普羅布考對動脈粥樣硬化兔的高密度脂蛋白逆轉運功能中酶蛋白和受體的影響

鐘建開,吳焱賢,陳盈文,李琛,黎文生,郭志剛

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基礎與實驗研究

普羅布考對動脈粥樣硬化兔的高密度脂蛋白逆轉運功能中酶蛋白和受體的影響

鐘建開,吳焱賢,陳盈文,李琛,黎文生,郭志剛

摘要

目的：探討普羅布考對動脈粥樣硬化（AS）兔的高密度脂蛋白逆轉運功能中酶蛋白和受體的影響。

方法：新西蘭大白兔（共24只） 隨機分為3組：對照組（n=8）：用普通飼料飼養；高脂組（n=8）：用高脂飼料喂養；普羅布考組（n=8）：在高脂飼料的基礎上給予普羅布考喂養。飼養12周通過比色法測定血脂，通過酶聯免疫吸附法檢測血清磷脂膽固醇酰基轉移酶（LCAT）和膽固醇酯轉移蛋白（CETP），并采用免疫組化方法檢測主動脈壁斑塊內三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ABCA1）和清道夫受體-BI （SR-BI）表達水平。

結果：實驗后第12周（1）血脂指標：與高脂組比較，普羅布考組血清總膽固醇[TC,（15.95±1.51 ）mmol/L vs （21.95±3.71）mmol/L]、低密度脂蛋白膽固醇[LDL-C, （13.01±2.28） mmol/L vs （17.90±3.51）mmol/L]、高密度脂蛋白膽固醇[HDL-C, （0.56±0.10） mmol/L vs（1.13±0.12 ）mmol/L]水平明顯下降, 差異均有統計學意義（P＜0.01）。（2）LCAT和CETP：與對照組［CETP（2.07±0.64）μg/ml和LCAT（27.01±8.26）μg/ml]比較， 高脂組[CETP（1.24±0.54）μg/ml和LCAT（15.02±3.81）μg/ml］明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與高脂組比較，普羅布考組［CETP （3.43±1.01） μg/ml和LCAT（38.10±7.96） μg/ml］明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（3）主動脈壁斑塊ABCA1和SR-BI受體表達：與高脂組比較，普羅布考組ABCA1陽性表達的面積（%）顯著增加[（46.81±10.01）% vs （24.10±8.48）%，P＜0.01]；SR-B1陽性表達面積（%）亦顯著增加[（48.04±10.90）% vs （18.61±6.77）%，P＜0.01]，兩組比較差異均有統計學意義。

結論：普羅布考通過增加高密度脂蛋白外周動脈受體ABCA1和SR-BI表達，增加LCAT和CETP的量，促進HDL的RCT功能，從而改善HDL的功能。

關鍵詞 動脈粥樣硬化；普羅布考；脂蛋白類，HDL

Objective: To explore the effect of probucol on enzyme and receptors of high density lipoprotein (HDL) during reverse cholesterol transportation in experimental rabbits with atherosclerosis.

Methods: A total of 24 New Zealand rabbits were randomly divided into 3 groups: Control group, the rabbits were fed by normal diet, High cholesterol group, the rabbits were fed by high cholesterol diet and Probucol group, the rabbits were fed by high cholesterol diet with probucol. n=8 in each group, all animals were treated for 12 weeks. Blood levels of lipids were examined by colorimetric method, serum lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) and cholesterol ester transfer protein (CETP) were detected by ELISA, expressions of ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1) and scavenger receptor class Btype I (SR-BI) in aortic plaque were measured by immunohistochemistry; the above indexes were compared among different groups.

Results:① for blood lipids by mmol/L, the following indexes in Probucol group were lower than High cholesterol group: TC (15.95±1.51 vs 21.95±3.71), LDL-C (13.01±2.28 vs 17.90±3.51), HDL-C (0.56±0.10 vs 1.13±0.12), all P＜0.01. ② the following perimeters in High cholesterol group were lower than Control group: for CETP by μg/ml (1.24±0.54 vs 2.07±0.64), for LCAT by μg/ml (15.02±3.81 vs 27.01±8.26), all P＜0.05; compared with High cholesterol group, Probucol group had increased CETP (3.43±1.01) and LCAT (38.10±7.96), all P＜0.05. ③ positive expressions of ABCA1 and SR-BI in aortic plaque in Probucol group were higher than High cholesterol group: for ABCA1 by % (46.81±10.01 vs 24.10±8.48), for SR-BI by % (48.04±10.90 vs 18.61±6.77), all P＜0.01.

