不同頻率電針對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力和海馬突觸的影響

王穎，李威，張亢亢，王慧，孔立紅

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不同頻率電針對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力和海馬突觸的影響

王穎，李威，張亢亢，王慧，孔立紅

［摘要］目的探討不同頻率電針對阿爾茨海默病（AD）大鼠學習記憶能力和大腦海馬組織突觸形態學和突觸密度的影響。方法48只Wistar大鼠按隨機數字表法分為正常組、假手術組、模型組、2Hz電針治療組、30Hz電針治療組、50Hz電針治療組，每組8只。以雙側腦室注射Aβ1-42誘導建立AD模型，假手術組雙側腦室注射0.9%氯化鈉。2Hz、30Hz、50Hz電針組大鼠選百會、腎俞進行電針治療14d。采用Morris水迷宮測試各組大鼠學習記憶能力，透射電鏡觀察海馬突觸的超微結構，統計突觸密度。結果各電針治療組與模型組比較，逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.01），首次跨越平臺的時間明顯縮短（P＜0.01），跨越平臺次數明顯增加（P＜0.01），以50Hz電針治療組為著。各電針治療組與模型組比較，海馬CA1區突觸數目明顯增多，突觸密度明顯增大（P＜0.01）。與2Hz、30Hz電針治療組比較，50Hz電針治療組突觸數目明顯增多（P＜0.01）。結論電針能夠改善AD大鼠的學習記憶能力，提高海馬的突觸密度，高頻電針治療效果優于低頻、中頻。

［關鍵詞］阿爾茨海默病；電針；頻率；學習記憶能力；突觸密度；大鼠

［本文著錄格式］王穎，李威，張亢亢，等.不同頻率電針對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力和海馬突觸的影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（6）：635-639.

CITED AS：Wang Y，Li W，Zhang KK，et al.Effect of electroacupuncture with different frequencies on learning and memory ability and synapse in hippocamp in rats with Alzheimer's disease［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（6）：635-639.

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種老年人常見的中樞神經系統變性疾病，早期臨床表現為記憶力減退、輕度認知功能障礙［1］。突觸是神經系統信息傳遞和加工的重要環節，突觸損傷和丟失是AD患者最早出現的病理變化［2］。越來越多的證據表明AD早期出現的輕度認知功能下降與突觸功能障礙相關［3-5］。本研究分別設立低頻、中頻、高頻三組不同頻率電針，選取百會、腎俞穴對AD模型大鼠進行針刺治療，運用Morris水迷宮測試對AD大鼠進行行為學檢測，在透射電鏡下觀察各組大鼠海馬突觸密度的變化，探討不同頻率電針防治AD大鼠突觸損傷的機制，為電針治療AD提供臨床依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組

SPF級健康雄性Wistar大鼠48只，3～4月齡，體質量300～350g，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2008-0005。實驗前將大鼠適應性喂養1周，動物房溫度控制在（22±2）℃，濕度維持在55%左右。

大鼠適應性喂養1周后進行Morris水迷宮學習訓練。參照文獻方法［6］，實驗前將大鼠放置在安全平臺上15s，然后分別從第1象限到第4個象限中點放入水中，依次游完4個象限為訓練1次，電腦記錄其在120s內找到水下實驗平臺的時間，每訓練3次后測試1次，在120s內未找到目標平臺的大鼠則被認為智力異常，予以剔除。

按隨機數表法將Wistar大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、2Hz電針治療組、30Hz電針治療組、50Hz電針治療組，每組各8只。

1.2實驗儀器與實驗試劑

DW-5大鼠腦立體定位儀：成都泰盟科技有限公司。Morris水迷宮系統：成都泰盟科技有限公司。28 號1寸不銹鋼毫針：蘇州醫療用品廠。HANS-100A韓式電針儀：南京濟生醫療科技有限公司。HT7700透射電鏡：日本日立公司。EMUC7切片機：德國萊卡公司。大鼠β樣淀粉樣蛋白Aβ1-42：美國SIGMA公司。

