1-硝基芘和苯并［a］芘對人肺上皮A549細胞的聯合細胞毒性

尚　羽，周　倩，蔣玉婷

（上海大學環境與化學工程學院環境污染與健康研究所，上海200444）

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1-硝基芘和苯并［a］芘對人肺上皮A549細胞的聯合細胞毒性

尚羽，周倩，蔣玉婷

（上海大學環境與化學工程學院環境污染與健康研究所，上海200444）

摘要：1-硝基芘（1-nitropyrene，1-NP）是柴油車尾氣中檢測濃度最高的硝基多環芳烴.以1-NP為主體，人肺上皮A549細胞為研究對象，探討了1-NP和苯并［a］芘（benzo（a）pyrene，B［a］p）的聯合細胞毒性及其對DNA的損傷.聯合染毒實驗結果表明：當B［a］p和1-NP同時作用于A549細胞時，B［a］p能明顯減弱由1-NP造成的細胞增殖抑制和細胞內活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平升高，但對DNA的損傷與1-NP單獨染毒組相近；利用B［a］p預染毒A549細胞24 h，能明顯減弱由1-NP造成的細胞增殖抑制和ROS水平升高，但對DNA的損傷加劇.以上結果說明，1-NP和B［a］p聯合作用可能是通過抑制ROS的生成來降低對細胞增殖的抑制，但所造成的對DNA損傷的加劇可能是通過其他的作用途徑.

關鍵詞：1-硝基芘；苯并［a］芘；大氣顆粒物；DNA損傷；活性氧簇

近年來，大氣顆粒物（particulate matter，PM）污染已經成為影響人類健康的重要環境因素［1-3］.PM的來源復雜，包括工業排放、燃煤發電、機動車尾氣、秸稈焚燒、道路和建筑工地揚塵等［4］.有機物是PM的重要化學組分，而最受關注的，且會對健康產生影響的是多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）及其衍生物（如硝基多環芳烴、醌類有機物等）.硝基多環芳烴（nitro-PAHs）廣泛存在于大氣、機動車尾氣等環境介質中，可直接來源于化石燃料的不完全燃燒，也可由前體物經大氣光化學反應的二次轉化產生.Bonnefoy等［5］的研究發現，nitro-PAHs的致突變和致癌潛力可達其母體PAHs的10～100000倍.吸附于顆粒物表面的nitro-PAHs能隨呼吸進入人體，并可能通過直接突變引起肺癌.

大氣環境中的nitro-PAHs種類較多，其中1-硝基芘（1-nitropyrene，1-NP）是柴油車尾氣中檢測濃度最高的nitro-PAHs［6］，對柴油車尾氣顆粒的致突變性有重要影響［7］.已有研究發現，1-NP可以促進人肺上皮A549細胞產生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），導致DNA損傷和細胞死亡［8］，并誘導細胞因子分泌［9］.苯并［a］芘（benzo（a）pyrene，B［a］p）是污染范圍最廣、致癌性最強的一種多環芳烴，是環境中多環芳烴類化合物的典型代表.因此，本工作以1-NP為主體，人肺上皮A549細胞為研究對象，探討了1-NP和B［a］p的聯合細胞毒性及其對DNA的損傷，并利用熒光探針的方法測定了細胞內產生的ROS水平.

1　材料與儀器

1.1主要材料和試劑

胎牛血清（奧地利PAA Laboratories GmbH公司），HAM’S/F-12培養基（賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司），四甲基偶氮唑鹽（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT，美國Life Science公司），瓊脂糖、1-NP（＞99%）和B［a］p（＞95%）（美國Sigma-Aldrich公司），96孔、24孔及6孔培養板、35 mm培養皿以及75 cm2培養瓶（美國Corning公司），其他試劑（分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司）.

1.2儀器

CO2恒溫細胞培養箱（德國LINGDE公司），iMark-680型酶聯免疫檢測儀（美國BIO-RAD公司），正置熒光顯微鏡（BX51型，日本Olympus公司）.

2　實驗方法

2.1細胞培養和染毒

（1）細胞培養.

人肺上皮A549細胞購自中國科學院細胞庫.使用HAM’S/F-12培養基，于5%CO2，37?C恒溫恒濕條件下對細胞進行培養.當細胞生長2～3 d，單層細胞達到80%以上時，按1∶3的比例進行傳代培養.

（2）染毒.