Conclusion: Probucol may increase blood levels of LCAT, CETP via up-regulating the expressions of ABCA1, SR-B1 and elevating the reverse cholesterol transportation of HDL, therefore improve HDL function in experimental rabbits with atherosclerosis.

Key words Atherosclerosis; Probucol; Lipoproteins; Lipoproteins, High density lipoprotein

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:393.)

高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）濃度與心腦血管病的發病危險呈獨立的負相關，血清HDL-C水平每升高1 mg/dl，男性患者冠心病的危險性即降低2%，女性降低3%[1]。與低密度脂蛋白（LDL）增加心血管病風險不同，高密度脂蛋白（HDL）具有心血管保護作用；然而，HDL與動脈粥樣硬化（AS）的關系較為復雜，在載脂蛋白A-1（ApoA-1）Milano突變體人群中，其HDL-C的水平較一般人群低，但其冠心病的發生率也明顯降低[2]。因此，國內外學者認為血清HDL-C水平并不能反映HDL的整體功能，HDL可以通過多種機制發揮抗AS的功效，包括膽固醇逆轉運（RCT）、抗氧化、抗炎、改善內皮細胞功能失調、抗血栓及促纖溶等。普羅布考是一種具有強抗氧化作用的降脂藥，能明顯降低總膽固醇，但是普羅布考降低總膽固醇的同時，也顯著降低了HDL-C的水平。為什么普羅布考降低HDL-C水平后仍能發揮強大的抗動脈硬化效應？這可能和普羅布考改善HDL的RCT功能密切相關，但是普羅布考通過何種機制提高HDL的RCT功能？國內外鮮有報道。本研究通過高脂飲食建立AS兔模型，由此研究普羅布考對卵磷脂膽固醇酰基轉移酶（LCAT）和膽固醇酯轉移蛋白（CETP）量的影響，對主動脈壁HDL受體三磷酸腺苷結合盒轉運體A1 （ABCA1）和清道夫受體-BI （SR-BI）的表達的影響，以探討普羅布考改善HDL功能的機制。

1 材料與方法

實驗動物及分組：選取2011-04到2013-10健康雄性新西蘭白兔24只，南方醫院實驗動物中心提供飼養和觀察場地（飼養環境溫度約25℃，濕度7%，自動通風器保持室內通風）；單籠飼養，每日總食量約120 g，飲水不限，共飼養12周。隨機分為：（1）對照組8只：飼以普通飼料；（2）高脂組8只：飼以高脂飼料；高脂飼料配方：1%膽固醇、8%豬油、0.05%膽鹽、其余為正常粗顆粒飼料。（3）普羅布考組8只：飼以高脂飼料的基礎上給予普羅布考400 mg/ （kg·d）。12周后通過檢測3組兔的血脂濃度，肉眼觀察和測定3組兔主動脈內中膜厚度及斑塊面積的組織病理學特點，判斷普羅布考組和高脂組兔動脈粥樣硬化模型構建成功[3]。

血脂測定：新西蘭白兔空腹取血5 ml，部分血液立即在奧林巴斯AU5421型全自動生化分析儀上測定血清總膽固醇（TC）、LDL-C、HDL-C、甘油三酯（TG）[4]。部分血液靜置30 min后離心取血清，并置于-70℃冰箱保存備用。

CETP和LCAT的測定：采用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定LCAT和CETP濃度。按 ELISA 試劑盒說明書描述的操作步驟進行：分別向兔CETP和LCAT單克隆抗體的酶標空中加入血清溫育：溫育后，分別加入生物素標記的抗CETP和LCAT抗體，再與鏈霉親和素-HRP結合，形成免疫復合物，再經過溫育和洗滌后加入底物A、B產生藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深與CETP和LCAT的濃度呈正相關。最后根據標準品的濃度以及對應的光密度（OD）值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

