刺芹側耳降解孔雀石綠的酶學研究

呂國英　張作法　程鴦祺（. 浙江省農業科學院園藝研究所，浙江 杭州 300；. 浙江工業大學藥學院，浙江 杭州 3004）

?

刺芹側耳降解孔雀石綠的酶學研究

呂國英1張作法1程鴦祺2
（1. 浙江省農業科學院園藝研究所，浙江 杭州 310021；2. 浙江工業大學藥學院，浙江 杭州 310014）

關鍵詞刺芹側耳；降解；酶；孔雀石綠

白腐真菌是目前研究最多、染料脫色過程中最有效的真菌資源。許多研究表明，真菌降解染料主要是由于其具有非特異性和非選擇性的胞外酶系。白腐真菌產生的木質素降解酶系，主要由漆酶、錳過氧化物酶、木素過氧化物組成［1，2］，為非底物專一性酶，分泌到細胞外對多種有機物和染料具有廣譜的氧化降解作用。

孔雀石綠（Malachite green，MG）及其代謝物無色孔雀石綠結構穩定，不易分解，故在環境和生物體中代謝緩慢，容易積累，已被科學界確認具有高毒、高殘留、“三致”等毒副作用［3］。目前分離到的對孔雀石綠具有脫色作用的微生物有細菌、酵母、絲狀真菌、微藻等［4～7］。利用大型真菌搖瓶發酵液來降解孔雀石綠的研究少見報道，本實驗室在前期研究的基礎上篩選到一株刺芹側耳M1，其對MG具有良好的降解效果。本研究考察了刺芹側耳M1降解孔雀石綠的一些相關酶的酶活變化情況，為闡明脫色機理提供了理論基礎。

1　材料與方法

1.1實驗材料

供試菌種刺芹側耳 M1（Pleurotus eryngii M1，本實驗室前期篩選得到）4 ℃保存于 PDA斜面培養基；孔雀石綠（MG）購自國藥集團化學試劑有限公司；其他生化試劑均為國產分析純。

1.2培養基

PDA斜面培養基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L。PDA液體培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L。

1.3搖瓶發酵培養

從活化的斜面培養基上取一定量的菌絲塊接種到100 mL PDA 液體培養基中，置于250 mL三角瓶，150 r/min，25 ℃下振蕩培養5天。

1.4酶液提取

胞外酶提取：培養后的菌液于10 000 rpm下離心10 min，取上清即為胞外酶液。

胞內酶提取：培養后的菌液于10 000 rpm下離心10 min，沉淀用0.9%NaCl溶液細胞洗滌3次，懸浮于磷酸緩沖液（100 mM，pH 7.4）中，超聲波處理5 min，懸浮液離心（10 000 rpm，4℃，15 min），棄沉淀，上清液即為胞內酶液。

1.5酶活測定

酪氨酸酶、漆酶、錳過氧化酶、木質素過氧化酶和NADH-DCIP還原酶測定方法見文獻［8］，作少許改動。蛋白測定采用考馬斯亮藍法。

1個酶活力單位是指在特定條件（25 ℃，其他為最適條件）下，在1 min內轉化1 μmol底物的酶量，或是轉化底物中1 μmol的有關基團的酶量。

比活為每分鐘每毫克酶蛋白在 25 ℃下轉化的底物的微摩爾數。

1.6脫色率的測定

Ao，At分別表示初始時刻和t時刻染料在619 nm波長處的吸光值。

1.7酶的初步分離純化

分別對胞內酶液和胞外酶液進行蛋白質分級純化。以100 mL酶液為例，硫酸銨在25 ℃時的溶解度為75 g，邊攪拌邊緩慢加入無水硫酸銨，分別在酶液中的硫酸銨達到溶解度的20%、40%、60%、80%、100%時提取沉淀，即0～20%、20%～40%、40%～60%、60%～80%、80%～100%區間內的蛋白質。蛋白質溶于pH=7.0的磷酸緩沖液中，制成酶液，再測蛋白濃度、降解率等參數。

2　結果與分析

2.1酶活比較

測定酶活的酶液分為脫色前和脫色后兩種，數據顯示，胞內酶液中的各酶活在加入MG后都略有降低，而在胞外酶液中，這一現象并不明顯，其中酪氨酸酶和木質素氧化酶有降低的趨勢，而漆酶和NADH-DCIP還原酶反而有所升高。文獻報道［8］，MG在脫色前后反應體系中起作用的酶的酶活將發生新變化，雖然本研究中的這幾種酶的酶活都有變化，但是除了漆酶外，其他酶活變化都很小（表1），基本可以忽略。已有文獻報道，一種白腐菌 Trametes sp.中的漆酶可以脫色 MG溶液［9］，所以我們推測在本研究的降解MG過程中漆酶起主要作用。

