低氧后處理對全腦缺血大鼠認知功能及海馬CA1區沉默信息調節因子1表達的影響

刁莉君，李建民，趙雅寧，陳長香，周娜

?

低氧后處理對全腦缺血大鼠認知功能及海馬CA1區
沉默信息調節因子1表達的影響

刁莉君1，李建民2，趙雅寧1，陳長香1，周娜1

［摘要］目的觀察低氧后處理對全腦缺血大鼠認知功能及海馬CA1區沉默信息調節因子1（SIRT1）表達的影響。方法成年健康Sprague-Dawley大鼠60只，隨機分為假手術組、模型組和低氧后處理組，每組20只。各組根據缺血再灌注的時間分為1d、2d、3d、7d四個亞組，每個亞組5只。采用改良Pulsinelli四血管閉塞法制備全缺血再灌注大鼠模型，低氧后處理組在缺血后給予8%低氧2h處理。Morris水迷宮實驗檢測大鼠認知功能，光鏡下觀察海馬CA1區神經細胞形態變化及存活神經細胞數量，免疫組織化學法、Western blotting檢測海馬區SIRT1表達。結果與模型組相比，低氧后處理組逃避潛伏期縮短（P＜0.05），穿越平臺次數增加（P＜0.05），探索速度、平臺象限路程百分比增加（P＜0.05），探索路程縮短（P＜0.05）；海馬區神經細胞損傷較輕，存活神經元細胞增加（P＜0.05）；相應各時間點SIRT1表達升高（P＜0.05）。結論低氧后處理能夠改善全腦腦缺血大鼠的認知功能，其機制與低氧后處理提高海馬組織中SIRT1蛋白表達水平有關。

［關鍵詞］腦缺血；低氧后處理；認知功能；沉默信息調節因子1；大鼠

［本文著錄格式］刁莉君，李建民，趙雅寧，等.低氧后處理對全腦缺血大鼠認知功能及海馬CA1區沉默信息調節因子1表達的影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（6）：629-634.

CITED AS：Diao LJ，Li JM，Zhao YN，et al.Effects of hypoxic post-conditioning on cognitive function and expression of silent information regulator 1 in hippocampal CA1 of rats with global cerebral ischemia［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（6）：629-634.

腦血管病是中國第三大死因和首要的致殘因素，且流行病學調查顯示我國腦血管病的發病率呈逐年上升趨勢。缺血性腦卒中患者約占腦血管病患者的80%，而且高達64%的腦卒中患者存在不同程度的認知功能缺損［1］。然而腦缺血性認識功能損傷的預防及治療仍然是目前的難點，尤其是發生機制尚有待進一步研究。

低氧后處理是指當機體缺血損傷后給予適度低氧干預，誘導組織代償性修復［2］。2003年趙志青等首次發現低氧后處理能有效修復心肌損傷細胞［3］，隨后Pignataro等研究發現給予腦損傷成年鼠低氧后處理體外干預能促進修復成年鼠腦損傷［4］。隨著對低氧后處理的深入研究，較多研究證實低氧后處理干預成年鼠腦損傷時可通過調節自噬、凋亡細胞及炎癥標志物等的表達抑制神經元死亡，進而有效減少腦損傷面積［5-6］。由于低氧后處理是一種體外無創性操作，因此更具臨床應用價值。然而，低氧后處理是否能改善腦缺血大鼠認知損傷功能及神經保護作用具體機制方面的研究仍較少。

沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是廣泛存在于哺乳動物中NAD+依賴的去乙酰化酶［7］，在哺乳動物的腦神經元中高表達，具有調節神經損傷修復及神經保護作用［8］。本研究建立低氧后處理模型，觀察大鼠認知功能的變化、海馬區神經細胞形態結構及SIRT1的表達。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

成年雄性Sprague-Dawley大鼠60只，體質量250～350g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。采用隨機數字表法，將大鼠分成假手術組（n=20）、模型組（n=20）和低氧后處理組（n=20），每組根據缺血再灌注的時間又分為1d、2d、3d、7d 4個亞組。