免疫組化方法：（1）常規脫水，包埋，切片，脫蠟后蒸餾水充分沖洗；（2）滴加10%雙氧水以滅活內源性酶；（3）滴加復合消化液及抗原修復液；（4）滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液；（5）滴加稀釋一抗（根據說明書，ABCA1 1:100，SR-BI 1:1000），在4℃過夜；（6）滴加二抗，20℃～37℃ 20 min；（7）滴加試劑鏈霉親和素-生物素復合物（SABC）；（8）ABCA1采用二氨基聯苯氨（DAB）顯色；SR-BI采用3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）染色：室溫顯色，鏡下控制反應時間；（9）mayor蘇木素輕度復染。

圖片分析：在電子顯微鏡下觀察標本，用奧林巴斯病理圖像分析采集系統采集各個切片標本，然后采用Image-plus 6.0專業圖像分析軟件分析已采集圖像，包括：（1）測量斑塊表面積和血管表面積，并計算動脈斑塊/血管面積比；（2）測量及分析主動脈壁上ABCA1和SR-B1陽性表達面積百分比。

主要試劑及儀器 ：普羅布考（河北頸復康藥業集團有限公司）；Ⅰ抗： A1ABC A1 抗體（中國武漢博士德生物工程有限公司），SR-BI抗體（美國Abcam公司）；Ⅱ抗：羊抗小鼠試劑盒（中國武漢博士德生物工程有限公司）；DAB顯色劑，AEC染色劑（中國武漢博士德生物工程有限公司）。LCAT和CETP ELISA試劑盒（中國南京建成生物工程研究所）。日本奧林巴斯公司產AU-5421型生化自動分析儀，ND-1000 Spectrophotometer型分光光度儀（美國NanoDrop有限公司），Hettich公司的低溫冷凍高速離心機，奧林巴斯BX51型電子顯微鏡及圖像采集系統。

統計學方法：應用SPSS 13.0統計軟件分析，計量資料以±s表示，進行方差齊性檢驗，單因素方差分析，獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組兔實驗前后血脂水平的變化（表1）：實驗前各組兔TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較，差異均無統計學意義（P均＞0.05），實驗基線統一。實驗后第12周，與對照組比較，高脂組TC、TG、 LDL-C、HDL-C水平均升高，差異均有統計學意義（P均＜0.01）。與高脂組比較，普羅布考組兔TC、LDL-C和 HDL-C水平明顯降低，差異均有統計學意義（P均＜0.01）。

表1 各組兔實驗前后血脂水平的變化 (mmol/L，±s）

表1 各組兔實驗前后血脂水平的變化 (mmol/L，±s）

注：與同時間段對照組比較*P＜0. 01；與同時間段高脂組比較ΔP＜0. 01

項目　實驗前　實驗后第12周對照組 (n=8)高脂組 (n=8)普羅布考組 (n=8)對照組 (n=8)高脂組 (n=8)普羅布考組 (n=8)總膽固醇　1.86±0.17　 1.82±0.17　 1.85±0.19　 2.08±0.58　 21.95±3.71*15.95±1.51Δ甘油三酯　1.06±0.18　 1.14±0.20　 1.08±0.19　 0.91±0.36　 1.66±0.26*　1.48±0.25低密度脂蛋白膽固醇　1.04±0.19　 1.04±0.21　 1.05±0.16　 1.51±0.81 17. 90±3.51*　13.01±2.28Δ高密度脂蛋白膽固醇　0.51±0.13　 0.51±0.12　 0.46±0.10　 0.48±0.12　 1.13±0.12*　0.56±0.10Δ

各組兔實驗后第12周CETP和LCAT濃度變化比較（圖1、2）： 實驗后第12周，與對照組[CETP （2.07±0.64）μg/ml和LCAT（27.01±8.26）μg/ml]比較， 高脂組CETP［（1.24±0.54 ）μg/ml和LCAT （15.02±3.81）μg/ml］明顯降低，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。與高脂組比較，普羅布考組[CETP （3.43±1.01） μg/ml和LCAT（38.10±7.96） μg/ml]明顯升高，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