1.3模型制作

按照O'hare方法［7］制備模型。實驗前大鼠稱重，用10%水合氯醛0.3g/kg腹腔注射麻醉，在無菌條件下，用腦立體定位儀固定大鼠，按照《大鼠腦立體定位圖譜》［8］選擇大鼠海馬區齒狀回，前囟后3.2mm，中線左右各旁開2.5mm，深度3.5mm，用牙科鉆在大鼠顱骨上鉆孔。用磷酸鹽緩沖液將Aβ1-42配制成濃度為1μg/μl的溶液，37℃孵育1周后成為寡聚肽，用5 μl微量注射器緩慢將Aβ1-42注入海馬齒狀回，雙側分別注射5 μl，以1 μl/min的速度注射，5min內注完，留針5min讓藥物充分吸收。牙托粉封閉顱骨鉆孔，縫合皮膚，碘酒消毒。

假手術組處理方法同模型組，雙側齒狀回區注射生理鹽水5 μl。造模完成大鼠連續3d腹腔內注射青霉素4×104U，預防大鼠感染。

1.4方法

造模15d后，電針治療組選取百會（頂骨正中）和腎俞（腰椎下兩旁2穴）進行針刺，百會向前平刺5mm，腎俞稍向內斜刺5mm，然后接韓式電針儀，百會接負極，腎俞接正極，左右側腎俞每日交替使用。2Hz電針治療組：頻率2Hz，電壓2～4 V，電流1～2 mA，選用連續波，每次治療留針20min左右，每天1次，7d為1個療程，療程間休息1d，共治療2個療程。30Hz電針治療組和50Hz電針治療組：操作方法同2Hz電針治療組，僅針刺頻率不同。

1.5Morris水迷宮測試

治療2個療程結束后采用Morris水迷宮視頻分析系統，通過定位航行實驗和空間探索實驗檢測大鼠行為記憶能力。

定位航行實驗。平臺位于第3象限中間，距離水面1cm，將大鼠面向池壁分別從4個象限放入水中各1次，記錄其在120s內找到隱藏在水面以下平臺的時間，記錄為逃避潛伏期；若120s內未找到平臺者則將其引至平臺停留10s，記錄逃避潛伏期為120s。

空間探索實驗。去除平臺后，將大鼠從原平臺象限的對側象限放入水中，連續記錄其在120s的游泳軌跡，在平臺象限逗留時間和跨越平臺象限次數。數據采集和處理由圖像自動監視和處理系統完成。

1.6電鏡下觀察海馬CA1區突觸形態和數目

1.6.1灌注與取材

各組Morris水迷宮試驗完成后進行灌注取材。10%水合氯醛45mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于試驗臺上，在劍突下打開胸腔，暴露心臟，從左心室插入灌流針并固定，用生理鹽水200ml灌注沖洗體內血液，剪開右心耳，沖洗至大鼠眼球、口腔黏膜及肝臟組織泛白，后用4%多聚甲醛300ml快速灌注直至大鼠肢體及內臟組織僵硬為止。大鼠斷頭后快速剝離顱骨，分別取出大小為1mm3海馬CA1區組織，放入2.5%戊二醛固定液中固定保存，用于電鏡樣品制備。

1.6.2電鏡樣品的制作和觀察

戊二醛固定后用0.lmol/L PBS緩沖液沖洗3次，每次10min，將標本置入1%四氧化鋨中固定1h。0.lmol/L PBS緩沖液沖洗3次，每次10min，后再分別用濃度為50%、70%、80%、90%的丙酮脫水20min；Epon812組織滲透，平板包埋后在光鏡下定位取材，切片機將包埋塊切成50nm超薄切片，用2%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行雙重染色。在透射電子顯微鏡下進行突觸計數。取5000倍，避開大的樹突干、血管和各種細胞體，在整個切片上下左右分別選取5個點進行攝片。電鏡攝片面積為5.6×6.0 μm2，切片厚度為50nm，即為觀察1.68 μm3的突觸數目，在電鏡照片上辨認和計數突觸終末，計算單位面積神經氈內突觸數量。

