核黃疸模型大鼠腦細胞損傷及行為學后遺癥的研究

劉祎，肖農，毛振沙

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核黃疸模型大鼠腦細胞損傷及行為學后遺癥的研究

劉祎，肖農，毛振沙

［摘要］目的探討核黃疸模型大鼠腦細胞損傷及行為學改變情況。方法25只5日齡Sprague-Dawley大鼠隨機分為對照組（n=11）和模型組（n=14）。模型組予小腦延髓池內注射膽紅素溶液10μg/g，對照組注射等量生理鹽水。觀察注射后大鼠的神經行為變化，并記錄其體質量；建模后第1天予TUNEL法觀察模型組（n=3）腦基底節紋狀體神經細胞凋亡情況；余下大鼠均在生后19d行步態分析及橫木行走測試，30d行水迷宮實驗。結果模型組出現明顯神經行為異常，如握拳、角弓反張，且體質量顯著低于對照組（F＞27.707，P＜0.001）。TUNEL染色示模型組基底節紋狀體神經細胞凋亡。步態分析中，模型組左右后肢步長均短于對照組（t＞4.129，P＜0.01），步長差值顯著大于對照組（t=-4.415，P＜0.001），但步寬與對照組無顯著性差異（t=0.462，P=0.649）。橫木行走測試中，模型組得分明顯低于對照組（t=-3.644，P=0.004）。Morris水迷宮實驗中，模型組各時間點逃避潛伏期均長于對照組（F＞6.206，P＜0.05）；穿越平臺次數少于對照組（t=3.297，P=0.004）。結論核黃疸模型大鼠具有多項運動功能異常和學習記憶障礙，可分別使用步態分析、橫木行走測試及水迷宮實驗進行評價。

［關鍵詞］核黃疸；步態分析；橫木行走測試；水迷宮實驗；大鼠

［本文著錄格式］劉祎，肖農，毛振沙.核黃疸模型大鼠腦細胞損傷及行為學后遺癥的研究［J］.中國康復理論與實踐，2016，22 （6）：640-644.

CITED AS：Liu Y，Xiao N，Mao ZS.Brain cell injuries and behavioral changes in rats with kernicterus［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（6）：640-644.

新生兒高膽紅素血癥是全球性疾病，影響60%～80%的新生兒［1］。嚴重的高膽紅素血癥可導致核黃疸，即高膽紅素血癥時，游離膽紅素通過血腦屏障，沉積于基底節、腦干、小腦及海馬等部位造成的腦損傷［2］。核黃疸致死率高，存活率為30%～50%，其中有75%～90%患兒遺留永久神經系統后遺癥［3］，如肌張力障礙的錐體束外運動失調、手足徐動、聽力喪失、智力低下等［2，4］。嚴重的神經系統后遺癥明顯影響患兒日常生活質量，給患者、家庭及社會帶來巨大精神壓力及經濟負擔。目前，國內外膽紅素腦損傷的實驗研究多集中于損傷機制、如何有效預防和減輕損傷程度方面，腦損傷神經系統后遺癥行為學方面的研究較少。

本實驗采用5日齡新生大鼠小腦延髓池注射膽紅素溶液的方法構建核黃疸模型［5］，探討該模型行為學改變情況，以期為今后膽紅素腦損傷神經系統后遺癥運動功能及學習記憶的損傷機制、康復治療療效及方案選擇的研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組

5日齡Sprague-Dawley大鼠25只，雌雄不限，體質量9～14g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（渝）2012-0001。所有動物標準實驗室內飼養，自由進水、進食，24h晝夜交替（12h：12h），室溫（23±2）℃，濕度約60%。采用隨機數字表法將大鼠分為生理鹽水對照組（對照組，n=11）和核黃疸模型組（模型組，n=14）。

建模1d后取模型組大鼠3只腦組織行石蠟切片，TUNEL染色，其余大鼠均放回母鼠籠內飼養至19d行步態分析、橫木行走測試，30d行水迷宮實驗。每項測驗兩組均為11只大鼠，若實驗過程中出現大鼠死亡，則補充至每組11只。