取對數生長期的細胞，按每孔3×103個細胞接種于96孔培養板，供MTT實驗使用；按每孔5×104個細胞接種于6孔培養板或35 mm培養皿，供彗星實驗、ROS測定使用.接種后于5%CO2，37?C恒溫恒濕條件下對細胞進行培養，令其貼壁生長.待細胞貼壁后，棄培養基，使用D-Hanks清洗兩次，進行染毒.

1-NP單獨染毒的條件如下：使用不同濃度（1，2，3，4，5μmol/L）的1-NP染毒24 h.

1-NP和B［a］p聯合染毒的條件如下：①預染毒，使用B［a］p（5μmol/L）預染毒24 h后，棄上清液，使用D-Hanks清洗兩次，再使用不同濃度1-NP繼續染毒24 h；②混合染毒，待細胞貼壁（8～24 h）后，加入含有B［a］p，1-NP的2%胎牛血清培養液，在37?C培養箱中培養24 h，之后棄去培養基，用D-Hanks清洗3次，并在37?C，5%CO2培養箱中培養24 h后進行檢測.設置3～6個平行樣.

使用二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）將1-NP和B［a］p配置成100 mmol/L的儲備液，每次染毒時重新稀釋至所需濃度.染毒時使用含2%胎牛血清的培養液稀釋至所需濃度，并保持DMSO的濃度為0.1%（v/v）.實驗設置溶劑對照組（DMSO，0.1%）和空白對照組（HAM’S/F-12培養基，不含細胞）.

2.2MTT實驗

染毒結束后，每孔加入5 mg/mL MTT試劑10μL，混勻后，繼續培養4 h；之后棄去培養液，加入DMSO溶液100μL，震蕩10 min.用酶聯免疫檢測儀測定光密度D，波長為490 nm.細胞存活率的計算公式如下：

式中，S為細胞存活率，DE，DB，DC分別為實驗組、空白對照組和溶劑對照組的光密度.

2.3彗星實驗

彗星實驗（comet assay），又稱單細胞凝膠電泳（single cell gel electrophoresis，SCGE）分析，是一種快速檢測單個細胞內DNA損傷的技術.在電泳過程中，DNA未受損的細胞其核DNA停留在核基質中，染色后呈現圓形的熒光團，無拖尾；DNA受損的細胞其DNA斷鏈或碎片將向陽極遷移，形成拖尾.細胞核DNA損傷越重，表現為拖尾長度的增加和尾部熒光強度的增強.因此，通過測定DNA遷移部分的光密度或遷移長度就可定量測定單個細胞DNA的損傷程度.本研究采用了Tice等［10］提出的彗星方法，具體步驟可參考文獻［8，11］.使用分析軟件CASP進行彗星數據分析，記錄尾長（tail length）、頭部（head）和尾部（tail）DNA的熒光強度，并將尾部DNA含量作為DNA損傷的定量指標［12］，即

式中，AT為尾部DNA熒光強度，AH為頭部DNA熒光強度.每個樣本分析不少于80個細胞，

取其中位值，再取3～4個平行樣的平均值.

2.4ROS測定

使用2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’，7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）作為熒光探針檢測ROS水平.DCFH-DA本身沒有熒光，且可以自由穿過細胞膜，在胞內可以被酯酶水解生成DCFH，而DCFH卻不能穿透細胞膜，從而被裝載到細胞內.細胞內的活性氧ROS可以氧化無熒光的DCFH，生成帶有熒光的DCF.通過檢測DCF的熒光強度即可指示細胞內活性氧的水平，具體步驟可參考文獻［8，11］.本實驗用光密度值來表示ROS水平，并將所得結果與對照組作歸一化處理.

2.5數據處理

數據的處理和計算采用Microsoft Office Excel 2007進行，數據以“平均值±標準差（X±SD）”的形式表示，各指標組間差異采用t檢驗法進行統計.

3　結果和討論

3.1細胞存活率

1-NP和B［a］p的化學結構式如圖1所示.圖2為1-NP和B［a］p聯合染毒條件下A549細胞的存活率，其中???表示染毒組與溶劑對照組相比p＜0.001；#和##分別表示1-NP單獨染毒組與1-NP和B［a］p聯合染毒組相比p＜0.05和p＜0.01.B［a］p的濃度選定為5μmol/L，在此濃度下B［a］p對A549細胞的存活率并無顯著影響（數據略）.由圖2（a）可見，經5μmol/L B［a］p和不同濃度的1-NP聯合染毒24 h，A549細胞的存活率與1-NP單獨染毒24 h相比，有不同程度的上升，且在1-NP濃度為4和5μmol/L處，呈顯著上升（p＜0.01）.由圖2（b）可見，使用5μmol/L B［a］p預染毒24 h，再使用不同濃度的1-NP染毒24 h，B［a］p預染毒可使1-NP 對A549細胞的增殖抑制作用有所減弱，與1-NP單獨染毒相比，細胞存活率略有上升，且在高劑量處呈顯著上升（p＜0.05）.

