大葉山楝拮抗內生真菌DYSJ3的鑒定及抑菌活性產物分析

吳亞騰++吳曼莉++柳志強

摘要：從大葉山楝體內分離得到1株內生真菌DYSJ3，發現其對香蕉炭疽病菌、橡膠炭疽病菌、香蕉枯萎病菌和芒果炭疽病菌具有較強的拮抗作用，皿內抑制率分別為61.9%、57.9%、55.3%和65.9%。通過形態學觀察結合ITS序列分析，初步將菌株DYSJ3鑒定為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。對菌株DYSJ3產生的抑菌活性物質進行了初步分析，發現菌株DYSJ3的抑菌活性物質集中于菌絲體中，其菌絲體乙酸乙酯浸提物對多種植物病原真菌具有較強的抑菌活性，且熱穩定性較好，100 μg/mL浸提物對香蕉炭疽病菌及蘋果輪紋病菌具有明顯抑制活性，抑制率分別為 72.7% 和62.0%。當濃度為1 000 μg/mL時，浸提物對香蕉炭疽病菌、蘋果輪紋病菌、黃瓜枯萎病菌、橡膠炭疽病菌、小麥赤霉病菌的抑制率均大于90%。

關鍵詞：大葉山楝；內生真菌；雜色曲霉；抑菌活性

中圖分類號： S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0181-03

大葉山楝（Aphanamixis grandifolia）為楝科（Meliaceae）山楝屬（Aphanamixis） 植物，主要分布于廣東、廣西、云南、海南等低海拔至中海拔山地溝谷密林或疏林地區，是一種傳統的中藥。《新華本草綱要》記載大葉山楝的根及葉具有祛風除濕、舒筋活絡及通痹等功效，為祛風止痛藥。據文獻報道，大葉山楝中主要含有倍半萜、二萜、三萜等萜類成分和甾體等，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等活性[1-3]。Zeng等從大葉山楝中分離到四環三萜、倍半萜、木脂素、苯丙素、二肽類等化合物，并選出多個具有腫瘤細胞抑制活性的單體化合物[4]；黃淼等從大葉山楝根分離得到9 個化合物，發現多個化合物對慢性髓原白血病細胞K562和人胃癌細胞SGC-7901有生長抑制活性[5]。然而，目前關于大葉山楝內生真菌的研究鮮有報道。本研究從大葉山楝體內分離出1株內生真菌DYSJ3，發現其對多種植物病原菌具有較好的拮抗活性，通過形態觀察結合ITS序列分析對該菌株進行鑒定，并對其產生的抗菌活性物質進行初步分析。

1材料與方法

1.1菌株

內生真菌DYSJ3從大葉山楝中經組織表面消毒分離獲得。

供試真菌：香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum sp. cubense）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum sp. cucumerinum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、橡膠炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria berengriana sp. piricola）由海南大學環境與植物保護學院提供。

1.2培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水 1 000 mL。

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL。

CM培養基：胰化蛋白胨6 g，酵母提取物6 g，蔗糖10 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3菌種活化及平板拮抗試驗

將內生真菌DYSJ3及植物病原真菌接種于PDA平板上，28 ℃培養5～7 d活化待用。用5 mm打孔器在培養5～7 d的供試內生真菌、病原真菌平板的菌落邊緣取菌餅，將病原真菌置于PDA平板中央，菌株DYSJ3置于平板邊緣，以只接種病原真菌的PDA平板為對照，每個處理3個重復，28 ℃培養5～7 d，測量菌落半徑（mm），計算抑菌率。抑菌率=（對照組菌落半徑-處理組菌落半徑）/對照組菌落半徑×100%。

1.4菌株DYSJ3鑒定

將菌株DYSJ3接種于PDA培養基上，28 ℃培養3～7 d，從第3天開始每天挑取少量菌絲于載玻片上，在顯微鏡下觀察氣生菌絲、分生孢子等，拍照并描述特征。

菌株基因組DNA提取采用CTAB法[6]，利用ITS通用引物（ITS 1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增。 PCR反應體系為：10×buffer 2.5 μL，Taq酶0.25 μL，dNTPs 2 μL，ITS 1 0.5 μL，ITS 4 0.5 μL，dH2O 18.25 μL，模板1 μL，總體積 25 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸 30 min。將所得產物用純化試劑盒回收，連接到pMD18-T Vector，由上海英駿生物技術有限公司進行序列測定，將所測序列在GenBank 中（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行Blast分析。用Clustal X （1.83） 軟件進行多序列比對（Multiple alignments），利用MEGA 5.0軟件以鄰近相接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹。