表1　脫色前后胞內外酶活的變化

2.2酶的初步分離

胞內酶液的分離純化結果顯示，硫酸銨溶解度的20%～40%區間內分離到的蛋白質最多，其次是 40%～60%區間。在0～20%區間內的蛋白質較少。蛋白質在分離純化過程中會有損失，蛋白質的最后回收率為71.8%（表2）。

表2　胞內酶液分級沉淀結果

胞外酶液的分離純化結果為：硫酸銨溶解度在80%～100%區間內分離到的蛋白質最多，其次是60%～80%區間，0～20%區間內沒有分離到蛋白質。胞外酶液中，蛋白質損失較大，回收率只有38.8%（表3）。

表3　胞外酶液分級沉淀結果

用原酶液和各區間分離到的酶液去降解孔雀石綠染料，在MG濃度相等的情況下，得出每毫克蛋白能達到的降解率，定義為單位降解率。結果如圖1所示，胞內酶液的0～20%組分的蛋白質濃度雖然很低，但是其活性很高，每毫克蛋白分擔到的降解率是最高的。胞外酶液的20%～40%區間組分的單位降解率原高于其他組分，而0～20%區間組分檢測不到蛋白質存在。

圖1　各組分酶液MG降解率

3　討 論

孔雀石綠是一種帶有金屬光澤的綠色結晶體，屬三苯甲烷類染料，過去常被作為驅蟲劑、殺菌劑、防腐劑在水產中使用。由于其毒副作用大，雖然早已禁用，但研究廢水中所含孔雀石綠染料的脫色降解，對于治理染料的污染仍具有重要的理論意義和實用價值。

通過測定胞內外酶液中相關酶活，可以看出漆酶活性比其他酶要高，漆酶比活是其他酶活的好幾十倍。相對于胞內酶液，胞外酶液中的漆酶比活雖有所降低，但仍高于其他酶。胞外液中的酪氨酸酶、木質素氧化酶和NADH-DCIP還原酶的比活都略高于胞內，錳過氧化酶胞內胞外比活都很低。可以推測在脫色過程中起主要作用的是漆酶。對胞內外酶液的硫酸銨沉淀進行初步分離后，進行脫色測定，發現在胞內酶液中活性主要集中在硫酸銨 0～20%組分中，雖然此組分的蛋白含量最少；而在胞外酶液中除了硫酸銨 0～20%區間組分檢測活性外，其他組分均有較高的活性，其中在20%～40%的組分中活性為最大，這也間接證明了胞外酶活性高于胞內酶活性。

參考文獻

［1］ Du， L.N.， Wang， S.， Li， G.， et al. Biodegradation of malachite green by Pseudomonas sp. strain DY1 under aerobic condition: characteristics， degradation products，enzyme analysis and phytotoxicity ［J］. Ecotoxicology，2011， 20: 438-446.

［2］ Kagalkar， A.N.， Jadhav， M.U.， Bapat， V.A.， et al. Phytodegradation of the triphenylmethane dye Malachite Green mediated by cell suspension cultures of Blumea malcolmii Hook ［J］. Bioresour Technol， 2011， 102: 10312-10318.

［3］ Srivastava， S.， Sinha， R.， Roy， D. Toxicological effects of malachite green ［J］. Aquat Toxicol， 2004， 66: 319-329.

［4］ Yang， Y.， Wang， G.，Wang， B.， et al. Decolorization of malachite green by a newly isolated Penicillium sp. YW 01 and optimization of decolorization parameters ［J］. Environ Eng. Sci， 2011， 28: 555-562.

［5］ Daneshvar， N.， Ayazloo， M.， Khataee， A.R， et al. Biological decolorization of dye solution containing Malachite Green by microalgae Cosmarium sp. ［J］. Bioresour Technol， 2007，98: 1176-1182.

［6］ Jadhav， J.P.， Govindwar， S.P. Biotransformation of malachite green by Saccharomyces cerevisiae MTCC 463 ［J］. Yeast， 2006， 23: 315-323.

［7］ Jasińska， A.， Ró?alska， S.， Bernat， P.， et al. Malachite green decolorization by non-basidiomycete filamentous fungi of Penicillium pinophilum and Myrothecium roridum ［J］. Int. Biodeter Biodegr， 2012， 73: 33-40.

［8］ Du， L.N.， Zhao， M.， Li， G.， et al. Biodegradation of malachite green by Micrococcus sp. strain BD15: Biodegradation pathway and enzyme analysis ［J］. Int. Biodeter Biodegr， 2013， 78: 108-116.

［9］ Manel， M.K.， Hela Z.M.， Lassaad B.， et al. Malachite green decolourization and detoxification by the laccase from a newly isolated strain of Trametes sp. ［J］. Int. Biodeter Biodeg， 2009， 63: 600-606.

中圖分類號：S646

文獻標識碼：A

文章編號：2095-0934（2016）01-048-03

基金項目：浙江省農科院2014年創新提升工程項目；浙江省食用菌育種專項（2012C12911）

作者簡介：呂國英，博士，副研究員，主要從事食藥用菌研究工作。E-mail：bdzlgy@sohu.com