兔主動脈ABCA1及SR-BI表達及染色陽性表達面積百分比（圖3、4和表2）：實驗后第12周（采用Image-plus 6.0專業圖像分析軟件分析和計算免疫組化染色結果）對照組主動脈內因未產生斑塊，故無斑塊內細胞ABCA1和SR-BI表達；斑塊內ABCA1表達為深棕黃色，板塊內SR-BI表達為鮮紅色。斑塊內棕黃色和紅色的顏色越深、面積越大，代表ABCA1和SR-BI表達越強烈。與高脂組比較，普羅布考組ABCA1陽性表達的面積（%）顯著增加（P＜0.01）；SR-B1陽性表達面積（%）亦顯著增加（P＜0.01），差異均有統計學意義。

圖1 實驗后第12周各組兔膽固醇酯轉移蛋白濃度（n=8）

圖2 實驗后第12周各組兔卵磷脂膽固醇酰基轉移酶濃度（n=8）

圖3 三磷酸腺苷結合盒轉運體A1染色結果：棕黃色為三磷酸腺苷結合盒轉運體A1的陽性表達（DAB顯色；×100）

圖4 清道夫受體-BI染色結果：紅色為清道夫受體-BI陽性表達（AEC顯色；×100）

表2 兩組兔主動脈三磷酸腺苷結合盒轉運體A1及清道夫受體-BI陽性表達面積（%，±s）

表2 兩組兔主動脈三磷酸腺苷結合盒轉運體A1及清道夫受體-BI陽性表達面積（%，±s）

清道夫受體-BI陽性表達面積高脂組 (n=8)　24.10±8.48　18.61±6.77普羅布考組 (n=8)　 46.81±10.01　 48.04±10.90 t值　3.789　4.899 P值　0.008　0.002組別　　三磷酸腺苷結合盒轉運體A1陽性表達面積

3 討論

HDL通過多種機制共同發揮抗AS功能：包括RCT、抗炎、抗氧化、改善內皮細胞功能失調、抗血栓及促纖溶等。而RCT功能是HDL最重要的功能，其負責把血管內膜下細胞內多余的膽固醇通過HDL在經過血液循環途徑轉移到肝臟，肝臟將膽固醇以膽汁形式分泌進入消化道，多余的膽固醇最后通過糞便排出體外[5]。HDL的RCT過程是一個動態的復雜過程，眾多的脂蛋白和酶參與該過程， 首先ApoA-1通過ABCA1受體迅速與機體膽固醇結合并發生酯化作用形成Preβ-HDL，Preβ-HDL在LCAT催化下與游離膽固醇結合形成HDL3， HDL3 在LCAT催化下不斷結合游離膽固醇并逐漸形成成熟的HDL2； HDL2經肝細胞SR-BI受體汲取后，將HDL中的膽固醇通過膽汁排泄入消化道。而CETP可將HDL上的酯化膽固醇轉移給極低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂質（LDL）顆粒，后兩者再經肝臟LDL受體攝取，將多余的膽固醇排泄至體外[6]。由此可見，在復雜的RCT過程中，ABCA1、SR-BI受體，LCAT、CETP均起到了極其關鍵的作用，影響整個RCT過程。

在丹吉爾病患者與ABCA1受體缺失小鼠的成纖維細胞中，ABCA1受體介導膽固醇外流并與脂蛋白結合的能力嚴重下降，而這些膽固醇聚集和沉淀機體組織中；在ABCA1過度表達的小鼠中，其降低高脂飲食的小鼠的AS發生率[7]。由此可見，ABCA1在RCT過程中起到了重要的作用，外周動脈壁ABCA1受體的表達降低，將減少外周動脈壁斑塊細胞膽固醇的外流，從而導致細胞內膽固醇的集聚，促進AS發生。本研究證實：普羅布考上調主動脈壁斑塊內細胞的ABCA1表達，可以加速斑塊細胞內膽固醇從外周流出，減少膽固醇在血管內皮下集聚，從而發揮了抗AS作用。