1.2模型制備

按照Pulsinelli經典的四血管閉塞法進行改良制作全腦缺血模型［9］。10%水合氯醛4mg/kg常規麻醉大鼠，枕后部正中切口，暴露雙側第1頸椎橫突翼孔，直視下熱凝椎動脈，電凝每次時間約3～5s，使雙側椎動脈永久閉塞。頸部正中切口，分離雙側頸總動脈，在動脈下留置手術線備用。術后大鼠縫合回籠，24h后以無創性微動脈夾夾閉雙側頸總動脈，缺血20min后松開動脈夾，實行再灌注。

模型成功標準：同時夾閉雙側頸總動脈后30～60s內大鼠的意識喪失，翻正反射消失，瞳孔放大，眼睛顏色由紅變白，呼吸急促，松開動脈夾后10～20s，眼球顏色快速恢復紅色，大鼠的意識恢復，并能活動。剔除夾閉動脈后誘發癲癇、頸動脈破裂大出血、術后出現肢體癱瘓、手術不成功和死亡大鼠，并予以補齊。

假手術組大鼠常規麻醉，枕后部正中切口，不電凝椎動脈，分離暴露血管，但不夾閉頸總動脈。

低氧后處理組在大鼠腦缺血20min后再灌注1d，置于大小約9000cm3的低氧箱內，連續通入8% O2+92%N2混合氣體2h，流速200ml/min。低氧期間禁食不禁水，每次放入低氧箱內大鼠不得多于3只。

1.3Morris水迷宮

各7d亞組通過Morris水迷宮實驗測定大鼠認知功能。

1.3.1定位航行實驗

于缺血后第3～6天進行，每天上午9：00開始，每天4次，每次間隔至少30min，連續訓練4d。按照隨機順序，使大鼠面向池壁分別從四個象限的入水點放入水中，使其尋找水下的平臺。圖像監視系統自動追蹤記錄其從入水到爬上平臺經過的總路程及爬上平臺所需的時間，該時間即其逃逸潛伏期，每天4次測定結果的平均值為其當天逃逸潛伏期。

1.3.2空間探索實驗

第7天移走平臺，將大鼠從第二象限的入水點面向池壁放入水中，監視系統自動追蹤記錄其90s內穿越平臺象限次數、平臺象限路程百分比、探索路程以及探索速度。

1.4HE染色

大鼠缺血再灌注1d、2d、3d、7d，給予腹腔注射10%水合氯醛4mg/kg麻醉后，心臟灌注后斷頭取腦，取視交叉至乳頭體腦組織常規脫水、浸蠟包埋。石蠟切片機連續切片，厚度約4 μm，置60℃烤箱烘烤備用。HE染色后，200倍光鏡下觀察腦組織海馬CAl區不重疊的6個視野，采用Motie 6.0數碼醫學圖像分析系統檢測海馬CAl區存活神經元個數，取平均值。

1.5免疫組化染色

大鼠腦缺血再灌注1d、2d、3d、7d四個時間點給予常規麻醉，心臟灌流后斷頭取腦，取視交叉至乳頭體腦組織常規脫水、浸蠟、包埋。石蠟切片機連續切片，厚度約4 μm，置60℃烤箱烘烤2h后備用。玻片脫蠟水化；枸櫞酸高壓熱修復，冷卻。3%過氧化氫室溫15min封閉內源性過氧化物酶活性，PBS沖洗后，滴加稀釋SIRT1抗體一抗（1∶300），4℃冰箱過夜；滴加二抗37℃孵育1h后DAB顯色。蘇木素復染，鹽酸酒精分化后，封片。光鏡下觀察SIRT1蛋白染色呈棕褐色顆粒，位于細胞核內。高倍鏡下觀察并選取6個不重疊的視野，進行SIRT1蛋白陽性細胞計數，取平均數進行統計分析。

