夾尾刺激影響大鼠心血管活動的心理生理學觀察

汪　俊，呂　桃，傅雨晨，姜天儀，鄭蒙蒙，王邦安，汪萌芽

(皖南醫學院　1.細胞電生理研究室；2.啟明星小組，安徽　蕪湖　241002)

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·基礎醫學·

夾尾刺激影響大鼠心血管活動的心理生理學觀察

汪俊1,2，呂桃1,2，傅雨晨1,2，姜天儀1,2，鄭蒙蒙1,2，王邦安1，汪萌芽1

(皖南醫學院1.細胞電生理研究室；2.啟明星小組，安徽蕪湖241002)

【摘要】目的：建立檢測夾尾刺激影響大鼠心血管活動的心理生理學同步記錄技術，為相關應激性心血管疾病的研究和防治提供基礎性實驗資料。方法：取成年雄性SD大鼠20只，經腹腔注射烏拉坦麻醉后，進行痛情緒相關核團基底外側杏仁核 (basolateral amygdala,BLA) 和心血管中樞頭端延髓腹外側區 (rostral ventrolateral medulla,RVLM) 電活動的同步記錄，同時監測心電、呼吸肌肌電、皮膚電導、體溫等生理指標，并對夾尾刺激引起的反應進行初步分析。結果：夾尾刺激提高了BLA和RVLM的放電頻率 (n=20)、心率、心率變異性 (heart rate variability,HRV) 之LF/HF的比值，以及呼吸頻率和呼吸肌肌電幅值 (n=16,配對t檢驗,P<0.01),但皮膚電導和體溫的變化沒有統計學意義。結論：夾尾刺激對心血管活動的影響可能涉及腦內痛情緒相關核團BLA和心血管中樞RVLM的參與。

【關鍵詞】基底外側杏仁核；心血管中樞；心率變異性；痛覺；心理生理學

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.03.001

在生物-心理-社會醫學模式的視角下，對傷害性應激的生理與心理相結合研究越來越受到重視。傷害性刺激會引發心血管功能的變化，其變化可能與痛感覺、痛情緒和痛反應相關[1-2]。痛感覺指因傷害性或潛在的傷害性刺激導致的主觀感受[3]，痛情緒主要表現為厭惡、恐懼、焦慮、憤怒、抑郁等[4]，痛反應是指在疼痛過程中伴有的機體反應、自主神經反應和情緒反應等[2-3]。心血管中樞頭端延髓腹外側區 (RVLM) 作為降壓反射的關鍵核團[5-7]，是各級心血管中樞調節交感心血管活動的必經之路[6]，其內部存在眾多傷害性調制神經元[8]，可能參與傷害性應激等引起血壓升高的調節。基底外側杏仁核 (BLA) 是痛情緒調控的關鍵核團，其內部的傷害特異性神經元 (nociceptive specific neurons) 對傷害性刺激表現為興奮且放電頻率增加，并成為恐懼形成和表達的關鍵中樞[9-12]。RVLM和BLA有往返的直接聯系,RVLM很可能與BLA形成了一個與傷害性應激調節相關的環路[13]。本實驗基于心理與生理活動相聯系的觀點，運用了腦內雙核團和外周生理指標同步記錄技術，記錄了BLA (代表痛情緒活動)、RVLM (代表心血管中樞)、心電、呼吸肌肌電、皮膚電導、體溫等6項指標，對夾尾刺激影響大鼠心血管活動進行心理生理學觀察，為進一步的研究提供基礎的實驗資料。

1材料和方法

1.1動物成年Sprague-Dawley (SD) 大鼠20只 (購自南京青龍山動物繁殖場)，雄性，體質量280～350 g。

1.2儀器PowerLab 8/30多通道生理信號采集系統及其Chart Pro分析軟件 (PowerLab System,AD Instruments,Australia)。微電極放大器、同芯不銹鋼電極、金屬參考電極。電生理屏蔽罩、防震臺、體視手術顯微鏡。腦立體定位儀和保溫毯系統 (上海奧爾科特生物科技有限公司)。