1.7統計學分析

2　結果

2.1Morris水迷宮測試

模型組與正常組、假手術組比較逃避潛伏期明顯延長（P＜0.01），首次跨越平臺的時間明顯延長（P＜0.01），跨越平臺次數明顯減少（P＜0.01）。電針治療組與模型組比較逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.01），首次跨越平臺的時間明顯縮短（P＜0.01），跨越平臺次數明顯增加（P＜0.01）。50Hz電針治療組與2Hz電針治療組、30Hz電針治療組比較，逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.01），首次跨越平臺的時間縮短（P＜0.05），跨越平臺次數增加（P＜0.05）。2Hz電針治療組、30Hz電針治療組逃避潛伏期比較無顯著差異（P=0.710），首次跨越平臺時間比較無顯著性差異（P=0.821），跨越平臺次數比較無顯著性差異（P=0.603）。見表1、表2。

2.2各組大鼠海馬CA1區突觸電鏡結果

2.2.1海馬CA1區突觸超微結構的觀察

正常組、假手術組神經氈內可見大量突觸，突觸輪廓完整，分界清楚，突觸小泡分布密集均勻。模型組神經氈突觸數目明顯減少，突觸輪廓不完整，突觸間隙模糊，突觸前膜、后膜不清晰、變薄，突觸小泡明顯減少，甚至消失，典型的突觸結構消失。2Hz電針治療組、30Hz電針治療組可見較多突觸，突觸前膜內的突觸小泡也較多。50Hz電針治療組可見突觸前終末的突觸小泡密集分布，較多圓形清亮小泡，突觸前、后膜較模型組、假手術組增厚。見圖1。

2.2.2突觸密度

與正常組相比，假手術組神經氈內突觸密度無顯著性差異（P=0.540），模型組大鼠海馬突觸密度明顯減小（P＜0.01）。與模型組比較，電針治療組突觸密度較模型組明顯增大（P＜0.01），2Hz和30Hz電針組突觸密度無顯著性差異（P=0.918）。50Hz電針組突觸數目較2Hz電針組和30Hz電針組明顯增多（P＜0.01）。見表3。

表1　各組定位航行實驗平均逃避潛伏期比較（s）

表2　各組空間探索實驗首次跨越平臺時間、跨越次數比較

表3　各組海馬CA1區神經氈內突觸密度比較（/1.68 μm3）

圖1　電鏡下海馬CA1區的突觸形態和突觸數目（透射電鏡，5000×）

3　討論

AD是癡呆最常見的類型，病理特征為老年斑、神經元纖維纏結，海馬錐體細胞空泡樣變性，神經元缺失和軸索、突觸的異常斷裂等［1，9］。突觸是神經元之間連接的基礎，也是神經信息傳遞的關鍵部位。只有保持突觸結構和功能的完整，才能使神經元彼此之間順利進行信息傳遞、加工和存儲。Selkoe發現AD是寡聚態的Aβ沉積導致突觸功能障礙，突觸密度是腦組織和結構的重要指標［10］。有學者認為AD患者的認知水平與海馬以及聯合皮質的突觸密度密切相關［11］。本研究將Aβ1-42定位注射于海馬齒狀回，電鏡下觀察到模型組海馬CA1區神經氈突觸數目明顯減少，突觸輪廓不完整，突觸間隙模糊，典型的突觸結構消失，突觸密度明顯下降。這與Selkoe等的研究結果［9］相一致。

AD患者腦內突觸的減少可能由于Aβ寡聚體選擇性的積聚于突觸部位，引起突觸膜蛋白、突觸囊泡蛋白的表達減少，損傷突觸內蛋白、樹突棘形態和密度，導致突觸數量的減少和突觸密度的下降，破壞神經元之間的聯系，引起認知和記憶障礙［12-15］。

中醫認為AD為腎氣不足、髓海空虛所致。記憶功能與腎中的精氣功能密切相關，腎氣充足則腦髓充實，才能正常的思維、學習和記憶。腎俞位于背部屬于足太陽膀胱經，與足少陰腎經為表里經。督脈與腦的聯系最直接、密切。百會位于人之顛頂，屬督脈，為手足三陽、督脈之匯，具有醒腦開竅、補腦益智之功，是治療腦病的要穴［16］。百會、腎俞兩穴合用共奏醒腦開竅，益腎調督，激活臟腑功能，從而改善其精神及運動功能。羅磊等發現針灸腎俞、關元穴能有效抑制海馬神經元線粒體中Aβ-結合性乙醇脫氫酶蛋白（ABAD）的過度表達，提高細胞色素氧化酶Ⅳ（COXⅣ）的活性，從而減輕海馬神經元的損傷［17］。崔翔等發現益腎調督針灸法有效地抑制海馬線粒體CypD表達，從而阻滯線粒體通透性轉換孔的形成，減少線粒體損傷。以上研究均證實益腎調督針刺法對于AD具有良好的療效［18］。