1.6Western blotting

大鼠腦缺血再灌注1d、2d、3d、7d四個時間點，給予腹腔注射10%水合氯醛4mg/kg麻醉后立即斷頭于冰上取海馬，液氮凍存片刻后保存于-80℃冰箱。取出的組織置于15ml離心管中，加入預冷的組織裂解液，4℃12000 r/min離心10min，取上清液，考馬斯亮藍法蛋白質定量。PBS調蛋白濃度至800μg/ml，加入等體積上樣緩沖液，沸水煮5min。冷卻至室溫，放入4℃冰箱備用。取蛋白樣品60μg，凝膠電泳，以半干轉膜至NC膜，室溫封閉1h。加SIRT1抗體，分子量為81 kDa，稀釋濃度為1∶1000。4℃冰箱孵育過夜。加稀釋二抗（1∶1000），37℃反應2h，ECL顯色，暗室膠片曝光顯影，Image J分析。

1.7統計學分析

2　結果

2.1Morris水迷宮

與假手術組比較，模型組大鼠第3～6天逃逸潛伏期延長，第7天穿越平臺次數減少，探索速度、平臺象限路程百分比降低，探索路程增加（P＜0.05）；與模型組比較，低氧后處理組第3～6天逃逸潛伏期縮短，第7天穿越平臺次數增加，探索速度、平臺象限路程百分比增加，探索路程縮短（P＜0.05）。見表1、表2。

表1　各組大鼠定位航行實驗逃避潛伏期的比較（s）

表2　各組大鼠空間探索實驗各項指標的比較

2.2HE染色

假手術組大鼠海馬區神經元結構完整清晰，排列整齊致密，細胞核大而圓，未見變性壞死的神經元；與假手術組比較，模型組神經元進行性壞死：第1天出現大量神經元核深染，部分神經元出現水腫，第2天神經元水腫加重，排列松散，細胞輪廓不清，細胞核模糊，第3天神經元核皺縮明顯，部分細胞溶解碎裂，第7天大量壞死神經元溶解，余紅色殘碎部分，少數細胞形態可辨，神經元數量減少（P＜0.05）。與模型組比較，低氧后處理組神經元損傷均減輕，第1天可見神經元深染，但明顯減少；第2、3、7天部分神經元形態清晰，排列整齊，正常神經元數目較模型組增多（P＜0.05）。見表3、圖1。

表3　各組大鼠海馬CA1區存活神經元細胞數量比較（n）

2.3免疫組化檢測

SIRT1陽性染色顯棕褐色，陽性產物定位于細胞核中。假手術組各時間點偶見陽性表達細胞。與假手術組比較，模型組相應各時間點SIRT1免疫活性增高（P＜0.05）；與模型組比較，低氧后處理組相應各時間點SIRT1免疫活性增高（P＜0.05）。見表4、圖2。

表4　各組大鼠海馬CA1區SIRT1陽性細胞數量比較（n）

2.4Western blotting

與假手術組比較，模型組各時間點SIRT1蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，低氧后處理組各時間點SIRT1蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見表5、圖3。

表5　各組大鼠海馬CA1區SIRT1蛋白含量表達比較

圖1　各組大鼠海馬CA1區神經細胞（HE染色，400×）

圖2　各組大鼠海馬CA1區SIRT1陽性表達（免疫組化染色，400×）

圖3　Western blotting檢測各組大鼠海馬區SIRT1蛋白

3　討論

腦卒中是導致神經功能障礙的首要病因，超過65歲的腦卒中患者在發病6個月后，約46%發生認知功能障礙［10］。已知在腦組織各結構中海馬神經元對缺血損傷最敏感，全腦缺血后認知障礙與海馬CA1區神經元死亡相關［11］。在本研究中，模型組大鼠腦缺血后水迷宮實驗顯示其逃避潛伏期延長，穿越平臺象限次數減少，海馬CA1區存活神經元減少，說明腦缺血模型制作成功。而低氧后處理組較假手術組大鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺象限次數增加，海馬CA1區存活神經細胞增加，提示低氧后處理可減輕大鼠腦缺血神經損傷，改善大鼠認知功能障礙。