1.2造模

1.2.1膽紅素溶液配置

避光稱取膽紅素（SIGMA）10mg溶于0.5mol/L氫氧化鈉0.1ml中，加入雙蒸水0.9ml，用0.5mol/L鹽酸調至pH 8.5，避光，-20℃放置［6］。

1.2.2模型制作

模型組新生鼠乙醚麻醉，用微量注射器經小腦延髓池處釋放適量腦脊液后注入膽紅素溶液10μg/g；對照組同樣方法注射等量生理鹽水［5］。

1.3觀察神經行為學改變及體質量

根據Rose等［7］及Song等［5］對大鼠膽紅素腦損傷神經行為學改變的描述，觀察兩組大鼠分別在注射膽紅素溶液和生理鹽水后是否出現活動減少、握拳、肌張力障礙、轉圈、俯伏、角弓反張、吃奶困難等神經行為學表現。注射后連續3d按時記錄兩組的體質量。

1.4TUNEL染色

模型組于6日齡（建模后1d，n=3）斷頭取腦，常規固定，脫水包埋，切片，獲取基底節紋狀體石蠟切片后行TUNEL染色（德國ROCHE公司），細胞核呈棕黃色或棕褐色為陽性細胞。

1.5步態分析

參考Chaniary等的步態分析方法［8］評價大鼠的步態參數。有機玻璃盒（100×6×12cm）架高90cm，一側放置一個盒子。透明坐標紙粘附于有機玻璃盒底面。數碼相機（NIKON）放置于有機玻璃盒下方，調節鏡頭使其包含實驗所需的有機玻璃盒底面像。用紅色標記筆在大鼠腹面畫一條矢狀線作為行走方向的參照線，并在雙后足中間指骨處點下標記。實驗前訓練大鼠至可不停頓地通過有機玻璃盒到達另一側的盒子內。錄制每只大鼠至少有3步不停頓的行走視頻，使用Adobe Premiere Pro CS6處理后備用。步態參數如下。①步寬：經過雙后肢中間指骨所作的與行走方向參照線平行的兩線之間的距離。②步長：行走中一側后肢著地時的中間指骨到緊接著的對側后肢著地時的中間指骨之間在參照線方向的距離。③步長差異值：行走中右后肢到左后肢步長（左步長）減去左后肢到右后肢步長（右步長）之差的絕對值。

1.6橫木行走測試

參考Puurunen等的方法［9］，測試裝置由橫木（100×2.5cm，高50cm）及與其一端連接的一個盒子組成。采用0～6分法進行評價。0分：鼠不能站立在平衡木上，掉下。1分：鼠能站立在平衡木上，但不能移動。2分：鼠試圖穿過平衡木，但掉下。3分：鼠能穿過平衡木，受影響后肢腳滑或失足大于50%的步數。4分：鼠能穿過平衡木，受影響后肢腳滑或失足次數大于1次但小于50%的步數。5分：鼠穿過平衡木，后肢腳滑或失足僅出現1次。6分：鼠穿過平衡木無腳滑或失足。

1.7Morris水迷宮實驗

參考Morris的方法［10］，圓形水池分為4個象限，其中1個象限內放置平臺。水池內放水，水平面高于平臺1cm，倒入墨汁使平臺隱藏，水溫維持在（25±1）℃。實驗共7d，第1天為適應期，撤去平臺讓大鼠自由游泳60s以適應環境。第2～6天將平臺重新放置到水池中，記錄大鼠的逃避潛伏期，若大鼠找平臺時間超過60s，引導大鼠游至平臺并停留10s，逃避潛伏期記錄為60s，以上潛伏期數據用于評價定位導航能力。第7天再次撤去平臺，記錄大鼠在迷宮內自由游泳60s過程中穿越平臺位置的次數，以評價空間探索能力。

1.8統計學分析

采用SPSS 17.0統計學軟件分析。水迷宮逃避潛伏期采用重復測量方差分析和多因素方差分析；體質量及體質量增長值采用簡單效應分析；其余數據采用t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1神經行為學改變及體質量情況

2.1.1神經行為學改變

模型組建模后0.5～1h內出現活動減弱、握拳、角弓反張，部分出現俯伏、側臥、轉圈、對外界刺激無反應，4只死亡，予重新建模補充。對照組沒有出現明顯異常的神經行為學改變。