SR-BI是RCT功能另外一個重要的受體。研究發現，在SR-BI缺失小鼠中，血清膽固醇升高2倍，形成大量異常大顆粒的HDL，HDL的清除率也明顯下降[8]，表明通過SR-BI介導的轉運HDL的脂質外流是保護HDL結構和功能必不可少的條件。主動脈壁斑塊細胞內SR-BI的表達升高，將增加巨噬細胞內膽固醇的外流，減少細胞內膽固醇的集聚[9]。本研究證實：普羅布考也可以通過提高主動脈壁斑塊內細胞SR-BI的表達，促進斑塊內游離膽固醇的流出，起到抗AS作用。

LCAT是HDL代謝中的關鍵酶，維持膽固醇的穩態平衡，同時LCAT在HDL的成熟和代謝中起關鍵作用，是血漿HDL水平的主要決定因素之一。在LCAT基因過量表達的動物， HDL濃度明顯升高，HDL成熟能力增強，能從外周汲取并轉運更多的膽固醇至肝臟排泄，降低了動物AS的易感性，具有抗AS的作用[10]，在LCAT基因敲除動物實驗發現，其HDL顆粒濃度也大大降低，HDL汲取膽固醇外周膽固醇的能力明顯下降，AS易感性明顯升高[11]。因此，我們認為，LCAT可以反映HDL在RCT中的成熟能力，其能促進HDL成熟，并在成熟過程中不斷汲取外周膽固醇，增加RCT能力。本研究發現：高脂組兔LCAT顯著降低，而普羅布考組LCAT明顯升高，因此普羅布考通過增加LCAT提高HDL的RCT功能。但本研究中，普羅布考組HDL-C水平降低，可能與普羅布考促進肝臟SR-BI表達更強，加速HDL-C與肝細胞結合，使HDL-C內的膽固醇通過膽汁排泄出機體，減少血液中HDL-C量，但該觀點有待進一步的研究加以證明。

CETP 也是HDL代謝的重要轉運蛋白之一，CETP與AS 的關系比較復雜，目前存在比較多爭議，CETP 轉運介導HDL內膽固醇轉運至LDL、VLDL并交換 TG，富含 TG 的 HDL2被肝汲取后在水解，并通過膽汁排泄膽固醇，CETP升高有抗 AS 的作用[12，13]。本研究發現：高脂組兔的血清CETP比對照組明顯降低，該結果可導致HDL的RCT的效率降低，加速AS的進展，而普羅布考可以顯著提高CETP濃度，加速HDL的RCT效率，達到抗AS的作用。

普羅布考通過上調AS兔主動脈斑塊內細胞ABCA1、SR-BI的表達，同時通過提高CETP和 LCAT濃度，達到提高HDL的RCT效率。由此可見，普羅布考通過上調HDL的RCT外周動脈受體表達和增加RCT酶濃度達到改善HDL功能，發揮抗AS作用。

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（編輯：梅平）

Effect of Probucol on Enzyme and Receptors of High Density Lipoprotein During Reverse Cholesterol Transportation in Experimental Rabbits With Atherosclerosis

ZHONG Jian-kai, WU Yan-xian, CHEN Ying-wen, LI Chen, LI Wen-sheng, GUO Zhi-gang.
Department of Cardiology, The First People's Hospital of Shunde, Foshan (528300), Guangdong, China
Corresponding Author: GUO Zhi-gang, Email: guodoctor126@126.com

Abstract

基金項目：廣東省醫學科學技術研究基金（B2014388）

作者單位：528300 廣東省，佛山市順德第一人民醫院 心內科（鐘建開、吳焱賢、陳盈文、黎文生）；南方醫 科大學附屬南方醫院 心內科（李琛、郭志剛）

作者簡介：鐘建開 主治醫師 碩士研究生 主要從事血脂和冠心病研究 Email：doctor-zh@qq.com 通訊作者：郭志剛 Email：guodoctor126@126.com

中圖分類號：R541

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）04-0393-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.04.019

收稿日期:（ 2015-06-19）