針灸治療疾病，具有整體、良性的調節作用，且安全性高。電針治療AD的臨床療效確定。頻率是電針刺激的重要參數之一。張超等發現電針治療大腦中動脈閉塞大鼠，針刺組與模型組、非針刺組相比較，腦血流量與神經行為學評分均有不同程度提高，尤其是針刺頻率為3次/s時，腦血流量和神經行為學評分的改善最顯著［19］。歐陽鋼等發現電針治療腦卒中患者療效與不同針刺頻率有關，與2Hz比較，100Hz頻率針刺更能提高其腦血流量，改善腦細胞功能［20］。這說明針刺的頻率與療效有密切關系。因此本實驗運用不同頻率電針進行治療干預，結果表明2Hz、30Hz、50Hz電針組均能有效地改善AD大鼠學習記憶能力，且50Hz電針治療組優于30Hz、2Hz電針治療組。透射電鏡下觀察，各組AD大鼠海馬的突觸數目增加，尤其是50Hz治療組，與AD大鼠行為學測試結果基本一致。

本研究說明電針可以明顯改善AD大鼠的空間學習能力和記憶水平，高頻電針組治療效果優于低頻電針組。高頻電針將較強刺激信號傳導至大腦，提高大腦血流灌注量，啟動機體的自身調節功能，清除腦內β樣淀粉樣蛋白，激活Wnt信號通路，從而使沉默突觸復蘇和修復、再生，增加突觸數目，提高海馬組織的突觸密度，改善AD大鼠的學習記憶水平。更多深層次的機制有待于進一步研究。

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Effect of Electroacupuncture with Different Frequencies on Learning and Memory Ability and Synapse in Hippocamp in Rats with Alzheimer's Disease

WANG Ying，LI Wei，ZHANG Kang-kang，WANG Hui，KONG Li-hong

Hubei University of Traditional Chinese Medicine，Wuhan，Hubei 430061，China

Correspondence to KONG Li-hong.E-mail：xiyu1618@sina.com

Abstract：Objective To observe the effect of electroacupuncture with different frequencies on learning and memory ability，synaptic morphology and synaptic density in the hippocampus of Alzheimer's disease rats.Methods Forty-eight healthy Wistar rats were randomly divided into normal group，sham operation group，model group，2Hz，30Hz and 50Hz electroacupuncture groups with 8 cases in each group.The Alzheimer's disease model was established by injecting Aβ1-42into two sides of lateral cerebral ventricle.The sham operation group was injected with normal saline instead.The electroacupuncture groups received electroacupuncture at Baihui（DU20）and Shenshu（BL23）acupoints.The learning and memory ability was evaluated with Morris water maze test，and the morphology and density of synapse were observed by electron microscope.Results Compared with the model group，the latency was shorter，the time of crossing the platform was shorter and the number of crossing the platform was more in the electroacupuncture groups（P＜0.01），especially in the 50Hz electroacupuncture group（P＜0.01）.The number of synapse and the synaptic density were more in the electroacupuncture groups than in the model group（P＜0.01），especially in the 50Hz electroacupuncture group（P＜0.01）.Conclusion Electroacupuncture could improve learning and memory ability and increase synaptic density in rats with Alzheimer's disease，especially with high frequency.

Key words：Alzheimer's disease；electroacupuncture；frequency；learning and memory ability；synaptic density；rats

［中圖分類號］R749.1

［文獻標識碼］A

［文章編號］1006-9771（2016）06-0635-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-9771.2016.06.003

基金項目：國家自然科學基金項目（No.81373741）。

作者單位：湖北中醫藥大學，湖北武漢市430061。

作者簡介：王穎（1981-），女，湖南漣源市人，博士研究生，主要研究方向：針灸防治腦病。通訊作者：孔立紅（1960-），女，教授，博士生導師，主要研究方向：針灸防治腦病。E-mail：xiyu1618@sina.com。

收稿日期：（2016-03-28修回日期：2016-05-17）