2.1.2體質量

建模后第1天模型組體質量負增長，而對照組體質量顯著增加（F=145.876，P＜0.001），建模后第2天（F=31.779，P＜0.001）及第3天（F=33.594，P＜0.001）模型組體質量逐漸增加，但仍顯著低于對照組。見表1。

表1　兩組大鼠造模前及造模后連續3d體質量情況（kg）

2.2細胞病理變化

模型組斷頭取腦后可見不同程度黃染，無明顯損傷出血；TUNEL染色后光鏡下可見凋亡現象。見圖1。

圖1　模型組基底節紋狀體神經細胞凋亡（光學顯微鏡，400×）

2.3步態分析

模型組左后肢步長和右后肢步長均明顯小于對照組（P＜0.01），左右后肢步長差值顯著大于對照組（P＜0.001），兩組步寬無顯著性差異（P＞0.05）。見表2。

表2　兩組大鼠步態參數（cm）

2.4橫木行走測試

與對照組相比，模型組在通過橫木時，躊躇猶豫，探索行為較多，雙后肢滑落次數明顯增多，部分大鼠在通過途中掉下，有的則不能在橫木上行走甚至站立，測試評分明顯偏低（P＜0.01）。見表3。

表3　兩組大鼠橫木行走實驗得分

2.5Morris水迷宮實驗

2.5.1定位航行能力

兩組大鼠逃避潛伏期隨著訓練時間增加均出現逐漸縮短趨勢。總體上兩組間的逃避潛伏期存在非常高度顯著性差異（P＜0.001）。與對照組相比，模型組各時間點逃避潛伏期均延長（P＜0.05）。見表4。

表4　兩組大鼠逃避潛伏期（s）

2.5.2空間探索能力

與對照組比較，模型組穿越平臺次數明顯減少（P＜0.01）。見表5。

表5　兩組大鼠穿越平臺次數（n）

3　討論

實驗研究發現核黃疸模型鼠出現步態異常，運動協調及整合能力下降，學習記憶障礙。注射膽紅素溶液后模型組出現自主活動減少、握拳、角弓反張、體質量不增甚至下降，與急性膽紅素腦病模型鼠的癥狀［5-7，11］及新生兒急性膽紅素腦病的臨床表現［12-13］相符，且基底節紋狀體細胞凋亡，提示出現膽紅素腦損傷。

研究顯示，膽紅素入腦后主要選擇性沉積于基底節（主要為蒼白球）、丘腦底核、腦干神經核、小腦及海馬［14-16］。蒼白球及丘腦底核是錐體外系系統的主要組成部分，膽紅素損傷后可造成錐體外系病變［16］，導致肌張力障礙、姿勢異常、平衡協調不能、運動異常、手足徐動等表現［17-18］。海馬受損則導致學習記憶障礙。故本實驗采用步態分析、橫木行走測試及水迷宮實驗評價核黃疸鼠的運動功能及學習記憶情況。

步態分析廣泛用于量化評價嚙齒動物模型的運動障礙，如帕金森病［19］、坐骨神經損傷［20］，是一種客觀、精細的評價方法。本實驗發現，與對照組相比，模型組雙后肢步長變短且左右步長差值變大。提示模型組因膽紅素神經毒性導致肌張力障礙，后肢運動協調不能，以致步態異常。以上結果與Chaniary等的研究結果［8］相符。有學者提出步寬增加是機體運動時為了維持平衡與穩定的補償形式［19］，但本實驗中模型組與對照組的步寬無顯著性差異，分析可能是本實驗模型建模時間為大鼠生后第5天，注入膽紅素可明顯影響生長發育而不能顯示出步寬變長的代償模式。因此5日齡大鼠核黃疸模型可出現步態異常，其中步長差異值為評價該模型步態的敏感參數。

橫木行走測試是評價動物運動協調及整合能力的客觀方法［21］。與對照組相比，模型組在行走時出現躊躇、后肢滑步，甚至不能行走或站立，提示膽紅素神經毒性導致模型組運動協調及整合能力受損，該測試結果與步態分析結果相對應。