SIRT1是一種去乙酰化酶，在哺乳動物腦神經細胞中高表達，與細胞增殖、分化、衰老、自噬、代謝等密切相關［12］。研究發現SIRT1在腦缺血中起神經保護作用，其機制包括：①提高糖酵解和抑制糖異生，促進神經元能量恢復；②激活代謝調控中的重要分子過氧化物酶體增殖激活受體共激活因子1α（PGC-1α）；③上調超氧化物歧化酶及硫氧還蛋白1等抗氧化劑來對抗缺血再灌注時的氧化應激；④去乙酰化P53蛋白從而抑制P53誘導的細胞凋亡；⑤使核因子（NF-κB）的亞單位去乙酰化，致使其基因表達缺失，從而抑制炎癥反應對神經元的損傷作用；⑥促進神經細胞軸突增殖和分化；⑦調節自噬等途徑。在Nadtochiy、石瑤等的研究中發現缺血預處理及白藜蘆醇預處理可提高腦缺血大鼠腦組織中SIRT1的表達，從而起到神經保護作用［13-14］。然而腦缺血發生具有不可預知性，預處理很難在臨床中開展，低氧后處理作為一種臨床可操作性更強的手段逐漸成為研究熱點。

低氧后處理是在機體缺血、缺氧損傷后給予一定濃度的低氧處理，使機體產生內源性保護作用，較早應用在心肌缺血損傷的保護中［3］。隨著對低氧后處理研究的深入，較多學者發現低氧后處理能抑制神經元死亡，減少腦缺血損傷面積，主要機制為通過調節凋亡和自噬減少海馬區神經元的死亡［15-18］。但能否促進腦組織中SIRT1的表達以及通過何種分子機制起到神經保護作用仍不清楚。本實驗的免疫組化結果顯示，低氧后處理組大鼠各相應時間點海馬區SIRT1免疫陽性表達較模型組增高，且Western blotting在蛋白水平進一步驗證這一結果，說明低氧后處理促進大鼠海馬區SIRT1的表達。

綜上所述，本研究認為低氧后處理可減輕大鼠缺血性腦損傷，改善大鼠認知功能，其機制可能與低氧后處理提高海馬區SIRT1的表達有關。

［參考文獻］

［1］林琬，鄭璇.缺血性卒中后認知障礙［J］.國際腦血管病雜志，2010，18 （2）：132-136.

［2］Li Y1，Lv Z，Liu X，et al.Hypoxic postconditioning inhibits endoplasmic reticulum stress- mediated cardiomyocyte apoptosis by targeting PUMA［J］.Shock，2013，39（3）：299-303.

［3］Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285 （2）：H579-H588.

［4］Pignataro G，Meller R，Inoue K，et al.In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke：ischemic postconditioning［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2008，28（2）：232-241.

［5］Granfeldt A，Lefer DJ，Vinten-Johansen J.Protective ischaemia in patients：preconditioning and postconditioning［J］.Cardiovasc Res，2009，83（2）：234-246.

［6］Leconte C，Tixier E，Freret T，et al.Delayed hypoxic postconditioning protects against cerebral ischemia in the mouse［J］.Stroke，2009，40 （10）：3349-3355.

［7］Dryden SC，Nahhas FA，Nowak JE，et al.Role for human SIRT2 NAD-dependent deacetylase activity in control of mitotic exit in the cell cycle［J］.Mol Cell Biol，2003，23（9）：3173-3185.

［8］Ramadori G，Lee CE，Bookout AL，et al.Brain SIRT1：anatomical distribution and regulation by energy availability［J］.J Neurosci，2008，28 （40）：9989-9996.

［9］Pulsinelli WA，Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat［J］.Stroke，1979，10（3）：267-272.

［10］Go AS，Mozaffarian D，Roger VL，et al.Executive summary：heart disease and stroke statistics-2014 update：a report from the American Heart Association［J］.Circulation，2014，129（3）：399-410.

［11］Gorchetchnikov A，Grossberg S.Space，time and learning in the hippocampus：how fine spatial and temporal scales are expanded into population codes for behavioral control［J］.Neural Netw，2007，20（2）：182-193.

［12］Alcendor RR，Gao S，Zhai P，et al.Sirt1 regulates aging and resistance to oxidative stress in the heart［J］.Circ Res，2007，100（10）：1512-1521.

［13］石瑤，郭倩，周也涵，等.白藜蘆醇通過Sirtuins 1通路促進自噬減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷［J］.基礎醫學與臨床，2015，35（4）：496-501.