1.5菌株DYSJ3粗提物的制備及活性測定

菌株DYSJ3活化后，接種于5 L的PDA液體培養基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養7 d，室溫避光靜置21 d。將菌絲體和發酵液用8層紗布過濾分離，充分洗凈菌絲體。發酵液濃縮為浸膏后備用。菌絲體用95%乙醇浸泡后超聲破碎1 h，再用8層紗布過濾獲得乙醇浸出液，濃縮為浸膏后備用。

配制香蕉炭疽菌的孢子懸浮液（1×107 CFU/mL），混入PDA 平板中，制備帶菌平板。將獲得的發酵液及菌絲體浸膏用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇進行浸提，獲得各溶劑層浸膏，丙酮溶解，利用牛津杯法檢測其拮抗活性[7]。

1.6菌株DYSJ3粗提物熱穩定性及抗菌譜測定

熱穩定性試驗：使用香蕉炭疽病菌制備帶菌平板，將DYSJ3粗提物置于120 ℃處理1 h，利用牛津杯法檢測其活性。

抗菌譜測定：將DYSJ3菌絲體乙酸乙酯粗提物用丙酮完全溶解后混入PDA培養基，制成濃度分別為100、500、1 000 μg/mL 的平板，以加丙酮PDA平板為對照組。用直徑5 mm打孔器在供試病原菌菌落邊緣取菌餅接于平板中央，每處理3個重復，28 ℃培養3～7 d，十字交叉法測量所有處理菌落生長直徑（mm），按如下公式計算菌絲生長抑制率[8]：

菌絲生長抑制率=[（對照菌落直徑-5）-（處理菌落直徑-5）]/（對照菌落直徑-5）×100%。

2結果與分析

2.1菌株DYSJ3皿內拮抗活性

利用對峙生長法測試了菌株DYSJ3對4種植物病原真菌的皿內拮抗活性，結果見表1、圖1，內生真菌DYSJ3對香蕉炭疽病菌、橡膠炭疽病菌、香蕉枯萎病菌和芒果炭疽病菌具有明顯的拮抗作用，皿內抑制率均大于50%。

表1菌株DYSJ3對4種植物病原真菌的皿內抑制率

供試病原真菌抑菌率（%）香蕉炭疽病菌61.9橡膠炭疽病菌57.9香蕉枯萎病菌55.3芒果炭疽病菌65.9

2.2菌株DYSJ3鑒定

菌株DYSJ3在PDA培養基上生長緩慢，培養14 d直徑 3～6 cm，菌落呈不規則圓形、緊密，培養基正面顏色有數環，從青綠到紅綠，背面顏色有青黃、紅褐色等。分生孢子頭的頂囊近球形，頂囊著生小梗，小梗有單層、雙層、單雙層同時生在1個頂囊上，頂端有鏈形孢子、近球形孢子，無色（圖2）。對菌株DYSJ3的ITS序列進行PCR擴增，測序得到 598 bp 的堿基序列。將得到的ITS序列進行Blast分析，發現其與雜色曲霉的親緣關系最近，相似度達到100%。選取多株曲霉屬菌株與DYSJ3的ITS序列，利用MEGA 5.0構建系統發育樹（圖3），DYSJ3在系統進化樹中與Aspergillus versicolor在同一分支上，結合形態學特征初步將DYSJ3鑒定為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。

2.3菌株DYSJ3粗提物制備及活性分析

利用牛津杯法測試了菌株DYSJ3發酵液及菌絲體粗提物對香蕉炭疽病菌的拮抗作用，結果發現DYSJ3發酵液粗提物對病原菌無拮抗作用，菌絲體乙酸乙酯浸提物具有明顯的拮抗活性（圖4-A）。由此可見，菌株DYSJ3的抑菌活性物質集中于菌絲體中。將菌絲體乙酸乙酯浸提物置于120 ℃處理1 h后測試拮抗活性，抑菌圈與對照組相比無顯著變化（圖4-B），可見菌株DYSJ3產生的抑菌活性物質具有較好的熱穩定性。

將菌株DYSJ3菌絲體乙酸乙酯浸提物配制成不同濃度（100、500、1 000 μg/mL），測試了其對6種植物病原菌的拮抗活性，結果見表2、圖5。菌絲體乙酸乙酯浸提物在1 000 μg/mL 濃度時對香蕉炭疽病菌、蘋果輪紋病菌、黃瓜枯萎病菌、橡膠炭疽病菌、小麥赤霉病菌抑制率均大于90%，對香蕉炭疽病菌及蘋果輪紋病菌菌絲抑制明顯，500 μg/mL濃度下抑制率分別達到93.5%和87.3%。

