miR-181a吸附海綿載體改善肝細胞胰島素抵抗作用研究

西安交通大學醫學院附屬西安市第九醫院內分泌科(西安710054)

牛　瑜　王述進Δ

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miR-181a吸附海綿載體改善肝細胞胰島素抵抗作用研究

西安交通大學醫學院附屬西安市第九醫院內分泌科(西安710054)

牛瑜王述進Δ

摘要目的:構建對肝癌細胞系HepG2中內源性成熟miR-181a具有的抑制作用的特異性吸附海綿載體 (miR-181a-sponge)，驗證其在葡萄糖胺誘導的HepG2細胞胰島素抵抗模型中改善胰島素敏感性的作用。方法:針對成熟人源miR-181a的序列，設計在9-12位發生突變的反義序列，并重復7個拷貝，串聯至pEGFP-C2真核表達載體及pGL3-Promoter載體中，通過雙熒光素酶報告基因系統驗證該吸附海綿的效果；同時在葡萄糖胺誘導的HepG2細胞胰島素抵抗模型中轉染miR-181a吸附海綿載體，檢測細胞對胰島素刺激的應答效果。結果:pEGFP-C2-181a-SP載體可以成功的在細胞中表達，其綠色熒光呈陽性。雙熒光素酶報告基因系統顯示，pEGFP-C2-181a-SP載體可以顯著抑制外源性miR-181amimics的活性(P< 0.05)。Western blot結果顯示轉染pEGFP-C2-181a-SP載體可以改善葡萄糖胺誘導的HepG2胰島素抵抗細胞模型對胰島素的應答。結論:miR-181a吸附海綿載體策略可以成功的誘導吸附miR-181a，構建的pEGFP-C2-181a-SP載體基因顯著增加HepG2細胞的胰島素敏感性，為改善miR-181a導致的肝細胞胰島素抵抗提供了潛在的解決方案，有可能成為2型糖尿病治療的新策略。

主題詞@microRNA-181a吸附海綿載體胰島素抗藥性糖尿病，實驗性肝細胞

2型糖尿病(Type2 diabetesmellitus, T2DM)患者胰島素抵抗發病率超過80%, 胰島素抵抗被認為是引發T2DM的始動因素[1-2]，因此深入探尋代謝器官中胰島素抵抗發生及發展的機制，以尋找潛在的治療策略對突破2型糖尿病的治療瓶頸意義重大。成熟微小RNA(microRNA, miRNA)是一類由20～23個核苷酸組成的內源性非編碼單鏈小RNA，通過與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(3’-untranslated region,3’-UTR)互補結合導致靶基因的降解或抑制靶基因的翻譯,在轉錄后水平調節基因的表達[3]。到目前為止，已發現數種microRNA在肝、骨骼肌和脂肪細胞等胰島素主要效應器官的過表達引起胰島素在靶組織的信號轉導及功能調節的障礙，導致胰島素抵抗[4]。microRNA-181a(miR-181a)是其大家族中的一員。而干涉microRNA的表達及功能已經成為一項成熟技術。我們可人為地改變miRNA 的合成及功能，使機體內異常的miRNA 水平得以糾正，從而緩解胰島素抵抗。microRNA吸附海綿載體是利用microRNA的“種子序列”，通過互補識別使細胞內源性的成熟microRNA結合到該載體上，從而抑制目的microRNA的活性，是目前干涉microRNA廣泛采用的方法。且此法設計操作較便捷，還可將其包裝于病毒內，應用于體內實驗，成本較低。本文采用microRNA吸附海綿策略[5]，構建針對miR-181a的反義吸附片段，串連克隆至真核表達載體pEGFP-C3中，并轉染肝癌細胞系HepG2，探討miR-181a吸附海綿載體對改善肝臟細胞胰島素敏感性的應用。

材料和方法

1細胞與試劑人源肝癌細胞系HepG2 購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，HEK293T細胞為本科室保存。表達載體pEGFP-C3及pGL3-Promoter為本科室留存。胎牛血清及DMEM 培養基購自GIBCO。實時熒光定量檢測試劑盒( SYBR Green )，EcoRI、EcoRⅤ及BamHI核酸內切酶購自TAKARA。逆轉錄酶( Reverse Transcriptase，M-MLV) 、Lipofectamine2000，Trizol，第一鏈cDNA合成試劑盒( TransScriptⅡFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix)購自invitrogen。miRcutemicroRNA cDNA第一鏈合成試劑盒及miRcute microRNA熒光定量檢測試劑盒( SYBR Green )，T4連接酶購自天根。雙熒光素酶報告基因(DLRTM)檢測試劑盒購自Promega公司。miR-181amimics及陰性對照NC-mimic購自上海吉瑪公司。RiPA蛋白裂解液購自碧云天。anti--pAKT(s473)及anti-total AKT一抗購自cell signaling。遠紅外熒光二抗iRDye 800CW goat anti-rabbit IgG(H+L)購自Li-cor公司。

