＜0.05）。

表1 原發性高血壓組與對照組基線資料比較（±s）

基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗（表2）: 本人群原發性高血壓組、對照組的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞O.05），遺傳學上該樣本可代表藏族人群。

表2 β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu多態性基因型頻率的比較（%）

PCR擴增結果及SNaPshot基因分型結果：圖1所示為β2-AR基因Argl6Gly、Gln27Glu PCR擴增結果，擴增片段的長度為230 bp。圖2所示為β2-AR基因Arg l6Gly、Gln27Glu SNaPshot基因分型結果，延伸產物堿基的對應顏色A：綠色，G：藍色，C：黑色，Argl6Gly（rs1042713）基因型分別為AA、AG、GG，Gln27Glu（rs1042714） 基因型分別為GG、GC、CC。

圖1 β2-AR基因Argl6Gly、Gln27Glu PCR擴增結果

圖2 β2-AR基因Argl6Gly、Gln27Glu SNaPshot基因分型結果

β2-AR基因多態性同藏族原發性高血壓的相關性分析：SNaPshot分析Arg16Gly原發性高血壓組332例、對照組257例成功，Gln27Glu原發性高血壓組336例、對照組260例成功。結果提示Arg16Gly和Gln27Glu的基因型頻率在藏族原發性高血壓組和對照組中的分布差異無統計學意義（P＞0.05），等位基因頻率分布差異亦無統計學意義（P＞0.05）（表3）。按性別進行分層分析發現，差異仍無統計學意義（P＞0.05）（表4）。

表3 兩組β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu基因型和等位基因頻率比較[例（%）]

表4 不同性別兩組β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu基因型和等位基因頻率比較[例（%）]

3 討論

1987年, Kobilka等[6]首先發現并發表了β2-AR基因全序列，該基因定位于染色體5q31-5q32區域,無內含子,編碼區包含1239個堿基對,編碼413個氨基酸。近年來，隨著心血管疾病研究的深入，β2-AR基因多態性位點陸續被發現, 迄今研究最多的為+46位核苷酸由腺嘌呤（A）轉化為鳥嘌呤（G），使其編碼的第16位的精氨酸（A）變為甘氨酸（T），即A46G突變；+79位核苷酸由鳥嘌呤（G）為胞嘧啶（C）所取代，使編碼第27位的谷氨酰胺（G）變為谷氨酸（M），即G79C突變。關于β2-AR基因16、27位點多態性與原發性高血壓的關系國外報道不一。Kotanko等[3]對加勒比海地區非洲人后裔的研究中認為β2-AR基因Glyl6等位基因可能為原發性高血壓的易感等位基因, Busjahn等[7]發現Argl6等位基因與原發性高血壓相關。但Candy等[8]以南非黑人為對象，未發現原發性高血壓與β2-AR基因Argl6Gly多態性有關。我國一項對北方漢族人群的研究中，Ge等[9]測定了503例2級高血壓患者及504名正常血壓者的β2-AR Arg16Gly基因型，結果顯示在此高血壓人群內Gly16存在頻率很高。吳弘等[10]分別報道了β2-AR與中國大別山、安徽地區漢族人群原發性高血壓的關系，其中Argl6Gly SNP在正常血壓和原發性高血壓人群中的分布有顯著性差異，提示其可能與原發性高血壓相關聯。Bray等[11]發現原發性高血壓組Glu27等位基因明顯高于對照組。而Yu等[12]和朱敏等[13]的研究未顯示Gln27/Glu多態性與原發性高血壓有相關性。本研究以甘肅甘南藏族自治州藏族人群為研究對象，結果顯示Argl6Gly、Gln27Glu基因型和等位基因在原發性高血壓組和對照組中的構成比較差異無統計學意義，提示兩位點多態性與藏民族原發性高血壓無相關性。進一步研究發現，藏族男女性人群Argl6Gly、Gln27Glu位點多態性與高血壓發病均無相關性。

β2-AR通過激活環磷酸腺苷（cAMP）依賴性的蛋白激酶A和其他信號傳導通路，調節許多生理性和代謝性的過程，包括心率、血壓、腎臟的水、鈉排泄和潴留等[11]。β2-AR多態性是血管應激反應的主要決定因素，但關于其多態性與高血壓相關性未得出統一結論，研究結果之間的分歧提示原發性高血壓在不同種族可能具有不同的發病機理。目前該基因位點在低海拔地區漢族人群中多有相關報道。流行病學研究表明原發性高血壓的患病率在我國各地區、民族之間差別很大，生活在北方或高原地區的藏族、蒙古族和朝鮮族等患病率較高，而生活在南方或非高原地區的壯族、苗族和彝族等患病率則較低[5]。本研究人群為居住在海拔高度3000米左右的甘肅省甘南藏族自治州，地理位置偏遠，人口遷徙較小，遺傳背景較單一，樣本同質性較好，分析效能可信度高，可為研究這些人群原發性高血壓發病方面提供理論依據。

SNaPshot技術也稱微測序技術，可同時進行多達幾十個SNPs的檢測，準確性高，檢測速度快，成本低廉，目前，已經廣泛地用于人類疾病相關性分析。本研究通過此技術初步分析了甘肅高海拔地區藏族β2-AR基因Argl6 Gly、Gln27Glu位點多態性與原發性高血壓的相關性。研究結果提示：此基因上述兩位點多態性可能不是此地區藏族原發性高血壓的遺傳標志。當然原發性高血壓的遺傳規律復雜，受多種因素影響，研究結果差異分析原因可能不僅是由于種族、地域等環境因素的不同，而且位點之間存在連鎖不平衡，病例對照的嚴格選擇以及樣本量的大小也會影響統計結果的準確性。本研究人群具有自己獨特的宗教風俗和民族習慣等，在收集資料及采集血樣時部分人群不能良好配合，農牧地區尤其明顯，因此樣本量相對偏少。今后研究中如能擴大樣本量，通過大規模、高質量、多位點、多基因間的聯合研究，相信結果會更有說服力。

參考文獻

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（編輯：漆利萍）

Relationship Between β2-Adrenergic Receptor Gln27Glu Gene Polymorphism and Essential Hypertension Occurrence in Tibetan Population Living at High Altitude Area

LI Xing-hui, QIAO Yan, MA Yu-an, QI Wen-hua, LI Cai-xia, LI Bao-juan.
Department of Cardiology, Gansu Provincial Hospital, Lanzhou (730000), Gansu, China
Corresponding Author: QIAO Yan, Email: 13669336252@163.com

Abstract

作者單位：730000 甘肅省蘭州市，甘肅省人民醫院 心內科

作者簡介：李星輝 副主任醫師 博士 主要從事心血管內科基礎與臨床研究 Email：xinghui415@163.com 通訊作者：喬燕Email：13669336252@163.com

中圖分類號：R54

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）04-0372-04

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.04.014

(收稿日期：2015-09-18)