圖1 1-NP和B［a］p的化學結構式Fig.1 Chemical structures of 1-NP and B［a］p

圖2 1-NP和B［a］p聯合染毒條件下A549細胞的存活率Fig.2 Cell viability of A549 cells after treated with 1-NP and B［a］p

3.2DNA損傷

彗星照片顯示，對照組A549細胞頭部DNA致密，邊緣光滑，沒有明顯的損傷；而染毒組和陽性對照組一樣，拖尾明顯，成掃帚狀，且1-NP的濃度越高，拖尾現象越明顯（圖片略）.圖3為使用兩種不同的混合染毒方式，1-NP和B［a］p對A549細胞DNA的損傷，其中??和???分別表示染毒組與溶劑對照組相比p＜0.01和p＜0.001，##表示1-NP單獨染毒組與1-NP和B［a］p聯合染毒組相比p＜0.05.由圖3（a）可見，經5μmol/L B［a］p和不同濃度的1-NP聯合染毒24 h，可對A549細胞的DNA造成損傷，且隨著1-NP濃度的增加，尾部DNA含量不斷上升，呈顯著的劑量-效應關系（p＜0.01），與1-NP單獨染毒組相比，DNA損傷程度有顯著升高（p＜0.01）.由圖3（b）可見，使用5μmol/L B［a］p預染毒24 h，再使用不同濃度的1-NP染毒24 h，也會對A549細胞的DNA造成損傷，但與1-NP單獨染毒組相比，拖尾量并無顯著差異（p＞0.05）.

圖3 1-NP和B［a］p聯合染毒對A549細胞DNA的損傷Fig.3 DNA damage of A549 cells after treated with 1-NP and B［a］p

3.3ROS生成

圖4為1-NP和B［a］p聯合染毒對A549細胞內ROS水平的影響（對比于對照組的100倍），其中?和??分別表示染毒組與溶劑對照組相比p＜0.01和p＜0.001，#為1-NP單獨染毒組與1-NP和B［a］p聯合染毒組相比p＜0.01，tBHP為氧化劑叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydroperoxide）.由圖4（a）可見，經5μmol/L B［a］p和不同濃度的1-NP聯合染毒2 h后，A549細胞內的ROS水平隨1-NP濃度的增加而不斷升高，但與1-NP單獨染毒2 h相比，卻略有降低，且在1-NP濃度為5μmol/L處呈顯著降低.由圖4（b）可見，使用5μmol/L B［a］p預染毒24 h，再使用不同濃度的1-NP染毒2 h，B［a］p預染毒在某種程度上抑制了1-NP單獨染毒后細胞內ROS的生成，且在1-NP濃度為4和5μmol/L處，ROS的產量呈顯著下降（p＜0.05）.

圖4 1-NP和B［a］p聯合染毒對A549細胞內ROS水平的影響Fig.4　ROS formation of A549 cells after treated with 1-NP and B［a］p

4　結束語

MTT實驗是評價外源性物質總體毒性的常用方法之一.本研究結果表明：對于經B［a］p（5μmol/L）預染毒后的A549細胞，1-NP對其增殖抑制作用呈顯著降低；當B［a］p （5μmol/L）和不同濃度的1-NP同時作用于A549細胞時，1-NP對其增殖抑制作用也呈顯著降低.本研究采用的彗星實驗具有快速、簡便、應用范圍廣和靈敏度高等優點，是檢測細胞遺傳毒性的常用方法之一.本研究使用的是強堿性電泳液（pH＞13），通過尾部DNA的含量定量表征單個細胞DNA的損傷程度，是單鏈斷裂、雙鏈斷裂和堿性不穩定位點的綜合損傷結果.本研究結果顯示，1-NP可對A549細胞造成顯著的DNA損傷，且隨著1-NP濃度的升高，DNA的損傷程度顯著加深，并呈現劑量-效應關系（p＜0.01）.B［a］p（5μmol/L）預染毒24 h會使1-NP對A549細胞的DNA損傷加劇，具有統計學意義（p＜0.05）；當B［a］p （5μmol/L）和不同濃度的1-NP同時作用于A549細胞時，會加劇對A549細胞的DNA損傷，具有統計學意義（p＜0.05）.“氧化應激”是指機體的促氧化與抗氧化之間的不平衡狀態.以促氧化效應為主、抗氧化劑被消耗，中間會產生大量的ROS，通常會導致生物大分子如DNA的損傷，亦會誘導細胞死亡.當B［a］p與1-NP聯合染毒時，ROS水平低于1-NP單獨染毒時，但仍顯著高于對照組.