2方法

2.1miR-181a吸附海綿片段的設計：根據miRBase網站所錄has-miR-181a的成熟序列(MiMAT0000256)5’-AACATTCAACGCTGTCGGTGAGT-3’，設計miR-181a的反義序列(miR-181a-AS)，保持其種子序列區嚴格互補配對的同時，將與miR-181a第9～12位對應的堿基突變為“ATC”以防止吸附海綿在細胞的剪切降解，再在兩個反義序列之間加入“GCGC”等富含GC的連接序列，最終構成7個拷貝的吸附海綿(miR-181a-sponge或miR-181a-SP)(圖1)。設計EcoRi酶切位點于該構件的上游，EcoRⅤ及BamHi酶切位點于該構件的下游，以便進行重組質粒的構建，并在EcoRi酶切位點后面加上終止密碼子TAG。通過基因合成的方法，獲得含199bp吸附海綿序列的表達載體pUC57-181a-SP。基因合成由上海生工公司完成。

2.2miR-181a吸附海綿真核表達載體及Luciferase檢測載體構建及細胞轉染：構建pEGFP-C2-181a-SP載體：EcoRi及BamHi雙酶切pUC57-181a-SP及pEGFP-C2空載體，經DNA凝膠電泳，回收215bp小片段及pEGFP-C3雙酶切載體。T4連接酶將兩者4℃過夜連接，連接產物轉化DH5α感受態菌種，涂布于氨芐青霉素抗性LB培養基平板，37℃過夜培養。次日，挑取若干菌落在LB液體培養基中擴增培養，并保存菌種送測序鑒定。構建pGL3-181a-SP載體：EcoRi及EcoRⅤ雙酶切pUC57-181a-SP及pGL3-Promoter載體，該克隆載體制作步驟同上。將HEK293T細胞均勻接種至6孔板中，待細胞融合至80%，按Lipofectamine2000脂質體試劑盒說明書，將構建好的pEGFP-C2-181a-SP載體轉染至細胞內，以pEGFP-C2空載體作對照組。轉染24h后收集細胞，檢測熒光素酶活性。

2.3Luciferase熒光素酶報告基因系統驗證miR-181a吸附海：HEK293T細胞以8∶1的體積比共轉染pEGFP-C2-181a-SP及pGL3-181a-SP，同時轉染pRL-TK內參質粒和miR-181a mimics(100nM每孔)，以pEGFP-C2空載體做對照，各重復3個孔。轉染24h后，用試劑盒提供的被動裂解液裂解細胞并置冰上快速震搖30min；隨后離心，在Promega GLOMA luminometer儀器上檢測熒光素酶活性。

2.4胰島素抵抗細胞模型建立及處理：將HepG2細胞均勻接種至6孔板中，待細胞融合至80%，依前述方法，將構建好的pEGFP-C2-181a-SP載體轉染至細胞內，以pEGFP-C2空載體作對照組。轉染48h后，用含18nmol/L的葡萄糖胺及10%胎牛血清的低糖DMEM培養細胞12h，隨后再用含100 nmol/L胰島素的無血清高糖DMEM處理細胞30min及60min。收集細胞用RiPA蛋白裂解液裂解細胞制備蛋白樣本，用于Western blot檢測。

2.5Western blot檢測：將裂解好的蛋白樣本，按BCA法蛋白定量試劑盒說明書進行總蛋白定量,取40μg蛋白樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳，隨后將凝膠蛋白轉移到硝酸纖維膜(NC)膜上,用兔抗人anti-pAKT及anti-total AKT一抗(1∶800稀釋)4℃孵育過夜、GAPDH蛋白(36KD)作為內參，二抗用iRDye 800CW goat anti-rabbit IgG(H+L)(1∶10000 稀釋)室溫孵育1h，于Odyssey遠紅外掃膜儀成像。

2.6統計學方法：應用SPSS 19.0統計學軟件進行t檢驗，P<0.05認為有統計學意義。

結果

1miR-181a吸附海綿真核表達載體驗證miR-181a吸附海綿作為3’UTR插入pEGFP-C2載體，可以與成熟的miR-181a特異性結合，誘騙吸附細胞內的miR-181a，同時由于其9～12位的突變，可以在結合區形成一個“空泡”，從而逃避細胞內降解機制對該處位點的識別，穩定成熟miR-181a在吸附海綿上的結合(圖1)。測序結果顯示，pEGFP-C2-181a-SP 載體構建成功(圖2)。pEGFP-C2-181a-SP轉染HepG2細胞24h后，于熒光顯微鏡下觀測綠色熒光，以檢驗表達效率(圖3)。

圖1　microRNA吸附海綿結構示意圖(a:pEGFP-C2-181a-SP載體構建策略圖；b:miR-181a 吸附海綿“空泡”突變策略圖)

2雙熒光素酶報告基因系統驗證pEGFP-C2-181a-SP吸附成熟體miR-181a效果為驗證pEGFP-C2-181a-SP吸附miR-181a的效果，我們構建了pGL3-181a-SP 熒光素酶報告基因載體，當與pEGFP-C2-181a-SP共轉染HEK293T細胞時，外源性的miR-181a mimics會被吸附海綿載體誘騙吸附，而無法抑制海腎熒光素酶表達。結果顯示與預期一致,與共轉染pEGFP-C2空載體對比，共轉染pEGFP-C2-181a-SP熒光素酶活性顯著升高(P<0.05，圖4)。