［14］Nadtochiy SM，Redman E，Rahman I，et al.Lysine deacetylation in ischaemic preconditioning：the role of SIRT1［J］.Cardiovasc Res，2011，89（3）：643-649.

［15］Li Y，Guo Q，Liu X，et al.PUMA-mediated mitochondrial apoptotic disruption by hypoxic postconditioning［J］.Apoptosis，2015，20（8）：1026-1032.

［16］王燕梅.自噬參與低氧后處理對成年大鼠短暫全腦缺血的保護作用［D］.廣州：廣州醫學院，2012.

［17］Zhu P，Zhan L，Zhu T，et al.The roles of p38 MAPK/MSK1 signaling pathway in the neuroprotection of hypoxic postconditioning against transient global cerebral ischemia in adult rats［J］.Mol Neurobiol，2014，49（3）：1338-1349.

［18］Zhan L，Li D，Liang D，et al.Activation of Akt/FoxO and inactivation of MEK/ERK pathways contribute to induction of neuroprotection against transient global cerebral ischemia by delayed hypoxic postconditioning in adult rats［J］.Neuropharmacology，2012，63（5）：873-882.

Effects of Hypoxic Post-conditioning on Cognitive Function and Expression of Silent Information Regulator 1 in Hippocampal CA1 of Rats with Global Cerebral Ischemia

DIAO Li-jun1，LI Jian-min2，ZHAO Ya-ning1，CHEN Chang-xiang1，ZHOU Na1

1.a.College of Nursing and Rehabilitation，b.School of Basic Medical Sciences，North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China；2.Department of Neurosurgery，North China University of Science and Technology Affiliated Hospital，Tangshan，Hebei 063000，China

Correspondence to ZHAO Ya-ning.E-mail：zyning789@126.com

Abstract：Objective To explore the effects of hypoxic post-conditioning on cognitive function and the expression of silent information regulator 1（SIRT1）in hippocampal CA1 of rats with cerebral ischemia.Methods Sixty Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group，model group and treatment group with 20 cases in each group.Each group was divided into one day，two days，three days，seven days subgroups according to the time of ischemia reperfusion.Global cerebral ischemia reperfusion was induced with modified Pulsinelli′4-vessel occlusion.The treatment group received 8%oxygen for two hours after ischemia.The cognitive function was assessed with Morris water maze test.Morphological changes of the hippocampal CA1 region were observed by HE staining.The expression of SIRT1 in the hippocampal CA1 region was detected with immunohistochemical assay and Western blotting.Results Compared with the model group，the escape latency significantly shortened（P＜0.05），the number of times crossing the platform increased（P＜0.05），the speed and the percentage of time spent in the platform quadrant increased（P＜0.05），and the total distance decreased（P＜0.05）；the expression of SIRT1 in hippocampal CA1 increased（P＜0.05）and the number of normal neurons increased（P＜0.05）in the treatment group.Conclusion Hypoxic post-conditioning can improve the cognitive function of rats with global cerebral ischemia，which may relate with up-regulating SIRT1 in hippocampus.

Key words：cerebral ischemia；hypoxic post-conditioning；cognitive function；silent information regulator 1；rats

［中圖分類號］R743

［文獻標識碼］A

［文章編號］1006-9771（2016）06-0629-06

DOI：10.3969/j.issn.1006-9771.2016.06.002

基金項目：1.河北省自然科學基金資助項目（No.ZD2013093）；2.河北省自然科學基金資助項目（No.H2012401007）。

作者單位：1.華北理工大學，a.護理與康復學院；b.基礎醫學院，河北唐山市063000；2.華北理工大學附屬醫院神經外科，河北唐山市063000。

作者簡介：刁莉君（1987-），女，漢族，安徽亳州市人，碩士研究生，主要研究方向：腦損傷的研究。通訊作者：趙雅寧（1978-），女，漢族，河北唐山市人，博士，教授，主要研究方向：腦損傷的研究。E-mail：zyning789@126.com。

收稿日期：（2015-12-01修回日期：2016-01-22）