Morris水迷宮實驗是評價嚙齒動物空間學習和記憶能力的常用方法［22-24］。實驗中，模型組逃避潛伏期明顯長于對照組，且找平臺能力也低于對照組，提示模型組學習能力下降，空間記憶能力受損。

本研究仍存在著一些不足：①樣本量不大，為了達到更小的抽樣誤差在今后實驗中可加大實驗動物的樣本量；②當前應用于嚙齒動物行為學缺陷評價的方法繁多，各有利弊，本研究僅選取其中3種常見的評價方法進行評價；③模型組大鼠出現運動功能受損，但步態分析中的一項參數，即步寬，與對照組相比無顯著性差異。因此下一步的實驗研究可增加其他評價方法以獲得更多核黃疸動物模型的行為學數據，為相關的研究提供更多選擇。

綜上所述，5日齡Sprague-Dawley大鼠核黃疸模型出現步態異常，運動協調及整合能力下降和學習記憶障礙，符合新生兒核黃疸的特征，且可使用步態分析、衡木行走測試及水迷宮實驗分別進行評價。因此該模型可能為今后膽紅素腦損傷神經系統后遺癥運動功能、學習記憶方面的損傷機制及康復治療方法研究奠定基礎。

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Brain Cell Injuries and Behavioral Changes in Rats with Kernicterus

LIU Yi，XIAO Nong，MAO Zhen-sha

1.Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders，Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing，Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development with Disorders，Children's Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China；2.Department of Rehabilitation in Children's Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China

Correspondence to XIAO Nong.E-mail：xiaonongwl@163.com

Abstract：Objective To study the brain cell injuries and behavioral changes of newborn rats with kernicterus.Methods Twenty-five 5-day-old Sprague-Dawley rats were divided into control group（n=11）and model group（n=14）radomly.The model group was injected with bilirubin solution 10μg/g in the cisterna magna，while the control group was injected with equal volume of normal saline.The neurobehavioral changes were observed and the body mass were recorded.TUNEL staining was used to check the apoptosis of striatal nerve cells of basal ganglia in the model group（n=3）on the first day after modeling.The remaining rats were assessed by gait analysis and beam-walking test 19 days after birth，and Morris water maze test was performed 30 days after birth.Results The model group showed apparently abnormal neurobehavioral changes，such as clenched fists，opisthotonos and the body mass were significantly lower in the model group than in the control group（F＞27.707，P＜0.001）.TUNEL staining showed striatal nerve cells apoptosis in the model group.For the gait analysis，the step lengths of both hind legs were shorter（t＞4.129，P＜0.01），and the difference of step length was longer（t=-4.415，P＜0.001）in the model group than in the control group，however，there was no significantly difference in the step width between two groups（t=0.462，P=0.649）.For the beam-walking test，the score was lower in the model group than in the control group（t=-3.644，P=0.004）.For the Morris water maze test，the escape latency was longer（F＞6.206，P＜0.05），and the number of crossing platform was less（t=3.297，P=0.004）in the model group than in the control group.Conclusion The newborn rats' model of kernicterus showed deficits in multiple motor functions and learning and memory ability，which could be assessed by gait analysis，beam-walk test and Morris water maze test，respectively.

Key words：kernicterus；gait analysis；beam-walking test；Morris water maze test；rats

［中圖分類號］R722.1

［文獻標識碼］A

［文章編號］1006-9771（2016）06-0640-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-9771.2016.06.004

基金項目：2014年重慶市研究生科研創新項目（No.CYS14126）。

作者單位：1.重慶醫科大學附屬兒童醫院兒童發育疾病研究教育部重點實驗室，兒科學重慶市重點實驗室，重慶市兒童發育重大疾病診治與預防國際科技合作基地，重慶市400014；2.重慶醫科大學附屬兒童醫院康復科，重慶市400014。

作者簡介：劉祎（1991-），女，漢族，河南駐馬店市人，碩士研究生，主要研究方向：兒科神經康復。通訊作者：肖農（1961-），男，漢族，四川內江市人，碩士，教授，主要研究方向：神經康復。E-mail：xiaonongwl@163.com。

收稿日期：（2015-11-03修回日期：2016-01-25）