1.3多通道生理信號記錄方法

1.3.1動物準備用20%烏拉坦對大鼠進行麻醉 (1.5 g/kg,i.p.)， 直至睫毛反射消失。麻醉穩定后進行頭部備皮，并俯臥位固定在腦立體定位儀上，保溫毯溫度為37.0 ℃，腦立體定位儀置于充氣防震臺上。

1.3.24項生理指標的同步記錄[1,14]體溫信號由置于大鼠肛門內的體溫換能器探頭采集。標準肢體Ⅱ導聯心電圖信號由插入大鼠右前肢腕關節上部、左后肢踝關節上部皮下的兩根針式記錄電極引導，右后肢接地。呼吸肌肌電信號，由插入大鼠右側腋中線第9肋下緣肋間外肌內的兩根針式電極引導。皮膚電導則由固定于大鼠左前肢掌面和背面的兩塊板式電極引導。

1.3.3RVLM和BLA的細胞外同步記錄[1,14]調節兩側耳桿左右對稱，固定大鼠頭部。徹底分離頭部皮膚、軟組織及骨膜,用3%雙氧水擦拭直至暴露顱骨前后囟，上下移動門齒桿使大鼠顱骨的前后囟處于同一水平面。頭端延髓腹外側區(RVLM) 定位參數為AP：-12.48～-12.00 mm；R：1.95～2.65 mm；DV：9.75～10.70 mm。基底外側杏仁核 (BLA) 定位參數為AP：-3.36～-1.56 mm；L：3.90～4.60 mm；DV：7.80～8.82 mm[15]。用牙科鉆鉆顱開窗，在手術顯微鏡下用玻璃探針挑開硬腦膜、蛛網膜，止血。將同芯不銹鋼電極下移至顱窗處，緊貼腦組織，用2%生理鹽水瓊脂封窗。插入頭皮安置參考電極和接地電極，并將記錄電極 (內芯極) 接入放大、記錄系統。操縱記錄電極至定位核團后，微調尋找穩定的細胞外放電信號。同步觀察RVLM、BLA及4項生理指標信號，記錄基礎數據15 min。

1.3.4夾尾刺激[1,16]使用充分絕緣的有齒鑷子夾持大鼠尾巴中末1/3處。以后肢抽動為宜，持續5s，持續同步觀察并記錄45 min，存盤。

1.3.5信號采集參數設置[1,14]4項外周生理指標的參數設置：體溫為低通10 Hz，心電為低通200 Hz、高通10 Hz，呼吸肌肌電為低通200 Hz、高通0.1 Hz，數字濾波為100 Hz，皮膚電導的量程為10 μS。BLA、RVLM記錄參數設置：采樣頻率為4 kHz，BLA、RVLM電信號為低通2 kHz、高通10 Hz。

1.3.6記錄位點鑒定實驗結束后，斷頭處死大鼠并取腦，置于4%福爾馬林溶液(國藥集團化學試劑有限公司) 內固定數日后做冰凍切片，觀察針道位置，對記錄位點進行觀察鑒定。

1.4記錄信號分析使用Chart Pro軟件進行各指標的分析和測量。腦內RVLM和BLA電活動進行放電頻率直方圖分析，幅值為選定時間內檢測的信號幅度最大值減去最小值，即信號的最大振幅值；心率用心電測量功能，呼吸頻率則用直接計數法進行統計。心率變異性 (HRV) 之低頻/高頻 (LF/HF) 亦利用Chart Pro軟件進行短程頻域分析[17]。

2結果

2.1RVLM與BLA的基礎放電特性對20只雄性SD大鼠進行基底外側杏仁核 (BLA) 和頭端延髓腹外側區 (RVLM) 電活動的同步記錄，同時監測心電、呼吸肌肌電、皮膚電導、體溫4項生理指標。取穩定記錄的RVLM與BLA電信號各20 min，用Chart Pro軟件測出平均放電頻率作為放電頻率值 (圖1)，比較結果顯示RVLM的放電頻率 (6.032±0.972) Hz顯著性高于BLA的放電頻率 (1.064±0.418) Hz [差值(4.968±0.988)Hz,t=22.489,P<0.01]，提示RVLM的基礎放電頻率與BLA的基礎放電頻率不同。