3討論

從微生物次生代謝產物中篩選抗生素是新藥開發的一個重要途徑，隨著近年來對新型抗生素需求的增加，植物內生菌次生代謝產物的研究受到了廣泛的關注。藥用植物內生真菌多樣性十分豐富，由于特殊的生存環境，藥物植物內生真菌在生長和代謝過程中可以產生各種具有特殊化學結構類型和特殊生理功能的活性物質，這是研究開發農藥先導化合物珍貴的原料寶庫。

本研究對分離自藥用植物大葉山楝內生真菌DYSJ3進行了鑒定，初步鑒定為曲霉屬雜色曲霉。目前有關雜色曲霉次生代謝產物的研究有部分報道，董世豪等從相似蜂海綿分離到1株海洋真菌雜色曲霉F62，從中分離得到了6 個化合物，分別為Alantrypinone、洛伐他汀、甲酯型莫納克林K、土曲霉酮、土震素B和麥角甾醇，其中土曲霉酮具有體外抗炎活性[9]；鞏婷等從海洋真菌雜色曲霉 F62 中分離得到6個丁內酯類化合物，其中丁內酯Ⅰ表現出較強的抗炎活性[10]；趙彩桂從雜色曲霉中分離鑒定了22個化合物，主要為沒藥烷型倍半萜、二苯醚類化合物、生物堿和甾體[11]；王香粉從海洋真菌雜色曲霉菌發酵液中分離純化得到 7 個化合物，包括 5-methylbenzene-1，3-diol、吡咯并哌嗪-1，4-二酮、3-（hydroxymethyl）cyclopentanol、3-異丙基-吡咯并哌嗪 2，5-二酮、6-甲氧基柄曲菌素等[12]。然而，目前尚未有將雜色曲霉用于植物真菌病害防治的研究。本研究發現菌株DYSJ3菌絲體乙酸乙酯浸提物對6種植物病原真菌具有較強的抑制能力，具有廣譜抗菌性，熱穩定性較好，具有開發的潛力。本研究為下一步進行菌株DYSJ3抑菌活性物質的分離、鑒定及應用奠定了良好的基礎。

參考文獻：

[1]Wu H F，Zhang X P，Wang Y，et al. Four new diterpenes from Aphanamixis polystachya[J]. Fitoterapia，2013，90：126-131.

[2]Triana J，Luis E J，Jose O J，et al. Chemotaxonomy of gonospermum and related genera[J]. Phytochemistry，2010，71（5/6）：627-634.

[3]Goncalves O，Pereira R，Goncalves F，et al. Evaluation of the mutagenicity of sesquiterpenic compounds and their influence on the susceptibility towards antibiotics of two clinically relevant bacterial strains[J]. Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis，2011，723（1）：18-25.

[4]Zeng Q，Guan B，Qin J J，et al. 2，3-Seco-and 3，4-seco-tirucallane triterpenoid derivatives from the stems of Aphanamixis grandifolia Blume[J]. Phytochemistry，2012，80：148-155.

[5]黃淼，梅文莉，蔡彩虹，等. 大葉山楝根化學成分與細胞毒活性的研究[J]. 熱帶亞熱帶植物學報，2015，23（3）：329-333.

[6]易潤華，朱西儒，周而勛. 簡化CTAB法快速微量提取絲狀真菌DNA[J]. 湛江海洋大學學報，2003，23（6）：72-73.

[7]劉冬梅，李理，楊曉泉，等. 用牛津杯法測定益生菌的抑菌活力[J]. 食品研究與開發，2006，27（3）：110-111.

[8]檀根甲，祝建平. 殺菌劑生物測定計算方法及應用[J]. 安徽農學通報，1998，4（1）：28-29.

[9]董世豪，鞏婷，朱平. 相似蜂海綿相關真菌雜色曲霉F62活性代謝產物研究[J]. 菌物學報，2011，30（4）：636-643.

[10]鞏婷，董世豪，朱平. 海洋真菌雜色曲霉F62丁內酯類化合物研究[J]. 菌物學報，2014，33（3）：706-712.

[11]趙彩桂. 山楝、棒孢擬盤多毛孢和雜色曲霉化學成分研究[D]. 蘭州：蘭州大學，2014：65-79.

[12]王香粉. 五花血藤和海洋真菌雜色曲霉化學成分的研究[D]. 保定：河北大學，2014：55-56.劉健，張德詠，張松柏，等. 湖南和福建辣椒上辣椒脈斑駁病毒的檢測及系統發育分析[J]. 江蘇農業科學，2016，44（5）：184-185.