在本研究中，當B［a］p和1-NP同時作用于A549細胞時，降低了1-NP單獨染毒時產生的ROS，使得急性毒性降低，細胞的增殖活性抑制減弱，但DNA的損傷明顯高于1-NP單獨染毒組.這可以理解為當B［a］p和1-NP同時作用于A549細胞時，B［a］p的毒性和1-NP同時占據A549細胞的結合位點，A549細胞對不同PAHs的代謝方式和代謝能力不同，導致其表現出不同的生物學效應.B［a］p對細胞的增殖在24 h內沒有顯著性差異，這可能是由于時間較短，還檢測不到對細胞的增殖抑制，所以1-NP和B［a］p聯合染毒時檢測到的細胞存活率較1-NP單獨染毒時更高.5μmol/L的B［a］p誘導A549細胞產生ROS的能力較弱，因為搶占位點的原因，降低了1-NP作用于A549細胞產生的ROS水平，從而使聯合染毒產生的ROS低于1-NP單獨染毒時產生的ROS.1-NP和B［a］p都具有遺傳毒性，5μmol/L B［a］p的遺傳毒性大于1-NP，1-NP和B［a］p聯合染毒時，表現為B［a］p占突出優勢，導致的DNA損傷大于1-NP單獨染毒時.這也說明在1-NP和B［a］p聯合染毒時，B［a］p起主導作用.

用B［a］p預染毒A549細胞，誘導細胞內的抗氧化物酶（如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等）活化，使細胞的抗氧化能力增強，對細胞形成保護作用，降低了1-NP產生的ROS，使得A549細胞存活率顯著上升.用B［a］p預染毒A549細胞時，大量的B［a］p占據了有限的結合位點，但這種結合是不穩定的.因此，當B［a］p不存在，或與1-NP相比濃度特別低時，B［a］p所占據的有限的結合位點就會被1-NP所取代，表現為DNA損傷較1-NP單獨染毒時加重，但不存在顯著性差異.以上聯合實驗說明，1-NP作用于A549細胞導致的DNA損傷不僅是通過ROS攻擊DNA所致，同時還有其他方式，如nitro-PAHs直接或其代謝后產物與DNA形成加合產物，但具體是哪一種方式，還需要進一步研究.

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E-mail：yushang@shu.edu.cn

中圖分類號：R 994.6

文獻標志碼：A

文章編號：1007-2861（2016）02-0181-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-2861.2016.01.008

收稿日期：2016-01-12

基金項目：國家自然科學基金資助項目（21107068，41561144007）；上海大學長江學者和創新團隊發展計劃資助項目（IRT13078）

通信作者：尚羽（1982—），女，副研究員，博士，研究方向為大氣污染物的區域污染特征和健康影響.

Combined effects of 1-nitropyrene and benzo（a）pyrene on cytotoxicity and DNA damage in human lung epithelial A549 cells

SHANG Yu，ZHOU Qian，JIANG Yuting
（Institute of Environmental Pollution and Health，School of Environmental and Chemical Engineering，Shanghai University，Shanghai 200444，China）

Abstract：Using human lung epithelial A549 cells，combined toxic effects of 1-nitropyrene （1-NP）and benzo（a）pyrene（B［a］p）were evaluated.The 1-NP caused a significantly concentration-dependent viability decrease，DNA damage and reactive oxygen species（ROS）generation.Compared with the groups treated with 1-NP alone，viability was significantly increased and ROS generation was significantly reduced in combined-treated groups with 1-NP and B［a］p.However，the DNA damage was significantly increased in the combinedtreated groups compared with the groups treated with 1-NP alone.These results suggested that 1-NP may mediate the cytotoxic effects through ROS generation，and pretreatment，with B［a］p may inhibit ROS generation induced by 1-NP，and thereby reducing the cell death in A549 cells.However mechanisms of DNA damage deserves further investigations.

Key words：1-nitropyrene（1-NP）；benzo（a）pyrene（B［a］P）；particulate matter；DNA damage；reactive oxygen species（ROS）