圖1RVLM和BLA同步記錄的基礎放電頻率 (Bin=1 s)

2.2夾尾刺激誘發的反應

2.2.1夾尾刺激對RVLM和BLA放電頻率的影響對20只給予夾尾刺激的大鼠進行RVLM、BLA放電頻率直方圖分析，顯示刺激誘發RVLM、BLA放電頻率升高的反應 (圖2上)，分別取夾尾刺激前2 min、夾尾刺激誘發反應時、反應后的放電頻率進行統計學分析，結果RVLM、BLA在反應時比刺激前放電頻率都有顯著性升高[RVLM:差值(1.265±1.014)Hz,t=5.582,P<0.01; BLA:差值(1.679±1.314)Hz,t=5.715,P<0.01]，反應后恢復[RVLM:差值(-1.409±1.309)Hz,t=4.814,P<0.01; BLA:差值(-1.610±1.260)Hz,t=5.718,P<0.01] (圖2下)。提示夾尾刺激誘發RVLM和BLA放電頻率的升高。

**P<0.01。

圖2夾尾刺激對RVLM和BLA放電頻率的影響 (Bin=1 s)

2.2.2夾尾刺激對外周生理指標的影響對其中16只大鼠夾尾刺激前、刺激時和刺激后的生理指標數據進行統計學分析，表明夾尾刺激時心率比刺激前升高 [差值(15.00±13.33)bpm,t=4.502,P<0.01]，且刺激結束后心率仍持續升高 [差值(11.88±6.09)bpm,t=7.804,P<0.01]，但心電圖R波幅值在刺激時并未改變，而在刺激結束后降低 [差值(-57.550±49.019) μV,t=4.696,P<0.01，圖3]；夾尾刺激后心率變異性 (HRV) 之LF/HF比值較刺激前升高 (差值1.167±1.553,t=3.007,P<0.01，圖4)；夾尾刺激時呼吸頻率比刺激前升高 [差值(13.44±7.66)bpm,t=7.018,P<0.01],刺激結束后逐漸恢復 [差值(-14.31±6.85)bpm,t=8.360,P<0.01]，但刺激時肌電幅值無明顯變化，而在刺激結束后升高[差值(61.888±27.539)μV,t=8.989,P<0.01，圖5]。夾尾刺激對體溫、皮膚電導的影響無統計學意義。提示夾尾刺激可明顯改變心血管活動、呼吸功能以及自主神經的活動。

圖3夾尾刺激對心率 (A)、R波幅值 (B) 的影響

圖4夾尾刺激對心率變異性的影響

3討論

本研究基于心理活動與生理活動相聯系的視角，應用腦內雙核團和外周生理指標同步記錄技術[1,14]，同步記錄了RVLM、BLA的電活動，以及心電、呼吸肌肌電、體溫、皮膚電導4項生理指標，用于評估夾尾刺激 (傷害性刺激) 及其所致痛情緒活動可能對心血管活動的影響。實驗中以RVLM為心血管功能調控中樞的代表性核團，以BLA為痛情緒活動的代表性核團[1]，與外周心血管功能等生理指標相結合進行分析，是一種可行的綜合性心理生理學研究方法[1,14]。