3Western blot檢測pEGFP-C2-181a-SP改善HepG2細胞胰島素敏感性效果在葡萄糖胺誘導胰島素抵抗HepG2細胞中經胰島素處理，Western blot檢測胰島素通路應答Marker即磷酸化的AKT(pAKT)表達變化，結果顯示，轉染pEGFP-C2-181a-SP吸附海綿載體后與對照組相比，pAKT蛋白水平顯著升高，提示胰島素敏感性增強(圖5)。

圖3　pEGFP-C2-181a-SP載體轉染HepG2細胞24h綠色熒光表達

圖4　雙熒光素酶報告基因系統驗證miR-181a-sponge 對miR-181a的吸附作用

圖5　miR-181a-sponge顯著增加pAKT蛋白表達水平

討論

本實驗采用microRNA吸附海綿策略，成功構建了針對miR-181a的吸附海綿載體pEGFP-C2-181a-SP，并在人源HepG2肝癌細胞中表達，且轉染pEGFP-C2-181a-SP載體至葡萄糖胺誘導胰島素抵抗HepG2細胞中24h后，可顯著降低HepG2細胞內源性成熟miR-181a的表達。并通過檢測胰島素通路應答marker即磷酸化的AKT(pAKT)表達變化顯示轉染pEGFP-C2-181a-SP吸附海綿載體后與對照組相比，pAKT蛋白水平顯著升高，提示胰島素敏感性增強。

胰島素抵抗是糖尿病發生發展的關鍵因素，主要指機體對一定量胰島素的生物效應減低。胰島素的主要效應器官是肝、骨骼肌和脂肪細胞，當這些器官對胰島素的敏感性和反應性降低時，即出現胰島素抵抗。microRNAs是葡萄糖動態平衡的調節器。研究表明，miRNAs直接調控胰島素分泌、胰島發育、胰島B細胞分化，間接調控葡萄糖和脂類代謝[4]。miR-181家族包括miR-18a、miR-181b、miR-181c和miR-181d。在以往的研究中多關注miR-181a在細胞的增殖、發育和分化過程中起著重要的調控作用。而近年來在機體能量代謝異常組織中發現miR-181a呈異常高表達，提示其在代謝性疾病中的重要作用[6]。miR-181a可以通過直接作用于異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)的3'UTR，抑制其表達，從而抑制高脂飲食小鼠的脂質及固醇合成，促進脂肪酸氧化[7]。此外有研究發現，在db/db2型糖尿病小鼠模型中，miR-181a呈高表達，提示其可能參與了機體的胰島素應答[8]。我們的實驗發現吸附海綿載體pEGFP-C2-181a-SP可以與成熟的miR-181a特異性結合，抑制其在肝細胞表達，增強了胰島素敏感性，表明miR-181a在肝細胞的胰島素應答中有重要作用，而肝細胞是胰島素抵抗的主要效應器官。

干涉microRNA的表達及功能已經成為一項成熟技術。我們可人為地改變miRNA 的合成及功能，使機體內異常的miRNA 水平得以糾正，從而改善患者的胰島功能，緩解胰島素抵抗。microRNA的干涉是研究某一目的microRNA生理功能的主要手段，目前針對microRNA的干涉主要有三種辦法，即基因敲除，針對目的microRNA的化學修飾反義寡核苷酸抑制劑以及microRNA吸附海綿載體[5]。其中，基因敲除是唯一完全抑制目的microRNA活性的方法，但此法耗時且成本大；而化學修飾反義寡核苷酸抑制劑則有良好的特異性，但其作用發揮需依賴轉染手段，對于難轉染的細胞其作用有限，尤其是在體內實驗中用量大且成本較高。microRNA吸附海綿載體則是利用microRNA的“種子序列”，通過互補識別使細胞內源性的成熟microRNA結合到該載體上，從而抑制目的microRNA的活性。此法設計操作較便捷，還可將其包裝于病毒內，應用于體內實驗，成本較低。我們的實驗成功構建了針對microRNA-181a的吸附海綿載體pEGFP-C2-181a-SP，該miR-181a吸附海綿亦可顯著抑制外源性miR-181a mimics的活性，進一步證明此吸附海綿對miR-181a的特異性誘騙吸附能力。且該miR-181a吸附海綿片段還可克隆入慢病毒載體中，有望實現在細胞內對miR-181a的穩定長期抑制效果。

miRNA對糖尿病的作用機制復雜, 目前仍有很多問題需要探討。最近關于miRNA拮抗劑在體內結合miRNA的研究已成為目前miRNA研究的熱點, 本文構建的吸附海綿載體pEGFP-C2-181a-SP作為miR-181a的拮抗劑在2型糖尿病中進一步研究miR-181a的功能奠定了基礎，其可能為糖尿病及其并發癥提供新的治療方法。

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(收稿:2015-10-15)

通訊作者△

【中圖分類號】R392.6

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.04