本研究首先要觀察的是夾尾刺激導致心血管活動的改變與痛覺特別是痛情緒的關聯性。本實驗中以BLA放電頻率變化作為大鼠對傷害性刺激產生痛情緒反應的代表性指標[1]，以RVLM放電頻率變化代表其生理方面特別是心血管調控方面的變化，以HRV分析代表自主神經對心功能的調控變化，以心率等代表心血管活動的變化，初步結果表明夾尾刺激 (傷害性刺激) 不僅激活了BLA和RVLM，也改變了HRV之LF/HF比值、心率以及呼吸頻率。由于夾尾刺激可引發痛情緒活動[1]，提示在夾尾刺激 (傷害性刺激) 引起心血管活動變化的過程中，可能存在生理性和心理性反應機制。其生理性反應可能是夾尾刺激激活RVLM，引發了RVLM對心血管活動的調控改變以及外周生理指標特別是心血管功能指標的變化。其心理性反應過程則可能與夾尾刺激激活BLA有關，本實驗中觀察到BLA放電頻率的顯著性升高，可能與痛情緒反應的產生有關[1]，基于單純的情緒活動即可影響自主神經功能，進而影響心血管功能的心理生理學原理，以BLA激活為代表的痛情緒活動也可能影響RVLM的活動，參與引發實驗中觀察到的RVLM放電頻率升高，這是不能排除的心理性反應機制之一。不過，BLA激活與RVLM電活動的關聯性，其他生理或心理生理機制的參與，都有待進一步的研究。

n=16,配對t檢驗:**P<0.01。

圖5夾尾刺激對呼吸頻率 (A)、肌電幅值 (B) 的影響

有關實驗中對HRV的分析，在于HRV之LF/HF比值可以定量描述交感神經和迷走神經的平衡性[18-19]，是評價夾尾刺激前后自主神經活動變化的重要指標。本研究的夾尾刺激實驗中，既觀察到RVLM放電頻率和心率變化，同時又觀察到夾尾刺激后HRV之LF/HF比值顯著性升高，可能為RVLM放電頻率的改變與心血管活動的變化之間提供了相關性支持。另外，已有文獻報道高頻恒流刺激BLA會引發心律失常[20]，主要類型為心動過緩伴室性或結性期外收縮，也為本文提出傷害性刺激影響心血管功能可能涉及心理生理機制提供了佐證，但其具體通路和機制仍需要進一步研究來闡明。

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Psychophysiological observation on the cardiovascular responses in rats induced by tail pinch

WANG Jun,Lü Tao,FU Yuchen,JIANG Tianyi,ZHENG Mengmeng,WANG Bang′an,WANG Mengya

Cell Electrophysiology Laboratory,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

【Abstract】Objective：To develop a psychophysiological technique for synchronous recording of the cardiovascular activities in rats induced by tail pinch stimulus in order to supply basic experimental data in research and prevention of the cardiovascular diseases associated with stressful activating stimulus.Methods:Twenty adult male Sprague Dawley rats were obtained and anesthetized via intraperitoneal injection of urethane to observe the activities in pain emotion-related basolateral amygdala (BLA) and cardiovascular center rostral ventrolateral medulla (RVLM) by extracellular recordings,and a polygraph was used to synchronously monitor electrocardiograph (ECG),electromyograph (EMG) of breath muscles,skin conductance and body temperature.The response during tail pinch test was preliminarily analyzed.Results:Tail pinch not only increased the discharge frequency of BLA and RVLM (n=20),heart rate and the LF/HF ratio in heart rate variability (HRV),but also the respiratory frequency and EMG amplitude after tail pinch (n=16,paired t test,P<0.01),yet there was no statistical significance in changes of skin conductance and body temperature.Conclusion:Cardiovascular responses in rats induced by tail pinch may involve a psychophysiological mechanism,including activation of pain emotion-related BLA and cardiovascular center RVLM.

【Key words】basolateral amygdale; rostral ventrolateral medulla; heart rate variability; pain; psychophysiology

文章編號：1002-0217(2016)03-0205-05

基金項目：國家自然科學基金項目 (31271155)；安徽省大學生創新創業訓練計劃項目 (Ap01410368058)；皖南醫學院人文與管理學院大學生科研培育基金項目 (RG201438)。本文獲第六屆“挑戰杯·中國聯通”安徽省大學生課外學術科技作品競賽二等獎。

收稿日期：2015-09-09

作者簡介：汪俊(1992-)，男，2012級臨床醫學專業本科生，(電話) 18375321526，(電子信箱) 534507645@qq.com；

【文獻標識碼】【中圖號】R 338A

汪萌芽，男，教授，博士，碩士生導師，(電子信箱)wangmy@wnmc.edu.cn，通訊作者.